（植物学专业论文）碳纳米管对拟南芥的效应.pdf

c l a s s i f i e dl n d e x ： u d o ： s o u t h w e s tu niv e r sit y 一一 - o f s cie n c ea n die c h n oio g y m a s t e rd e g r e et h e sis ( 6486 e f f e c tso fsin giew aiie dc arb o n n a n o t u b e so nt h ea r a b i d o p s i st h a i a n a g r a d e ： c a n d i d a t e ： a c a d e m i cd e g r e ea p p ii e df o r ： s p e c i a ii t y ： s u p e r v is o r ： 2 0 0 7 h e n g g u a n gy u a n m a s t e rd e g r e e b o t a n y p r o f s h a n g ii a nh u a p r ii 13 2 0 10 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 日期：卅口够哆 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名： 导师签名：e 吣易墨e l 期：厶，。肇i 叩 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 本试验首先用酸化和超声过滤结合法来对单壁碳纳米管进行纯化处 理。通过土培法种植拟南芥，运用酶解法提取出拟南芥叶肉原生质体， 将纯化好的浓度为5 0k t g m l 的单壁碳纳米管放入原生质体中进行培养4 8 h 。原生质体用t e m 、光学显微镜观察，部分原生质体用碘化丙啶和4 ， 6 二氨基2 苯基吲哚双染法在荧光显微镜下检测。将单壁碳纳米管与叶 肉细胞相互作用2h ，通过透射电子显微镜来检测碳纳米管所在细胞内的 位置，分析碳纳米管对植物细胞的作用机制。同时，用浓酸氧化法来将 纯化好的单壁碳纳米管一部分进行氧化修饰，使得碳纳米管的带有亲水 性的羧基。用含有浓度为6 2 5i _ t g m l 、1 2 5i - t g m l 、2 5i - t g m l 和5 0l a g m l 单壁碳纳米管的1 2m s 液体培养基对拟南芥幼苗进行液体培养，用扫描 电子显微镜对叶片进行检测，测量不同浓度处理的拟南芥叶片的电导率。 测得用含有浓度为6 2 5l a g m l 、1 2 5i t g m l 、2 5i _ t g m l 和5 0l a g m l 单壁碳 纳米管的1 2m s 固体培养基所培养的拟南芥种子的萌发率，并测得含有 不同浓度的固体培养基在第l0 天、l5 天、2 0 天、2 5 天所培养的拟南芥 叶片保护酶( s o d 、p o d ) 活性。 结果证明纯化后的单壁碳纳米管可以通过拟南芥细胞壁和细胞膜进 入细胞内，作用在叶绿体、液泡上，对原生质体展示出毒性影响，能够 诱导原生质体产生形变并发生死亡。在加入碳纳米管的液体培养基中， 拟南芥叶表皮毛竖立并增加。单壁碳纳米管使得叶片颜色发生变化，叶 片相对电导率也随着单壁碳管浓度的增加而增大。含有不同浓度单壁碳 纳米管的固体培养基均能促进拟南芥种子萌发，拟南芥种子的萌发率与 单壁碳纳米管形成剂量关系。含有单壁碳纳米管的固体培养基对拟南芥 叶片的保护酶( s o d 、p o d ) 产生明显的影响。 关键词：拟南芥叶肉细胞原生质体单壁碳纳米管细胞毒性 作用机制 西南科技大学硕士研究生学位论文第l l 页 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , f i r s tp u r i f y i n gt h es i n g l ew a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( s w c n t s ) b y a c i d i f i c a t i o na n du l t r a s o n i c a l l ya s s i s t e df i l t r a t i o n a r a b i d o p s i sw e r ec u l t u r e db y s o i lf o r2 4d a y s t h em e s o p h y l lp r o t o p l a s t sw e r ep r e p a r e db ye n z y m ed