（发酵工程专业论文）candida+utilis高密度培养及提高其胞内谷胱甘肽含量的研究.pdf

中文摘要 审文摘要 谷胱甘肽 g s h 是 种同时具有7 谷氨酰基和巯基的生物活性三肽 作为一种能 够保护细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫的重要活性三肽 在生物体内有着多种重 要的生疆功能 特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至头重要的作用 被广泛应用于临庶医药 食鼎工业 体弯运动等多种生物研究领域 微生物发酵法是目前g s h 工业化生产的最普遍方法之一 谷胱甘肽是一种胞内 产物 本论文以一袜高积累g s h 的产麟假丝酵母 c f 胁w s h0 2 一0 8 为出发菌株 以细胞茅 ig s h 的离产量 高产率为髫标 采用一系列可幸亍性方案寒提高缨胞密度葶瑟 g s h 的胞内含量 研究的主要内容如下 1 谷胱甘肽是一种胞内产物 提离细胞密度将有助予提高g s h 浆产量 考察了 恒速流加和指数流加等不同培养方式对c i 打胁w s h0 2 0 8 发酵合成g s h 的影响 经过4 8h 的指数流加培养方式时 细胞干重 d c w 达到6 9g l g s h 产量和胞 内g s 含量均达到最大僵8 3 5m g l 1 鞠1 4 1 怒提嵩维胞密度是较为理想的选择 2 在摇瓶培养条件下分别考察了添加l 谷氨酸 甘氨酸和l 半胱氨酸等三种组 成g s h 的莉体氨基酸对合成g s 豹影鞠 结果表瞬当l 半虢氨酸是g s h 合成豹关 键氨基酸 当添加浓度为8m m o l 0 1 时 g s h 产量和胞内g s h 含量分别比对照提高 了5 1 和8 2 3 在摇瓶条件下 三种氨基酸混合添加对提高g s h 的产量和腮内含量影响最大 添加浓度均为8m m o l l 1 时 g s h 产量和胞内g s h 含量分别为2 9 5m g l 1 和3 0 3 对照提高了9 1 和1 2 1 4 在7l 罐上 考察葡萄糖流加培养与添加b 半胱氨酸结合对细胞合成g s h 的 影响 当一次性添加l 一半胱氨酸浓度为4 0m m 0 1 l 1 时 胞内g s h 含量最高达到2 2 6 g s h 产量达到1 4 5 8m g l 一 实现了高细胞密度培养与高g s h 胞内含量的统一 5 在7l 罐上 当一次性添加混合氨基酸浓度均为4 0m m 0 1 l l 时 胞内g s h 含 量摄裹达到2 4 3 g s h 产量达至 1 5 6 8m g t g s 豹平均生产速率为2 7 5 m g l 1 h 1 使得g s h 的总量和生产强度均得到了较大提高 最终显著地提高了是标 产物g s h 的产量 6 根据微生物的生理特性 研究了过氧化氢胁迫对缨胞合成g s h 的影响 研究 江南大学硕士学位论立 c 台n 幽如埘甜打高密度培养及提高其胞内替胱甘肽含薰的研究 发现合适浓度的h 2 0 2 刺激对细胞合成g s h 是有利的 在7l 罐上 当h 2 0 2 的流加 总浓度为3 6m m o l l 1 时 g s h 最终产量为9 2 2m g l 1 胞内g s h 含量为1 6 4 比 对照高出3 5 关键词 镰胱甘获 产腻瑕丝酵母 高密度 流加发酵 l 半胱氨黢 混合氨基酸 过氧化氢 胁迫 i i 蒸苎垫墨 a b s t r a c r a so n eo ft b em 勾o rn o n p r o t e i nm i o lc o m p o u n d s g l u t a t h i o n e g s h i sw i d e l y d i s 仃i b u t e di nt h en 栅a n dp l a y sm a n yi m p o n a mp h y s i o l o g i c a lr 0 1 e si nl i v i n gc c l l s s u c h a s e n h a n c i n gi m m u n i t yo f 也eb o d yp r o m 辫圭ya n dm a i n t a i n 协g 彘en o 黼a l 揩d o x e n v i r o n m e n to fc e l l sa sa na m i o x i d a n t s i n c eg s hi sw i d e l yu s c di nm ef i e l d ss u c ha s d i l l i c a lm c d i c i n e f o 醚i n d u t r y a l h l e t i cs p o n sa 1 1 db i o i o g i c a lr e s e a r c h t h ed e m a n do f g s hh a sb e i n ge x p a n d i n g g s hi sa ni m 瞪i c e l l u l a rp r o d u c t m i c r o b i a ls y n t h e s i so fg s 王b yf e r i n e n t a t i o ni so n eo f 攮em o 髓e o m m o nm e t h o d sf o rg s kp f o d u c t i o na tp r e s e n t 1 nt 圭五ss t u d y c 拼f f 鼢w s 壬 0 2 0 8 as t r a i nw h i c hc o u l da c c u m u l a t eh i 西c o n c e n t m t i o no fg s hi n 蝴c e l l u l a d yw a s s e l e c t e df o rg s hp r o d u t i o n as e r i e so f f e a s i b i e 印p r o a c h e so rs 协缸e 西e sw e r ec a r r i e do m t o 曲魄i nh 远hy i l do fc e l la n dg s h t h em a i nc o n t c n t si n v o l v e di nt h i s 她s i sa r e d e s c r i b e da sf o l l o w s 1 确ei n c r e a s eo f d r yc e l lw e i g h t d c w c o 赫d 主m p r o v eg s h c o n c e n t r a 盹i o nb e c a u s e g s hi sa ni n t r a c e l l u l a rd r o d u c t t h ee 虢c t so fd i f r e r e n tf e d b a t c hc 试t u r em o d e s 谢也s u c h a sc o n s t a n tf e e d i n gr a t ea n de x p o n e n t i a l 悔e d i n gr a t eo ng s hp r o d u c t i o nu e r ea l s os t u d i e d h i g h e fd r yc e l lw e 谵h ta n dg s hy i e l dw e r er e a l i 嚣e di ng l u c o s ef e d b a t c hc u l t u r e a sa w h o l e e x p o n e n t i a lf e e d i n gm t ec u l t u r e 抛sm o r es u i t a b l e 印p r o a c ht oa 札a i nn o to n l yh j g h c o n c e 嗽a t i o n sb ma l s oh i 曲p r o d l i c t i v 试e so fc e l la i l dg s hi nt h ec u l t i v a t i o no fc f 玎曲 w s h0 2 0 8 w 主也4 8ho fc u l t i v a t i o n b y 窖k c o s e 蠡 d i n ga te 冲o n e n t i a lr a t o 啦em a x i m u m d c w g s ha n di n n 丑c e l l u l a rg s hc o n t c n tw e r ea c h i e v e da sh i 曲a s6 9g l 8 3 5m g l 1 a n d1 4 1 r c s p e c t i v e l y 2 t h er o l e so f t h r e ec o n s t i t u e ma m m oa c i d so f g s hs u c ha sl w g l u t 搠a t e l c y s t e i n e a n d 瘿y c i n eo ng s h o d u c t i o n r e s p c c t i v e l y i nn a s kc u l t h 糟w e r e 址v e s 趣嚣t e 矗b yt h e a d d i t i o no f8m m o l l 一1l c y s t e i n e g s hc o n c e n t r a t i o na n di n 廿a c e l l u l a rg s hc o n t e n tw e r e i m p r o v e db y5 1 a n d8 2 c o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 i ti si n d i c a t e dt h a tl c y s t e i n ew a 8 t h ek e ya m 妇l oa c i di nt h es y n t h e s i so f g s h 3 抽f l a s kc u l 掘r o 铂ea d d i t i o no f 妇e e 黜i n oa c i d sa tt h el a t es t a g ep h a s eo f c 试t i v a t i o n 影e a t l yi m p r o v e dg s hc o n c e t r a t i o na n di n 打a c e l l m a rg s hc o n t e n t g s h c o n c e n t r a t i o na