i g e s t i o n m e t h o d ，a n di n c u b a t e dw i t h5 0 “g m ls w c n t su pt o4 8h o u r s t h e nt h e p r o t o p l a s t sw e r eo b s e r v e db yt e m ，a n do p t i c a lm i c r o s c o p e ，p a r tp r o t o p l a s t s w e r es t a i n e dw i t hp r o p i d i u mi o d i d ea n d4 - 6 一d i a m i d i n o 一2 p h e n y l i n d o l e ，a n d o b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y t h em e s o p h y l lc e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h 5 0 i - t g m ls w c n t s2h o u r s ，a n do b s e r v e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns w c n t sa n d m e s o p h y l lc e l l sb yt e m a c c o r d i n gt o t h er e s u l t s ，s u g g e s t i n gap o s s i b l e m e c h a n i s mm o d e lo fs w c n t st o x i c i t yt oa r a b i d o p s i sm e s o p h y l lc e l l s m o d i f y t h es w c n t sb yc o n c e n t r a t e da c i do x i d a t i o nm e a n s ，a n dm a k i n gc a r b o n n a n o t u b e sw i t hah y d r o p h i l i cc a r b o x y l g r o u p a r a b i d o p s i ss e e d l i n g s w e r e i n c u b a t e dw i t h6 2 5 ，12 5 ，2 5 ，5 0p g m ls w c n t s u pt o4d a y si n1 2m sl i q u i d m e d i u m o b s e r v i n g l e a v e s b ys e m ，a n dt e s t i n gr e s p e c t i v e l y e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y a r a b i d o p s i ss e e d sw e r ei n c u b a t e dw i t h6 2 5 ，1 2 5 ，2 5 ，5 0 l g m l s w c n t si n1 2m ss o l i dm e d i u m d e t e c tt h es e e dg e r m i n a t i o ni n4d a y sa n dt h e a c t i v i t yo fp r o t e c t i v ee n z y m e s ( s o d ，p o d ) i nl0 ，15 ，2 0 ，2 5d a y s r e s u l t ss h o w e dt h a t p u r i f i e d s w c n t st r a v e r s e da c r o s sb o t ht h e a r a b i d o p s i sc e l lw a l la n dc e l lm e m b r a n e ，l o c a t e di nv a c u o l e ，c h l o r o p l a s t t h e y e x h i b i tt o x i ce f f e c t so nt h ep r o t o p l a s t s ，a n di n d u c ec h a n g e so fp r o t o p la s t s m o r p h o l o g ya n dp r o t o p l a s t sa p o p t o s i s s w c n t