n di n t r a c e l l u l a rg s hc o m e m 埘协幽ea d d i t i o no f8 咖o l l 1m i x e d a m i n o a c i d s i n c 忿辐e db y9 1 a n d l 2 1 t h a n 也ec o n t r 0 1 4 a st ot h ec u l t i v a t i o no fc 材f f 疗jw s h 0 2 0 8b yf d b a t c hp r o c e s si na7ls c i n e d 宅雌e n t o r 龇越d i 重i o no fo c y s t e i n e 毹她鼹do fc e i l 黟 坝hp h a s ea l s oh a dp o s i t 主v e e 恐c t so nt h ee r 山a n c e m e n to f b o 吐1g s hp r o d u c t i o 姐di m m c e l l u l a rg s hc o n t e n t w h e n l c y s t e i n e0 0m m o l l w a sa d d e da t4 5h t h em a x i m u n lg s ha i l di n 缸a c e l l u l a rg s h i i i 江南大学硕士学位论文 耐 出删舾高密度培荠及提高其胞内谷胱甘肽禽量驰研究 c o n t e n tr e a c h e da sh i g ha s1 4 5 8m g l 1a n d2 2 6 r e s p e 馥v e l y 5 b y 稚d i n g 蕊m i x 挑r eo fl g l 咖躲 l c y s t e 融谢由c 主n e 喇畦l 雠i fr e s p e c 畦 e c o n c e n 打a t i o na t4 0m m o l l r e s p e c t i v d y 也eu l t i i r l 越eg s hc o n c e n 呦矗o n 托a c h e d1 5 6 8 m g l m ei n 旬瀚c e l i u l a rg s hc o n t e n t 麒犯h e d2 4 3 髓i sd e m o n s t r a t e s 也a tm i x e da m i l l o a c i d sc o 瑚b i n e d 谢饿g u c o s ef e e d 沁g 啪s eo f b 獭o s te 衢c i n ta p p r o a c h e st o s i m u i t a n e o u s l yi m p r o v eb o t hg s hp r o d u c 廿o na i l di n 仃 e l l u l a rg s hc o r i t e n t 6 t h ee 船c 招o fh 2 0 2o nf 酗n e n 诅髓o o f c 删扭w s h0 2 一0 8w e r e 遍v e 辅9 8 毫e d w h e a3 6 m m o lr l lh 2 u 2 w a sa d d e da ta7ls t i r r e d f e r m e n t o r t h ec e uy i e l dd e c 琳a s e d t o s m ee 醢铋t b u tt h cg s 毯c o n e 铋台8 蛀o nr e a c h e d9 2 2m g t l 一 a n d 璇ei n 扛a c e l l u l a rg s h c o n t o mr e a c h e d1 6 4 u n d e fh 2 0 2 一s 订e s ss 慨g y i n c r e a s e db y3 6 如a nt h ec o n 舡o l k e yw o r d s g l m 如j o n g s h c 矗理盛出删五 f d b a t e hf e r 强e n t 藤o n l c y 妣诜e m i x c d a m i n oa c i d s h 2 0 2 h 2 0 2 一s 他s ss t r a t e g y f v 独匐性声明 本人声嘲衙星交的学位论文怒本人在导师措警下进行的姘究工作及 取褥戆磺究羧莱 赆我囊懿 除了文孛特裂燕以括注鞫蘩落麓魏方辨 论文中不包含其健人已经发表或撰骂过酶磷究成豢 瞧零包含本人必获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工 作瀚鬻恚对本研究所做的经何贡献均已猩论文中作了明确酌说嘲并表示 落豢 签名 羝盔垒日期 妒 年 月硝日 关于论文使用授权鲮说嚷 本学位论文佟者完全了解涯鼹大学窍关保絮 使耀学位论文懿投定 江南大学有权保隳并向阑家有关部门戚机构送交论文的复印件和磁擞 允许论文被蠢阕释诺阔 褥敲释学位论文翡全部或都势海容缡入有关数 据鬻进行检索 霹激莱霆影露 缩印凌糖搂等复裁手段缣存 敷编学餐 论文 并且本人嗽子文撼的蠹褰和纸蟥论文的内容耀一致 僳密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名 猛蛊量导嚣签名 丝 日期 秽6 年矿舞越爨 第一章绪论 1 1 褡胱曾黻的磷究背景 l 1 1 谷麟苷黻鹬基本性簇 第 章绪论 作为细胞中竣丰寰的小分子硫醇黉他合貔 谷艇莒肢 靼p o 蛰氨畿 o 半躺氨 酸甘懿酸 lg l h 鼬l y l e 一锣嫩i n l l y c h 辑蛙蝴燃 舱 是 燕l 答氨照 l 半黔氮酸霸 甘氨酸经肽键缩台丽戚的 种同射具露y 一谷氨簸基积巯基豹生物溪性三驶纯台物 英 结构特点是分子中含褥一个特殊的 p 敝键 硅 o 谷氨酸y c o o h 与l 一半赋氮酸鲍 践 n 屯缩合成的放键 它不闻于蛋自餍分子中豹普通歉键弼 麓莲漾攫 守咎铺篷串 髓獭鲢 越箍 依为生物体内的嚣蛋盎巯基他食物 谷腿苫躲主要耆逆爨型 鹋h 秘甄佬型 g s s g 两种形态 在机体中大爨存在并起主要终瘸的楚还原型谷赋苗肽脚 g s 薹 的分子量为3 0 7 3 3 熔点l s 9 0 e 1 9 3 0 c 分鳃 等电点为5 9 3 毖旗光度为 程 乎5 l 尹 c 4 6 5g o h 2 0 晶体鏊无龟透明缅长拣状 它弱溶予承 舔醇 滚氨鞠n n 二甲基甲酰胺 但微潴于醇 醚和丙蒯等有机溶剂 g s h 固体较为稳定 但葵承溶 液在交气中极猫被氯化成c 塔s g g s s g 甏由两分子i s s h 经氧化艇氢丽形成麴戳二 硫键谶接的 浆体 一般以水合物的形式存在 熔点1 7 8 0 c 1 8 2 c 比旋光度必 缸 d 2 吣1 0 扩 e 2 og 0 鞭2 0 分子螫为6 1 2 6 3 是一释溶予东魏自琶晶体翻 g s s g 诃戳由谷胱甘歉还原酶还原成g s h 这个酶是黄素蛋白 它能利用n a d p h 作 荧瞧子供钵 菱常祷况下大多数生黪霸麓串g s 转与g s s g 豹院镶翁为l o e l 列 g s 嚣 在东潜液中静擒象存程分子肉氯键 黼g s s g 无此现象发生磷 豁麟蓥黢程喜然赛审广泛分毒予动携 棱镑帮锾燮物爨爨幽 葵中l 盖酵鸯 冬麦 艇芽戳投入秘幼物嚣手靛 肾 毁镯飚秽醺睛箍袄体中含艇较为率富 许夥植物如蔬菜 豆类 谷甥 蓉类 蘩类等也含骞一宠霪熬 塔疆嗣 动甥续臆中懿g s 薹 主要越羞巯 基缓渖剡毂佟髑 人体趣液孛g s 静援常浓寝为3 7 辩g 0 1 肝髓 臀脏楚g s h 主 要懿台成 代谢帮撵渣器官f l 贯姊 g s 玉还可鞋在黢鳃爨中合成曼郡以还琢澎态存 在 江南大学硕士学位论文 幽一靠如 f 如高密度培养及提高其胞内谷胱甘肷含量的研究 1 2 1 谷觥甘肽的功熊及应用 谷硫甘肽是由谷氨酸 半胱氮酸和甘氨酸通过肮键缩合而成的三肽化合物 它子 i 9 2 年被正式命名 1 9 3 0 年确定纯学结构 作为一释能够傈护细胞抵御舞界环境条件的嗣激和胁遍的煎要活悔三敝 g s h 在生锈体痞有着多释重要的生理功能 将澍蹙对予维持生物俸内适宜的氧纯还原环境 起着歪关重要熬佟鼹 伽 鸯从g s 珏祓发现戳来 它不仅 乍为试裁广泛用于生物纯学 鬟学 生兹学积亿学躲磷究测定中 瑟显已残为一耱重要的生纯药物 套赋彗默豹主要生璎功 2 足抗鸯叁葵 捷衰老 抗氧纯 戡体代潦产生游过多舀 虫基会损伤生物膜 侵袭生命大分子 促进极髂衰老 著诱发瓣癣或动脉矮纯憝产生 谷胱甘肽可消除豳由基 能趣到强毒力的保护终月 n 谷胱甘肷不仅能消除人体自瞧基 还可以提轰人体兔疫力 它不但旋增进虫戏 制造保护物质的功能 保护物质指能保护身体免受感染的物质 同时 也黢降低 奉 内发炎物质的总含量 这些发炎物质是由细胞制出来的 谷胱甘肽在老人迟缓化的缨 胞上所发挥的功效比年轻人大 为此 对于衰老的免疫系统 谷胱甘肽将维持之 并 使之臻于健康 因g s h 具有的独特生理功能 被称为长海因子和抗衰老因子 美国 著名营养保健专家艾尔 敏德尔博士称谷胱甘肽为三倍效能的抗衰老氨基酸 中圈肽 谷网 谷胱甘肤对予放射线 放射梭药物所g l 超的自细胞减少等症状 有强有力的保护 作用 谷觥首肽能与进入人体的有毒化合物 重金属离子或致癌物质筹相结合 并促 进其摊密体井 怒到中和解毒作溺h 谷虢苗获在人体浅的生纯防镪体系起重要作蠲 舆有多方面的生理功能 谷胱甘 黢可避止氧纯瞧经蛋自 绦护巯基酶分子中一s h 基 有利于酶活径的发挥 并且畿恢 复已被破坏戆鹣分子中一s 鞭基翡潘性功能 使酶耋新浚复活经 3 1 谷胱甘簸逐可戳抑 铡乙酵侵害翳脏爨产生静g 嚣黪 手l l 谷赋甘肽霹作为浚疗囊内障骜裁懿主要藏分 l 近年来 瑶方科学家 茏其麓蟊 本学者发现谷赋甘肽也具窍搦铡艾滋瘸毒躲功能 l 谷羰彗默是孕妊懿必霈营养替充 剂 它关系到婴儿购体蠹发育生长 g s h 作为生化药物 临床上长期以寒多月于治疗肝脏疾病 乍为 秘重要的生 理活性物质 g s h 在解毒 抗辐射 肿瘿 瘰症 氧化衰老萋 协调晦分泌的治疗中 效果明显且无副作用m j 这些同类药物所不具有的优点使褥g s h 在临床和医药领域 有着极为广泛的用途 越来越多的i 临床实验结果表明 谷胱甘肷可以迅速增强机体的免疫力 人体盎 g s h 增加后对消化系统 呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助 加拿大麦基尔大学 教授古特曼博士这样预测 g s h 很快就会象胆固醇一样深入民心 成为人们衡量健 康的指标之一 华佗阏 第一章绪论 另外 g s h 与遮动训练也有着密切的关系 它研以防止损侮 攘离运动戆力秘 消除运动疲势f 1 8 由于g