sc a na c c e l e r a t et h ep r o d u c t i o n o ft r i c h o m e so nt h es u r f a c eo ft h el e a v e sa n dc h a n g et h ec o l o u ro fl e a v e si n1 2 m sl i q u i dm e d i u m t h er e l a t i v ec o n d u c t i v i t yo fl e a v e sg r a d u a l l ye n h a n c e da s t h ec o n c e n t r a t i o no fs w c n t si n c r e a s e d s w c n t sa l s oc o u l da c c e l e r a t e a r a b i d o p s i ss e e dg e r m i n a t i o ni nd o s e d e p e n d e n tm e a n si n1 2m ss o l i dm e d i u m s w c n t sh a v es i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ep r o t e c t i v ee n z y m e s ( s o d ，p o d ) o f a r a b i d o p s i sl e a v e s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i sm e s o p h y l lc e l l s ；p r o t o p l a s t s ；s i n g l ew a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ；c y t o t o x i c i t y ；t o x i c o l o g i c a lm e c h a n i s 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 il 页 目录 1绪论1 1 1研究的目的与意义”l 1 2国内外研究进展3 1 2 1 碳纳米管的研究进展3 1 2 2 拟南芥的研究进展6 1 2 3 碳纳米管对细胞影响的研究进展1 1 1 3 本课题主要研究内容及技术路线”1 8 1 3 1 本课题主要研究内容1 8 1 3 2技术路线图1 9 2 单壁碳纳米管的纯化、修饰及表征2 0 2 1试验材料2 0 2 1 1 材料2 0 2 1 2 主要仪器设备一2 0 2 1 3 主要耗材2 0 2 1 4主要试剂2 l 2 2 试验方法2 l 2 2 1单壁碳纳米管的纯化”2 1 2 2 2 单壁碳纳米管的氧化修饰2 2 2 3结果与分析”2 3 2 3 1s e m 表征2 3 2 3 2 拉曼光谱表征2 4 2 3 3t e m 表征2 5 2 3 4 水溶性分析2 6 2 3 5紫外表征2 7 2 3 6z e t a 电位表征2 8 2 4 讨论2 9 2 5 结论3 0 3 单壁碳纳米管对拟南芥叶肉细胞的影响3 l 3 1试验材料一31 3 1 1 材料31 3 1 2 主要仪器设备3 1 西南科技大学硕士研究生学位论文第1v 页 3 1 3 试验耗材3 1 3 1 4主要试剂”3 2 3 2 试验方法”3 3 3 2 1 拟南芥的种植”3 3 3 2 2 拟南芥原生质体的提取3 4 3 2 3单壁碳纳米管与原生质体相互作用3 7 3 2 4 单壁碳纳米管与叶肉细胞相互作用“3 8 3 3结果与分析3 9 3 3 1t e m 观察“3 9 3 3 2 光学显微镜观察4 3 3 3 3 原生质体形变率统计4 4 3 3 4 荧光染色观察”4 5 3 3 5 单壁碳纳米管刺激植物细胞可能的毒性机制一4 6 3 4 讨论4 7 3 5 结论4 8 4 单壁碳纳米管对液体培养拟南芥的影响4 9 4 1试验材料4 9 4 1 1 材料4 9 4 1 2 主要仪器设备4 9 4 1 3 主要耗材一4 9 4 1 4 主要仪器设备5 0 4 2 试验方法一5 0 4 2 1 拟南芥的培养5 1 4 2 2 对叶片进行s e m 及e d s 能谱表征5 l 4 2 3 叶片电导率的测定一5 1 4 3 结果与分析一5 2 4 3 1叶表皮毛光学观察5 2 4 3 2叶表皮毛s e m 以及e d s 能谱分析5 2 4 3 3叶片颜色观察5 6 4 3 4 叶片相对电导率5 7 4 4 讨论5 7 4 5 结论5 9 5 单壁碳纳米管对固体培养拟南芥的影响6 