s h 能够提赢体内您红蛋白的含量及抗氧化能力 并保护红 细脆免蘧氧化往教环 戳茂 g s h 程体育领域肉 蠢论建在运动性贫斑祝理的搽讨 还蔗堋练过度的预防 运动悔疲劳机理的探讨 以及运动营莽的补充方戚都依受人们 弱关淀l 豫 在食品工鳆中 黼本等发达阔家在2 0 世纪五十牮代辅开始将g s h 作为生物活性 添龆裁势积辍开蒺癍耀在保德食品熬生产中 2 l 禽晶中添茄豁虢嚣瑟瑟嫠到意想不至 豹佟蠲 1 楚八爨蠹裁整中 可起嚣还滠痒蘑 不傻霞粼造瑟避瓣辩蕊滚篷至辍来翡二 分之一或三分之一 劳动条释大柩覆改善 并起粥食赭营养瀚强亿佯用及其德功能 2 将其热天到酸奶秘婴绥j b 食鼎中 穗警予维黛素e 可莛到稳是裁的终燕 3 烬其拌至n 鱼糕中 防止色泽鸯鞋深 4 攘到肉制品秘于酪等食品中 具有强纯飙味的效果 作为一帮抗氧化剡 g s 爨鸯舄贵的枣沥徐格 爱夔还没蠢裁在食最麴工镢域 中碍至 广泛应用 但是 由于g s h 狂强化食暴风味的同蛙对人钵有保健作熙 它瓢 应用前景显然要优于矮它类黧的防腐剂或抗氡亿裁1 2 1 1 面我麓对g s 斡鹾突起步较 晚 在食品方蕊的应用还处于起始阶段 因此 在价格下降的前提下 果用g s 作 为食晶抗氧纯潮麓食潞加工照的发震趋势之一 根据潮辨穗缀辊稳颡测 g s 擎为 一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈表愈广 g s h 的需求量 委鑫螽增大 谷魏苜觚最早子1 9 9 5 年由日本协和 砭y o a 发酵株式会社与日本山之内株 式会社开始焚藏磷甏 1 9 9 9 年 焉翟奉豹禚瓣生产翡注蓊瘸还淼墅谷虢苗黢在国内 上市 据s d a 南方箧药研究所的数错资料显示 2 0 0 2 年裕胱甘肽国内市场销售额为 g 既亿元 2 0 0 3 年谷虢首骏全誉每场镑售额为 3 5 5 亿元 毙主军增长6 9 0 5 2 垂0 4 年上拳年 1 2 季度 谷胱甘躲金凿市溺销售籁为8 3 9 亿元 眈上年同期增长4 3 1 1 硬诗全年瓣内镄售额必1 5 钇蹉上 攀缝嚣蠹足个裁势金犍懿霰袁 壤谤嚣鬟求量魏 在3 4 吨左右 如上海复华骜妲公司鹃是需求器为 辫耩左右 臌然豁虢酋黢广泛鼹予食最 医薅 纯妆熬等 艇嚣生产酾羹鬟鼗援为爨难 嚣 两徐掺十分蜀爨 主擞在医鹫王业镬髑 嚣羲灏蠹测癸金照湃灞煞谷髓甘虢制蓊蒹料 全部依赖避蹯 主要楚由疆本协移生产静 如上海靛复华势效 云南的基爨积大裁药 和重庚药友制药等 其徐疆大豹在8 0 0 0 9 0 0 0 元 子竞 美藿艇e f 馥公司褒酋内懿销 售价掺为s 8 0 m s 9 元斤吏 国内层黻缺乏擞攫生产能力 墩没有国家审挞酌铡菱嚣 料生产 仅以精细纯工产蕊小批量供成 随着g s h 的生理生他功能和性质被不断研究发现 人 对其在朦药工业 食熬 工妲 俸育运动领骧及有关生物磺究领域上的兴趣褥疆蓝壤长 聪其霭求羹落梅不凝 增加 目前 谷胱甘肽的用途越来越广泛 就像阿司暇林 榉 几乎成为装其治疗与 江南大学硕士学位论文 n 乱b 鲫腑高密度培养及提高其胞j 訇昝胱甘胜含量的研究 保健作用的万能药 很显然 g s 鸯一个极其巨大的市场 1 2 国内外谷胱甘肽生产研究动态 1 2 1 谷弑曹肽的整产方法 擐了解 1 8 8 8 年 谷胱甘肽首先从酵母中分离出来 日本1 9 8 3 年进行了含箍较 多的谷胱甘肽酵母的生产 其后又研究了谷胱甘肽提取 分离技术及分析检测方法 目前国外实现谷胱甘肽规模生产 世界主要的氨基酸制造商k v o w a a i n o m o t n 和 d e g u s s a 等都相继投臣资于氨基酸的研究与开发 仅k y o w a l 9 9 8 年氨基酸的研究与开 发就耗费达1 9 亿美元 而谷胱甘肤是其霾点之一 曲o w a 目前是谷胱甘肽主要的供 应商 中国食品报 概括来说 馘前g s h 的生产方法主要有溶剂萃敬法 化学合成法 酶转化法和 发酵法 萃取法主要惹通过萃取和沉淀的方法扶含有g s 壬 的动植物缝织中迸行g s h 的分 蔫提取 蠹予原辩不器获得且g s 王 在缀织中的含量掇低 涮敬的g s 壬纯度鞍牧率不 蔫 灏此该法的实际寝用份墓不大 化学会戏法较旱斑用于g s 残豹生产 是将l 砖l 毽 l c y s 积g l y 经过一系歹l 纯学 爱应络台贱g s 爨兹该生产工艺虽然较为或熟 堡反应步骤多 反应封阕长 揉 馋过稷复杂 缛到的g s 消疑钵 左旋体积考旋体的混合物 鬟要进行光学摄分 分离十分困难且翳造成环境污染 因此 获德的g s 产品纯度不裹 生物效馀缀难 保持一致 虽然利用以上方法来生产g s h 在2 0 世纪五十年代左右就已经实现了工业 化 但居离不下的原材料价格及操作费用制约了这些方法的进一步发展 自2 0 世纪六十年代起 采用生物法进行g s h 的合成就日盏引起广泛的关注 酾本 早在七十年代就开始对生物法合成g s h 进行了大量研究 并公布了一系列相关专利 口2 1 一些大公司 如协和发酵 利用酵母发酵生产的g s h 更是早在八十年代年就取得 了中国卫生部的原料药进口许可文号 基本垄断了中阁市场 我国对g s h 的生产研究 还不够深入 屡然从八十年代末期至今 曾开展过从酵母中提取g s h 的研究 但由于 生产菌株中g s h 含量较低 提取豳难 成本造价高 故一直未能实现工业化生产 酶着g s 酬燕用领域的越来越广泛 对其需求羹也将不断增加 因此有关g s h 生物 合成的研究依然是生纯工程领域的一个热点印j 动植物缅胞 缁菌耥酵母均被糟于 g s h 静生物合成 觅诸文献报道的主要有 1 莉用微量元素 如锌 硒等 刺激微 生物缁胞大量生产g s 秘 2 4 j 2 嗣用发酵工程学原理 强遗微生物处于一定的生疆袄 态下 扶甭使g s 得到大羹积累f 2 5 0 6 3 逢过构建基函工程蕊合成g s 壬 f 2 秘 4 科角 罄定纯酶 细整 技术进行g s 王 的连续生产l 鹚等 生物法舍戏g s 疆蹇要有瑟耱途径 酶转化法稻发酵法 二誊黪共囤特点是首先要 鸯性憝建好匏微生物 然后髯列题细瞧中懿寒活性酶系在较为滠露瓣条l 睾下来实现 第 章糍论 g s h 静合成 二者藏主要静区剐在予黼法需要掇供三辩赢镶氮蘩酸和磊丁p 两发酵法 只癸供给微擞豫生长代谢所徽的营券物质 碳源 氮濑和无枫盐等 8 e 可安璐g s 在藏内瓣獠黎 1 3 妻鬟蘸法爱产答虢譬瑟臻窕冁鬓 发酵法麟鼹采魈壤徐斡糖癸原料 穰魈微生物体媳物毖 奄代澎途径来避抒g s l 生物台藏静方法 觳蒲税下 镦生穆缁麓中g s h 酶禽藿不窝 祆为予霪魏 o 5 l o 遵高含量的g s 酲容易黻环体内业已平衡的氧化还原环境旧i a s h 是臌 海产翰 实簿生产遭糕中需鬟进蠡提取 较繇瀚禽羹秃疑会丈夫撵熹叟产残零 颡武 发酵法室产髑酣的鬟键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的g 8 h 禽量 二者的 毒辘鲦台薅鸯褥子g s 疆产茧簿太藕庹筵嵩 缀熬密囊麓提窝霹莲蓬辩茨簿过程黎筑 纯茬蠲 毽耩离密艘络莽 获得 蔼施内g s h 含量的稳高通常是由菌种选宵来实现 魏 圭癸骞菰耱方法 是慕溪零瓣落变弯释连寒裹产蘑拣 二是稳麓逡簧互程技零 糨建熬鸯g s 辍合成辫活性豹蒸困工糯菌 出于发酵滚矫使掰的细菌或辩母容蕊培养 麴之生产方浚爱互艺煞不骜馥遴器竞罄 嚣捷慕爨簸垒穆发婪法b 戏为溪嚣g s 箍工 业化擞产斡鼹酱逮方法 辩母一羹是疆究戆曾选 其中爨酸澄酵姆爱受攀鼹 疆美蕊文靛掇瀵篷臻多 京 实际的发酵鬣产中 谯熊饯照的蘸秘仪仅是 个拜媲 还嚣要对发释避稷避行傣纯接 裂 娃最丈鼹度域发撵微生镪生产曼掭产秘熟潜力 l 获褥较裹懿产物浓度 霞予下 游处撩 较商的底物转纯率 降低鞭糖成本 籁较离弱生产强度 镶短发酵蹋蘩 霹榉熬实现黼疆工生g 化生产掰需要艄捷熬鲻艇 因韭乏瓣g s h 发酵过稷送行优化控掣 就显褥尤为羹凄 这方面韵礴究大都戆麸2 0 键纪丸卡年代戳詹开始的 主簧包括鹫 莽与蝰境条张忧化 发酵过程控制以及前体物质的添舰等内容 1 发熬条箨榄往籁过程整镧 生产g s 懿聪用的酵母大都是工业常用斟株 能狂很宽的焙券条佟下生长糌积鬃 g s 毪 瞧产蚤往袭穰稻 嚣魏 要慧遴一步撬囊链辩懿客戴娆力 搽蔹对涪养鏊中 静各辩营养成分懿及臻养条 串进行优化 在娥健的工蕊条件下进行生产 为最终的工 盈琵生产羹囊蒸薅 零研究鸯翌功元镰遣在诧方西开糯了研究 对c 棚船w s h0 2 0 8 发酵生产g s h 懿壤菸薹遵行了爨键 势量黠冀茨黎舔凌 滚震 费i 潦瓣鬣嚣接转藿 等逛毒霉了 磅竞 磅究绺果表臻 较往懿繇凌象斡对g s 辍合成都有较稍浆的促避作用弘哟 瘦予g s 糕蔗整惑产黪 辩驳在鬟寒叟产蘩拣蕤秀合藏磷薹垂麓力滟露薅 还嚣要 在发酵过程啦没法提攥细胞浓瘦 鞋掇高g s 薹熏静慈产量 为了实现邋一西标 必须 起大癜凌 热蔼莲糖 夔滚塞 堡是避褰翦蘩餐饕浓囊会搀裁凝藏驹生长荠囊器蠢产 物缮攀会大大下降 湖此鬟要采用渡煳培养青忒 盛绢毖较蒋逮戆通常有挺滤流翻 江南大学颁士学位论文 c 矗n d 渤 船高密度培养及提高其胞内咎胱甘肽古量的研究 指数流加和反馈控制流加等模式 恒逮流加是将葡萄耱以恒定的速率加入发酵罐 该 种流加策略简单易行 便于操作控制 指数流加可以通过控制比生长速率来实现将副 产物浓度蔽定在最低范国肉 殿馈控翻流如可以将瀛鸯g 速率与不同的物理参数 p h 溶解氧 c 0 2 产生速率和乙醇浓度等 相耦合而组成间接反馈控制系统 对工业生产 来说 静两者怒较为常覆豹流灏方式 2 前体物质的添加 己密豹研究结果表明 添鸯嚣 谷氮酸 己 半麓氨羧零曹笺酸等三释缝或氨基酸 及其混含物能提高细胞内g s h 的含量 其中以添加l 半胱氨酸的效果最为照著 a l 妻妇豫考纂了爱 理1 鼢 裙撵簸发酵生产g s 薹过程孛这三耱懿体氨基羧对g s 挺合残 的影响刚 结果表明l 半胱氨酸是提离g s h 比合成速率及g s h 产量的关键氨基酸 瞧超过一定的浓度会对缨庭生长寿部分孝零制作蠲 蒙困霹裴是虫子糖代谢过程孛一些 酶的活雠中心离子与过是的l 半胱氨酸发生螫合作用而使这些关键酶降低或失去了 活性 嬲此 农发酵过程中应采用l 拳赋氨酸驰於加策略以尽可能减少其对缨腿生 长的抑制 l 2 3 发薅法坐产谷莸镑菇磺究孛仍存在懿溺邋 产豚缓丝赘母 c 躐西 是发酵法工业化生产g s 辍魄首选菌株 在奉谖题舱蓑 期研究中 卫功元等主凝是优化c 甜f 船发酵条件以实现g s h 高产量 高得率和高 生产强度鲍相对统 然面 要进一步提高c r 豇括生产g s h 效率 傈涯g s 毛工业 化生产的高效运行 有阻下几个问题需鼹进行深入地研究 1 c 删胁其自身完善的氮基酸生物合成系统为g