0 西南科技大学硕士研究生学位论文第v 页 5 1试验材料”6 0 5 1 1 材料6 0 5 1 2 主要仪器设备”6 0 5 1 3主要耗材6 0 5 1 4 主要试剂6 l 5 2 试验方法6 1 5 2 1 1 2m s 固体培养基的配制6 l 5 2 2 拟南芥的固体培养6 2 5 2 3种子的萌发情况“6 2 5 2 4 拟南芥叶片s o d 酶测定6 2 5 2 5 拟南芥叶片p o d 酶测定6 4 5 2 6 统计学处理一6 5 5 3 结果与分析一6 6 5 3 1固体培养基中拟南芥种子的萌发率6 6 5 3 2s o d 酶活性分析6 7 5 3 3p o d 酶活性分析6 9 5 4 讨论7 l 5 5 结论7 2 结论7 4 致访 7 4 参考文献一7 4 附录8 7 攻读硕士期间所发表的学术论文及研究成果一9 l 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 绪论 1 1研究目的与意义 碳纳米管( c a r b o nn a n o t u b c s ，c n t s ) 又名巴基管，是一种重要的新型纳 米材料。自1 9 9 1 年饭岛( i i j i m a ) 博士在高分辨电子显微镜下检测c 6 0 时 首先发现碳纳米管以来受到越来越多的关注，碳纳米管因其特殊的多用途特 性有很多，而被广泛关注。 碳纳米管的结构与球烯和石墨类似，与金刚石、石墨、富勒烯同属碳的 同素异形体。按照结构可分为单壁碳纳米管( s w c n t s ) 和多壁碳纳米管 ( m w n t s ) ，单壁碳纳米管是具有良好的单一性和对称性，因为其是由单层 碳原子绕合而成，与多壁碳纳米管相比，其粒径比多壁碳纳米管要小很多， 而毒性要比多壁碳纳米管强很多招，。 口 口口 图1 1碳纳米管的种类1 3 1 f i g 1 1 t h ek in d $ o ft h ec a r b o nn a n o t u b e s 其中( a ) 表示单壁碳纳米管；( b ) 表示多壁碳纳米管的横切图； ( c ) 带有官能团的碳纳米管( 从左到右依次带的是o h ，c o o ，和一n h 3 + ) 根据碳纳米管的碳六边形沿轴向的不同取向，可将其分为：锯齿形、扶 手椅型和螺旋型。其中锯齿形和扶手椅型碳纳米管不具手性，而螺旋型具有 手型。 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 z i g - z a g a l io t h e r sc h i r a i 图1 - 2 单壁碳纳米管的三种结构类型( 从左到右) ：扶手椅型、锯齿型、螺旋型1 f i g 1 2 t h et h r e er e p r e s e n t a t i o no ft h e $ t r u c t u r e so fa r m c h a ir z i g z a g a n d c hir aic a r b o nn a n o t u b e s 碳纳米管作为一种不易弯曲的，稳定且空心的纳米材料有许多独特的性 能，例如机械性、物理性、化学性，已经被广泛应用在各个领域睁川。迄今 为止，碳纳米管及相关的纳米材料对人类细胞和植物细胞的毒性影响依然没 有弄清楚，进来已经成为一个研究热点，。关于单壁碳纳米管所展示的毒性 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 机制以及对环境的影响方面的研究上依然不足”，经常被科学家讨论。碳纳 米管在哺乳动物细胞上的影响上已经被广泛研究，。迄今为止，还鲜有报道 说碳纳米管对植物细胞的影响。因此，研究碳纳米管对环境中的植物细胞的 影响及其相互作用有着非常重要的意义。 因此，本课题以拟南芥和单壁碳纳米管作为研究对象，研究纯化后的单 壁碳纳米管对拟南芥的效应，用以探索单壁碳纳米管对植物细胞的生物安全 性和适应性，为找出单壁碳纳米管对植物细胞的毒性作用机制提供理论依 据，并为进一步研究碳纳米管对细胞作用机制以及碳纳米管的生物安全性方 面研究做铺垫，为纳米材料对植物细胞的影响作用机制等方面研究起到重 要的意义，同时也为更加深入的研究自然环境中纳米材料以及纳米污染物对 农业和生态环境的影响提供理论依据。 1 2国内外研究进展 1 2 1碳纳米管的研究进展 1 2 1 1 碳纳米管修饰生物大分子的进展 最近几年，碳纳米管成功的官能团通过底端或侧壁或填充生物大分子， 或缀以聚合物，其结果为碳纳米管聚合物纳米复合材料拥有像优化机械、光 学和电性能等特性。在工业、农业和国防方面有着巨大的应用潜力。碳纳米 管在细胞上，人类健康和环境的影响也引起越来越多的关注，鉴于碳纳米管 在其中的毒性和生物安全性方面碳纳米管已经成为争论的焦点。 ( 1 ) 碳纳米管修饰的d n a 分子的研究进展 碳纳米管拥有材料的优良性能。d n a 对于构造大分子网络是一个出色的 分子因为它很容易合成，其反应具有高特异性，并且是构象很灵活。d n a 分子的碱基互补配对性能已经用来制造二维晶体和d n a 计算机和电子电路 的原型 t4 , 1 i l l 。因此，被碳纳米管修饰的d n a 分子对纳米设备的发展、生物传 感器、传递系统、电子测序等方面的应用有着巨大的潜力。 碳纳米管可以与核酸共轭通过非共价结合。单链d n a 、短双链d n a ， 以及总的r n a 分子可以贴在碳纳米管的表面，可以在水环境分散碳纳米管。 多聚腺苷酸( 3 0 t ) 具有高分散效率i - “。例如，lm gd n a 分子混合lm g 碳 纳米管在加lm l 水，产量最多有4m g m l 的碳纳米管溶液。 d n a 碳纳米管复合物通过电性( 例如琼脂糖凝胶电泳) 可以被分离”。 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 碳纳米管还可以与核酸共轭通过共价键。碳纳米管可以通过共价键复合物而 具有功能性。例如，羧基和氨基组可以形成碳纳米管的侧壁或终端”。反义 基因可以和碳纳米管通过共价结合发生共轭，可以运到h l 6 0 细胞成而达到 杀死人类白血病细胞。碳纳米管也可以包裹d n a 分子”。单壁碳纳米管可 以通过p c r 影响d n a 的扩增效率”。添加单壁碳纳米管加入反应溶液增加 p c r 的量在减少单壁碳纳米管的浓度，但是这一反应在逆转较高浓度的单壁 碳纳米管。类似的效果也被观察在p c r 反应中，加还是不加m 9 2 + 。在p c r 反应期间，在单壁碳纳米管、d n a 模板、t a q 酶之间处在着强烈的相互做用。 单壁碳纳米管可以提高反应溶液中p c r 的反应速率，在低于3 肛g p l 的浓度 范围，又可能充当不同生物反应的催化剂。 ( 2 ) 碳纳米管修饰的蛋白的研究进展 碳纳米管可以和蛋白通过非共价键共轭埘，。例如，1 3 内酰胺酶可以被 固定在碳纳米管内部或外部，而且它不改变酶的活性t a q 酶可以附加到碳 纳米管的外壁，并且这不改变酶的活性”。多肽和组氨酸和色氨酸可以对碳 纳米管有选择性的亲和”。单克隆抗体能够粘住单壁碳纳米管。被蛋白修饰 过的碳纳米管可以被用来提高它的生物相容性和生物分子的识别能力“”。例 如，带有聚乙二醇的碳纳米管官能和聚乙二醇辛基苯基醚可以防止碳纳米管 和蛋白质的非特异性结合。当生物素粘在聚乙二醇链上，链霉素可以绑定尤 其是生物素与碳纳米管结合。这些具有关能的碳纳米管具有良好的生物相容 性和生物分子识别能力。碳纳米管可以用作蛋白质的共价固定侧壁功能n ”。 一个双向分子，琥珀酶不可逆转的到单壁碳纳米管在甲醇的疏水表面，琥珀 酯组在单壁碳纳米管的表面可以与胺反应，结果形成一个酰胺粘合修饰的单 壁碳纳米管心”。单壁碳纳米管可以通过内吞作用进入人类白血病细胞和人类 t 细胞，这些可以高度暗示出单壁碳纳米管可以是一个药物运输系统n ”。 碳纳米管也可以被氨基酸或蛋白质填充。分子动力学模拟显示出像具有 较强疏水性的苯丙氨酸、温和的疏水性的亮氨酸、较强的亲水性的精氨酸这 三种多肽可以被封装在纳米管内，但却有着不同的封装的速度心”。蛋白质的 封装在碳纳米管内依赖于整个复杂系统的自由能改变。封装诱导的自由能减 少的越大，封装过程进行的越快。生物活性肽官能碳纳米管可以导致小鼠强 烈的抗肽免疫反应，没有交叉反应反对碳纳米管被发现的。3 “。如何充分利 用碳纳米管的性能以及蛋白质制造具有独特性能的均匀的纳米复合材料仍 然是一个挑战。 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 1 2 1 2碳纳米管的纯化 在研究碳纳米管性能的过程中，其纯化是一个非常重要的问题”。在碳 纳米管的制备过程中使用的金属螫合剂，产物中的无定形碳、石墨碎片、纳 米碳颗粒等杂质对碳纳米管的整体性能有很大的影响，消除这些杂质能够增 加研究碳纳米管本身固有属性的准确性，因此在研究碳纳米管时首先要将其 纯化。一般采用拉曼光谱等检测手段对纯化结果进行检测h ”。 碳纳米管的纯化主要是为了去除以下三方面的内容：第一，除去催化剂 的颗粒，第二，除去杂质碳，第三，消除碳纳米管在生长过程中的结构缺陷。 其中大部分的催化剂颗粒经过酸浸泡可以除去，但有些催化剂颗粒被包裹在 碳纳米管内或被碳纳米颗粒所包裹，其与碳纳米管中的结合形态尚未弄清 楚，因此很难彻底清除。目前提纯的方式主要是利用碳纳米管与无定形碳等 杂质的物理、化学性质的差异来提纯，纯化的方法大致可以区分为物理方法、 化学方法和物理化学结合法三大类。 ( 1 ) 物理方法 物理方法主要是运用超声波分散、离心以及过滤等分离方法来得到较纯 的碳纳米管。n e p a l 等人b 不用任何稳定剂将超声波和超离心分离两者相结 合，实现了单壁碳纳米管的简易快速的纯化方式，纯化的原理是利用了邻二 氯代苯对单壁碳纳米管有极强的溶解性，能将单壁碳纳米管和杂志分开，且 能将大管束的单壁碳纳米管分散开，利于超离心分离。s h e l i m o v 等人- 用超 声波辅助过滤的办法获得纯度为9 0 的单壁碳纳米管，不同样品的产率不同， 最高产率达到了7 0 ，纯化使得单壁碳纳米管变短，而且因为单根碳管相互 排列累计而使得管束变多。此外，还可以通过控制离心的速度来对碳纳米管 进行纯化，它是纯化的有效手段之一。 ( 2 ) 化学方法 化学方法主要是利用碳纳米管与杂质氧化速率的差别来实现的，与单壁 碳纳米管相比而言，无定形碳以及纳米碳颗粒更容易被氧化。传统的化学法 包括气相氧化法和液相氧化法两大类。气相氧化法主要是利用氧化性气体来 去除杂质碳从而使得碳纳米管的纯度增强。常用的氧化性气体包括纯氧和空 气。m i z o g u t i 等n 1 利用超细金粉去除单壁碳纳米管中的无定形碳，在3 5 0 下无定形碳被选择性的氧化，使得单壁碳纳米管得以纯化。g a j e w s k i 等” 在研究热氧化纯化时发现碳纳米管中几种碳结构中无定形碳的稳定性最小， 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 在3 5 5 时就开始发生了氧化，而单壁碳纳米管尽管比无定形碳的氧化稳 定性要高，但由于其生长温度范围是在8 5 0 到1 2 5 0 ，所以在制备碳纳 米管时也尽量避免在其生长温度范围内。液相氧化法主要是用浓酸来溶解金 属催化颗粒，将杂质氧化去除。v a v v a r i n i t 3 等用硝酸氧化单壁碳纳米管，经 过过滤得到纯化产物。而杨占红等引研究了酸性重铬酸钾对单壁碳纳米管的 纯化，对纯化条件进行了深入研究。 ( 3 ) 物理化学综合法 单纯的使用物理法或者化学法进行纯化单壁碳纳米管，其效果都有一定 的局限性。将化学方法和物理方法结合起来，利用两种方法较为成功的地方 将使单壁碳纳米管更加有效的得以纯化。d a i l l y 等引通过向样品中添加钾元 素，与碳元素形成k c 8 ，从而有效的降低石墨烯片中的范德华力，然后用乙 醇冲洗脱掉金属催化剂表面的石墨碳层，使得催化剂颗粒容易被空气氧化而 且容易被酸除去。l i 等，采用添加十二烷基磺酸钠来作为单壁碳纳米管的表 面活性剂，并对其进行超声分散和气相氧化综合的办法来纯化单壁碳纳米 管，纯度高达9 8 。h o l z i n g e r 等引利用聚丙烯酸钾吸水后膨胀的特性，用 其作为色谱柱的固定相真空过滤来纯化单壁碳纳米管，有效的将超声波处理 与氧化处理结合起来。 1 2 1 3碳纳米管的修饰 对碳纳米管进行修饰并对其加以利用已经成为纳米领域科学研究的重 要方向 4 3 4 4 ，。由于碳纳米管难溶于水，为了让单壁碳纳米管在试验过程中更 好的溶于液体，需要对纯化好的单壁碳纳米管进行进一步的修饰，这一方面 的研究工作已经有大量报道，目前主要用浓酸法对单壁碳纳米管进行氧化修 饰，使得碳纳米管自身的亲水性增强 4 5 - 4 1 ，。一般采用t e m 等手段来对碳纳米 管的修饰结果进行检测 o l 。 1 2 2拟南芥的研究进展 1 2 2 1国内外拟南芥的研究概况 1 9 8 7 年在美国密歇根州立大学召开的第三届国际拟南芥大会上，人们 再次确认了这种植物的模式植物地位。拟南芥的基因组较小，约1 2 0 兆的 碱基对，是测定基因组序列最为理想的材料。而更重要的是，尽管拟南芥的 基因组没有在高等植物上普遍存在的大量d n a 重复区，但却包含了植物发 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 育、代谢、环境信号反应和抗病性等所有功能所需的基因，如能破译其植物 的基因组全序列，将为人们在分析植物基因功能提供一个强有力的工具。科 学家们通过不懈努力，终于在1 9 9 9 年公布了拟南芥2 号、4 号染色体的测 序结果，一年后又将剩下的三条染色体基因组序列展现在了人们的面前”。 二十年后，2 0 0 7 年6 月2 0 日至2 3 日在北京九华山庄举行的第十八届 拟南芥国际学术大会，大会从植物发育调控机制、植物抗病机制、植物抗逆 机制、植物基因组学、植物能源与代谢、植物信号转导等方面展开专题报告， 为国际国内科学工作者的工作进行了很好的展示。此次国际会议首次在亚洲 地区举行，对亚洲地区的模式植物研究的发展具有深远的影响，对推动我国 模式植物研究进程，提高我国科学家的国际知名度具有重要的意义。