s h 的合成提供了充足的煎 幸奉物质 可以强胞内大鬃积累g s h p 习 为了增加g s h 产量 肖必要掇离细胞密度 丽流加发酵方式是较为理想的选择 但在流加培养过程中 要采用怎样的控制策略才 可敬获褥较高的细胞密度昵 这对最终实现g s 的高产量至关霾要 2 谷胱甘肽的生产有两个主要指标 一是谷胱甘肽总量 即菌体量与谷胱甘 虢魏连含量翡乘积最大纯 二避发酵嚣麓谷虢曾获含量商 醴便下游分离容易避行 因此在提高细胞密度的闷时 需要维持g s h 在胞内的高积累 才最终有可能实现g s h 工盈纯生产 磷究结票裘翳 魏俸氨辇酸静添掘对蠲藏积累g s 壬 具有一定静较稷 睾 用 三种前体氨簇酸在添加策略上需要进行怎样的考虑 才能在细胞高密度发酵的的 阕对 壤拷较翥静g s 辩瓣慈态含量 这是实瓒g s 王 王犍纯戆关键瘊在 3 微生物细胞本身是一个经济的体系 不会在胞内过量积累某一代谢产物 g s 壬 合戏特性麓怎样数疆 当缍憝楚予一手孛受伤害的生理状态下 蠢予镰护熬窘躲 本能和抵御外界的伤害 会对其代谢产物做出调整 研究受胁迫下细胞是如何合成 g s h 将为g s 差合成掇供一耱褒论蔹攥 缓热裂鼹微生物缨腿瓣这穆生理学特性 利用目标产物作为外界条件胁迫作用下的响应物或抵御胁迫作用的作用物 人为的提 第一章绪论 供邋当的环辘刺激 将商望提高耳栝产物g s h 的产攮 1 3 零论文勰主要磷究内容 l 乍是泛芬省高校赢舞技沭产建发袋矮毯 徽生物发簿法生产谷髋营黢 编号 j h 0 2 1 0 1 的予谖题 零论文在实验蹇娥摸上馘 株缝衣戆波蔫积累谷髋曹鼹静产黥 假丝酵堪 c 蟛函w s 薹 8 2 i 姻 为生产蘧掾 以实现g s h 的离效生产 双鬻密瘦发 酵 添加前髂氨基酸 氧胁迫等三个方藤进行系统鞠深入款磷究 鬃髂磷变内容主要 分为以 f 几个部分 1 在7l 罐上考察分批发酵条 串及流加发酵条 牛 恒速流身n 移撩数流趣 瓣 c f 以r 发酵生产g s h 的影响 确定较为适寅的c 淞高密度发酵生产条件 以获 褥较高豹缩魏密度 2 在控制高的细胞密度的同时 需要维持较黼的g s h 的胞内含量 因此 为 了遴一多提翥g s 王 静总产羹 在培葵基中勰入g s 秘合成过程孛蔚三释蓊俸氨基酸 并结合高密艘发酵 眈较三种前体氨基酸对g s h 合戚的影响 g 岛hc o h 地 f 鱼兰垡 翌 1 0 0 1 0 v g r o 第 章流加培养对绷脆高密葭发酵生产昝觥甘肽的影响 2 4 结果冀讨论 2 毒 l 势箍雅券下答璇曾聚的发酵避程 酸漩是榜或缨腿释爸麟苗默戆磷絮爱畿璧寒潺 豁麓首羧蹩一舔腿海产物 在谷 赋越黢分批发酵过糕中 磺濑 蘩麓糖 浓痰决定菪培葬基黥碳氮蹴 蘸接澎稿到缩 臆驰燃骧速壤 但是较赢的初糖浓度会影嚷酵母细臌合藏谷麟首默的链力 扶瑟导致 胞内g s 含鼓明显降低 面较低的初糖浓度又会限割绷熙熬生长 不能鬻到较高浓凄 的细胞爨 避丽影响奄赋甘髓的总产量 因此沁了锚副较态的缨慰燃宰翻g g 芦犟 首先考察了两种韧糖浓度 3 0g l 1 j 口5 0g 辩答麟甘肢鲍发酵过程 当初糖浓度为3 0g l 时 c 埘触w s h0 2 0 8 细胞生长情况和g s h 合成的过程觅 图2 1 毫 量 蟮 鬏 鹊 夏 061 2l s2 4 发辩时鲻 h o61 21 82 4 菠辩群港艇 图2 1 分批培养方式下的g s h 发酵过程 f l 垂2 一 嚣m 斟 g s h b 戤o h 缸携铋瓣i 姆 溅融w s 辩0 2 g g s hc o n c e 蝴 i o n i 抖妇c e l l u l 瓣g s hc e n t o g 糖c o s e 纛凝w 图2 l 表明 随饕发酵的进行 细胞快速生长 a s h 也不断合成 葡麓糖浓发遗 速下降 在发酵i 2h 瑶基本就被耗完了 缁臆生长也捆应趣停止了 获酵结康薅 纲 胞千熏 d c m 达到1 5 1g l 1 胞内g s h 含量程细胞进入平衡期前基本维持在1 2 左 右 巍囊藏停正垒长嚣 飚肉g s 壬 含羹最终上舞至l 8 4 爵s 壬 最终产鬟为2 7 5m g t o 造成这种现象的艨因可能是由于细胞停止生长詹 为了阻止自身被氧化降解两继 续避燕合成g s h 隘维持麓凑台适静氧纯还撅虢态剐l 在缨藏酌瓣鼗生长黧 培养基 中的营养物攒主要篇予构建绷胞体 衙细胞生长的高速度又部分影响了胞内g s h 的合 裁巍力 瓣戴藏蠹g s 鞋含篷程这羚段基本没麓变镪 释之螽隧着g s 貘赘过藿合成 熬 蠹g s 辍含蹩不断提高 襄想获褥较鑫翡缍戆量秘g s 掰2 攫 螫颁提蔫鬻 麓糖弱洪绘 考察当蟊耱浓爱撵 嵩至s og 0 1 辩 g s 辩熬发酵避程冕瀚2 2 江南大学硕士学位论文 枷出 耐u 高密度培养及提高其胞内谷胱甘肽含量的研究 4 0 0 一 量3 0 0 三 宇2 0 0 奎 吾m 0 061 21 82 4 发酵时间m o61 2j 82 4 发酵时间 h 图2 2 分批培养方式f 的g s h 发酵过程 f i g 2 2 t i m e c o u r s eo f g s hb a t c hf e r r n e n t a t i o nb yc m hw s h 0 2 一0 8 g s hc o n c e n t r a t i o n i n n a c e l l u l a rg s hc o n t e n t o g l u c o s e d c w 图2 2 表明 葡萄糖在1 6h 后基本就被耗完了 细胞干重最高达2 2 1g l 1 当细胞 停止生长后 胞内g s h 含量继续上升 最高达到1 5 1 g s h 最终产量为3 3 6m g l 虽然随着葡萄糖浓度的增加 葡萄糖的平均消耗速率相应提高 但与之相对的是 细 胞对葡萄糖的得率以及g s h 胞内含量均有所降低 说明较高的初糖浓度影响了酵母细 胞的生长以及合成g s h 的能力 初糖浓度为3 0g l 1 时 细胞得率和胞内g s h 含量都 比较高 所以初糖浓度选择为3 0g l 1 左右是比较合适的 由于分批培养方式提供的葡萄糖量有限 限制了细胞的进一步生长和g s h 的合 成 难以实现g s h 的高产 因此有必要采用流加发酵的方式来解除高糖浓度对细胞生 长的抑制并补加细胞生长和产物合成所需的碳氮源 提高细胞生长量 以期进一步提 高目标产物g s h 的产量 2 4 2 恒速流加发酵对细胞合成谷胱甘肽的影响 从分批发酵结果看出 当初糖浓度为3 0g l 时 在g s h 分批发酵进行到1 2h 培养基中的葡萄糖已耗尽 为了进一步提高细胞浓度和g s h 产量 需要向培养基中 补加一定的碳源 以满足菌体生长和g s h 合成的需要 恒速流加作为较简单的底物 补加方式 在合适的补糖速率下可以用于细胞的高密度培养 进而实现提高代谢物产 量的目的 前人研究发现 当葡萄糖在发酵液中开始有积累时 细胞生长速度便有所减慢 可能是因为细胞旺盛的代谢能力合成了大量的c 0 2 而发酵液中高浓度c 0 2 的存在 能够抑制细胞的生长和代谢而引起葡萄糖消耗速度减缓 4 因而导致葡萄糖积累 为 了维持较高的细胞生长速率 实验中研究了三种不同葡萄糖恒定流速下g s h 的发酵 过程 首先考察以较低的流加速率流加葡萄糖时 g s h 发酵过程中各种参数的变化情 况 采用的葡萄糖流加速率为2 g l 1h 流加起始时间为发酵1 2h 后 流加持续 时间为2 4h 总发酵时间4 8h 结果见图2 3 一蛾妊星壁工 o 4 3 2 o 笨 二章流如培养对蹦艟商密受发酵生产符虢讨默钓影响 f 刚缸g 多 h 静乱 世碧 01 22 43 5 嚣 麓酵对瓣南 4 0 0 1 2 2 4 3 64 9 发酵对湖概 3 8 2 墓 嚣 8 鎏 0 图冬3 葡萄耱低速濂加葬重g s l 静发酵过程 f i 丞2 3 孙m e c o 埘s e so f g s h 确m e n t a t i o nu n d 盯l o wg l u c o s ef e e d i n gr a t e g s he 撇瓣蕊 i 赡葛o e l 圭u 瓣g s h n 话斌o g l 驻 s e 虻w 图2 3 袭明 尽嚣从发黪1 2b 越藏以恒定流速不叛送行越莓糖熬滚加 懿发簿波 串的葡萄糖浓度一妻维掺在很低的水平 说姨艇入韵裁麓糖被蘸体遨遮淡耗 滚烟结 束詹d c w 燎商达到3 7 4g l 在滤加阶段 g s h 的腿肉含爨一囊维捺在1t 2 左右 当流加继束斌 g s h 在服内的含量开始升赢 g s 王鼓憋产量为6 4 5 m g l 一 胞内g s l 禽羹为1 7 3 尽管鼹流加速率下g s 拜的发酵水平魄分批发酵过程霄了较大靛爨赢 但是葡萄糖加入堪还不能完全满足菌体生长茅 g s h 合成的需要的 所以有必要进 步强商葡萄耱豹流翔速率 为j 眈 考察当葡萄耱流加速率增加为4 7g l 1 h o 时对g s h 发酵的影响 发酵过 程觅濯2 9 0 善 囊 誉s 辨 o 01 22 车3 64 9 箜辩霹瓣盎 o1 22 43 64 8 赞酵瓣鼢 3 2 2 4 一 毫 1 6 嚣 嚣 r 静 o 图2 0 葡萄糖中速滚热时的g s h 发酵过糕 f 培2 4 下 n l e c o u f s e so f g s hf e h n e 熊n i 鲫u 桶钟m e d i 啪搿 s ei 如d i n g 础 g s 差c o n 仃嘶o n i 神舶c e l u mg s hc o n t e n t o g l u c o s o 黼w 鹭2 毒黪浆表臻 发酵1 2 孰居 残耱浓度羧透予零 燕薅避孬蘩蕊糠夔流浆对 缨 鼹刹耀甍莓耱的遽黢锯然缀状 糖入粒营莓糖基本教宠全清耗 转e w 最赢麓为5 5 6 g 0 1 滚掘缭紊嚣 缨戆篷开始下黪 蟹谷髋苗黢静题态窘擞器姣上舞 最终发酵绪 泰鲇豁胱越肽的产量为8 1 6 麟 l 1 豁赋营默在愍表禽量达l 稚 袋簿鼗漉遽道行 始 站 埒 o 一靠一瓣睁鹫鞯 一蚤嘲姆磷瓣墓许婚 2 l o 谢 渤 掰 粥 一 锥毒麟散蹬 碑o 江南大学硕士学位论文 c a 一击出 f 甜括高密度培养及提高其胞内谷胱甘肽含量的研究 葡萄糖流加时 菌体增殖很快 发酵液中基本没有残糖积累 将葡萄糖流加速率继续提高 葡萄糖的恒定流速为1 0 1g l h 一 发酵结果见图 2 5 从图2 5 看出 以较高的速率进行葡萄糖的流加时 残糖在发酵液中逐渐积累 随发酵的进行 残糖浓度最高达到2 6 8g l 1 左右 停止流加后才逐渐下降 说明细胞 利用糖的速率没有那么快 当流加开始后 g s h 在胞内的含量呈下降趋势 结果说明 较高的残糖浓度严重影响了细胞的生长和g s h 的积累 细胞量最高