许智宏 院士在讲话中指出：“十年以前我们中国科学家还不会种植拟南芥菜，而现 在我们的模式植物研究在国际上取得了举足轻重的地位，为我国的农业研究 提供了重要信息，我们为之而骄傲。”目前，我国在拟南芥研究领域的研究 队伍不断壮大，也取得了很多令人骄傲的成绩，但是由于研究起步较晚，在 分析方法以及先进仪器的使用上还与国际先进水平之间有一定的差距，我国 拟南芥的研究还有很长的路要走。 2 0 0 8 年1 2 月6 日至7 日，在中国科学院上海生命科学研究院植物生理 生态研究所举办的全国最大规模的“2 0 0 8 年拟南芥研究学术研讨会 是继 2 0 0 7 年第十八届拟南芥国际学术大会后，在中国举办的又一次拟南芥学术 盛会。此次会议由许智宏院士、李家祥院士、陈晓亚院士担任主席，由许智 宏院士做开幕报告，研讨会邀请了国内外从事拟南芥研究领域的专家、教授 作报告，报道了目前国内外对拟南芥的研究状况，为国内从事拟南芥研究的 专家、学者构建一个交流并探讨彼此间的研究成果的高水平平台。 许智宏院士在此次学术会议上指出了一篇2 0 0 8 年在世界顶级学术期刊 c e l l ) ) 上发表的关于拟南芥的论文，该文章阐述了人类对模式植物拟南芥 的研究看似在医学高级研究中几乎没有起到任何作用，而实际上通过科学文 献的研究表明其实这是一个误解。许多直接相关的发现表明人类的健康和疾 病早已通过对拟南芥的研究而详细的阐述过，通过研究这种万能的模式植物 而使得一些针对人类生物的重要过程的研究变得容易很多。拟南芥拥有广泛 的蛋白样本和各领域的实证，对人体疾病、人类的发展以及其他人类生物重 要的方面起到很好作用。该文章通过：( 1 ) 先天免疫和细胞内感受态；( 2 ) 光信号，蛋白降解，和癌症；( 3 ) 隐花色素和生物钟；( 4 ) a x r l ，人编 在蛋白周期，以及老年痴呆症；( 5 ) 家族蛋白以及r n a 沉默；( 6 ) d n a 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 的甲基化；( 7 ) 富含亮氨酸感受态激酶，离子运输以及g 蛋白信号；( 8 ) 自然界遗传变异，。这八个方面重点阐述了研究拟南芥对人类健康研究的 突出贡献，从而使得我们更加深入和系统了解了拟南芥对人类以及生态 环境的重要性。 1 2 2 2拟南芥形态发生与生长发育的分子生物学进展 由于拟南芥生长周期短、植株小、并且可以筛选到大量突变体，因此成 为突变遗传、生理生化研究、形态发生和生长发育分子生物学的首选材料， 已经得到了大量的突变体，为植物形态发生、生长发育及遗传育种的理论与 应用研究提供了良好的材料。对于拟南芥的许多基因来说，通过筛选约2 0 0 0 株诱变处理的m 2 代个体即可获得一个失去某种功能的突变体，主要的突变 体有以下几类： ( 1 ) 颜色变异 不正常的植株颜色可能是由四方面原因造成的：第一，缺乏花青素造成 的；第二，几个核基因突变中的一个造成不正常的叶绿体发育；第三，叶绿 素缺失或减少而引起的；第四，由于叶绿体突变子的作用所致。 ( 2 ) 形态变异与同源异形基因 在拟南芥突变体中，形态变异个体最多。突变体g l a b r a 和d i s t o r t e d t r i c h o m s 则为无叶片或叶毛形状不一，e r e c t a 和c o m p a c t a 表现型茎的大小与 排列位置发生变异，突变体a s y m m e t r i c 和a n g u s t i f o l i a 影响叶片狭窄或不对 称。拟南芥还有一套引起花形态变异的“同源异形变异”的隐性突变体。它们 中有花瓣部分或全部变化为雄蕊、且萼片变为叶的a p e t a l a 2 突变体。花瓣发 育为萼片的p i s l i l l a t a 突变体和花瓣变为萼片、雄蕊变为心皮的a p e t a l a 3 突 变体。还有一些花的形态变异不完全为同源异形突变体。 ( 3 ) 隐性致死突变 常见的有胚致死突变、条件致死突变以及无光合作用能力突变，如t h 1 和t h 2 突变体只有在维生素b l 存在的条件下才能够维持生存。除此之外， 还有许多丧失特异酶活的突变，其中有些突变能够造成a d h 酶活性的丧失， 但由于烯丙醇在a d h 酶作用下可以变成有毒的乙醛，因此可以用烯丙醇处理 进行选择。 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 ( 4 ) 光呼吸代谢缺陷型 自1 9 7 9 年s o m e r v i l l e 等采用e m s 浸泡拟南芥种子并用高二氧化碳空 气高二氧化碳正反双向选择法筛选获得光合碳氧化途径缺陷型以来，已经 鉴定出四种光合碳氧化途径及其相关代谢的缺陷类型，其中拟南芥就拥有较 多的类型。对它的研究澄清了光合碳氧化途径碳氮代谢中间产物的作用、生 理恶化机理、气体交换特性等一些悬而未决的问题”。 ( 5 ) 激素缺陷或抗性突变 在拟南芥为数众多的突变体中，有一类激素缺陷或抗激素的突变体，如 赤霉素缺陷型个体表现矮小，种子无发芽力。而a b a 缺陷型则伴有种子休 眠力降低和不正常的水平衡。而相反的有一种突变体，它对2 ，4 d 的抗性 较正常个体高2 0 0 0 0 倍，该杂合体植株矮小，而纯合体是致死的。如李风玲 等人以拟南芥的赤霉素缺陷型突变体和赤霉素不敏感型突变体为材料，研究 光和4 种赤霉素对拟南芥种子萌发和幼苗生长影响的相互关系，以此说明光 对拟南芥种子萌发的促进主要是提高了种子对赤霉素反应的敏感性而不是 增加了赤霉素的生物合成造成的哺”。 1 2 2 3 拟南芥原生质体的研究进展 首次报道原生质体的分离至今已5 0 年了1 9 6 0 年英国植物学家 c o c k i n g “，用酶解方法降解细胞壁，获得了番茄根尖原生质体，自此原生质 体的研究得以迅速的发展。 分离得到的新鲜拟南芥原生质体早已被应用在研究植物响应环境胁迫 的分子信号机制上”，并且被用来观察细胞内途径和景象，细胞形成，重生 与光合作用、钙信号和规律，以及光离子通道的调节等在各种植物中的应激 激素反应“。 2 0 0 5 年祖元刚等对拟南芥原生质体进行超声破碎过滤后对其细胞器 进行再生培养的研究，为细胞器重组乃至细胞重建提供重要的理论依据。而 在同一年祖元刚等1 又对酸性酶解拟南芥叶肉细胞进行研究，发现酶解过程 中细胞倾向于p h 值降低，而细胞器重组产生的新原生质体p h 值向正常水 平恢复。 2 0 0 6 年崔素娟等人通过拟南芥原生质体的研究发现外源钙调素不能 被主动内吞入细胞内，而是以完整分子形式结合在细胞外表面，并且外源纯 化钙调素可以升高正向型质膜囊泡中的鸟苷酸三磷酸水解酶活性，从而证明 西南科技大学硕士研究生学位论文第10 页 外源钙调素是通过细胞表面位点跨膜信号转换为细胞内信号来调节生物学 活性的。而藤蕾等通过将f i b r i l l i n 操纵子驱动的荧光素酶报告基因表达载 体导入拟南芥原生质体中研究其表达调控，证明了脱落酸诱导报告基因的表 达。 2 0 0 7 年y o o 等，详尽的阐述了由于拟南芥叶肉原生质体是万能的细胞 系统，它被用来做为瞬间转化的基因表达分析的过程。这为准确高效提取拟 南芥叶肉原生质体以及做瞬间转化打下非常好的基础。 2 0 0 9 年聂志刚等2 一报道了不同浓度的z n ”、c d ”、c u 2 + 重金属离子对拟 南芥原生质体的毒性和d n a 损伤差异，发现原生质体在l 一5m m 的3 种离 子作用下活力明显下降并产生了浓度依赖性，3 种离子当中z n 2 + 对原生质体 的活力影响程度较小。 最近年来，植物原生质体先后依次被用于研究纳米材料的功能，研究纳 米材料的内在功能，例如聚苯乙烯纳米球”以及硅纳米粒子t 对植物原生质 体的作用研究，目前纳米材料对植物细胞的作用成为研究热点。 1 2 2 4 拟南芥叶表皮毛的研究进展 拟南芥叶表皮毛是从表皮细胞伸出的单个表皮细胞，通常有三个分支且 分支成“y ”形，指向叶基部，暗示分支模式是对叶原基内轴向信息的一种 反应。在茎上的不同叶片间以及在单个叶片的上下表皮间，表皮毛的分布不 同。而在含有表皮毛的各个表皮区域内，表皮毛是均匀分布且成对和成串发 育的”。 近些年，科学家们对拟南芥表皮毛发育的分子遗传控制机理的研究已经 有了很大的进展。拟南芥的叶片表皮毛的发育是受时间空间严格调控的过 程，已经分离到七十多个表皮毛突变体，这些突变体可归为无表皮毛、表皮 毛扭曲、表皮毛减少、表皮毛簇生、分支不正常以及玻璃状表皮毛这六种表 型，其中有二十一个基因参与 1 6 , 8 t ，。目前发现主要参与调解的基因包括t t g l 0t r a n s p a r e n tt e s t ag l a b r a 1 、t t g 2 ( t r a n s p a r e n tt e s t ag l a b r a 2 ) ， g l l( g l a b r o u s l ) 、 g l 2 ( g l a b r o u s 2 ) ，g l 3 ( g l a b r o u s 3 ) 、 豫y ( t r i p t y c h o n ) 、c 尸c ( c a p r i c e ) 以及w e r ( w e r e w o l f ) ”，其中以 g l l 、t t g l 、g l 3 对叶表皮毛的发育最为重要t ”，目前已经证明，由这三个 基因产物组成的复合体m y b - b h l h w d 4 0 控制拟