基于三种药用植物内生细菌的多样性研究.doc

基于三种药用植物内生细菌的多样性研究 李晶 南阳理工学院河南省南阳市473004 【摘要】目的：分析研究三种药用植物内生细菌的多样性。方法：选择生长在强辐射且温度波动大、海拔高环境下的党参、连翘、黄芪这三种青藏高原移栽药用植物作为本次研究的对象，通过分子生物学技术及分离培养方法等手段，对上述三种药用植物内生细菌的状态、遗传多样性等方面内容加以研究。结果：连翘、黄芪及党参这三种药用植物中，皆存在内生细菌且菌群类型非常丰富；其内生细菌由HGC、-proteobacteria、CFB、厚壁菌门组成；具有耐盐性，且存在对抗生素的抗药性。结论：本次研究结论有利于更清楚、全面的认知在极端环境下，植物内生细菌的生理特性、菌群结构，可丰富青藏高原药用植物内生细菌资源。 关键词党参；黄芪；连翘；生细菌；多样性 青藏高原太阳辐射较强、氧气不充足，由于受到低温及干旱的天气影响，动植物在这里很难生长。本次研究的党参、黄芪、连翘三种植物均喜凉爽气候，抗旱、抗旱能力较强，其地下根系发达，可有效固土、防风。随着人们对药用植物需求量的逐渐扩大，发展人工种植药用植物也变得重要起来。虽然就药用植物的栽培技术与育种等方面来说有了很多研究结果，但在与微生物及药用植物间的研究却相当匮乏1。本次研究通过微生物、分子生物学手段，对三种药用植物内生细菌的多样性进行研究。 1资料与方法 （1）植物选择。试验所用党参、黄芪、连翘，均未见有病害症状，无冲孔，根际土应同时带回。 （2）内生菌的分离、纯化。分别取黄芪、党参及连翘三者1g植物叶片，做无菌水冲洗处理，并使用滤纸将水分完全吸净；依次再做如下处理：持续30s1min的70%酒精表面消毒，无菌水冲洗处理；8分钟10分钟的1升汞浸泡，做彻底消毒处理，并无菌水冲洗；取200ul（最后一次冲洗叶片）的无菌水，涂抹在LB固体培养基平板上，并在28的外部条件下，持续培养3d，最后检测表面灭菌效果。 对已经做好了表面灭菌处理的植物叶片进行研磨，并借助于逐级稀释法，将其稀释到浓度保持在105倍，在LB培养基上，涂布200ul不同稀释浓度的匀浆液。浓度不同做三次重复，在外界温度为28的条件下，培养时间持续2天；记录每个平板上菌落的数量，同时依据菌落的大小、颜色以及形状等形态内容，选择存在差异的菌落，将其放于相同的培养基平板之上，进行纯化培养；将纯化培养之后的细菌接种与相对应培养基的斜面上，于4的条件下保存。 （3）内生细菌16SrDNA序列测定、同源性对比。做16SrDNA基因测序时，选取有典型RFLP带型的菌株，序列长度设定为1500bp，对比采用BLAST，最终确定伴有较高同源性的16SrDNA序列；应用CLUST-ALX做序列对比。 （4）适合PH值的测定2。取培养至对数生长期的各菌原液共100ul，将其加入到PH值分别为4.0、5.0依次直至11.0的5lLB液体培养基中，在28条件下，经过持续24h的培养之后，观察细菌生长情况。 （5）耐盐性。取培养至对数生长期的各菌原液共100ul，将其加入到NaCL浓度分别在5%、7%、9%、11%的5mlLB液体培养基中，培养1天后，对其浑浊度进行观察。 （6）抗药性。取四环素、利福平、卡那霉素、链霉素、羧苄青霉素、庆大霉素的抗生物纸片，取200ul培养至对数期的菌液加入到LB固体培养基中均匀涂布，将抗生素纸片放入其中，于28条件下培养72h，观察菌株生长情况。 2结果 （1）内生细菌分离的结果。经分离结果表明，培养基中生长出了大量形态各异的菌落。这也说明，黄芪、党参、连翘这三种药用植物的叶片组织不仅存在大量内生细菌，而且其内生细菌的类群十分丰富。分离共获得42株内生细菌。依据其不尽相同的形态加以归类。在分离出的内生细菌中，存在有83.3%的菌株可产橘红、肉红以及黄色色素。 （2）内生细菌遗传多样性。三种药用植物分离出的内生细菌具有较近的亲缘关系；内生细菌可分为四大类群，即包括HGC（高G+C含量的革兰氏阳性细菌）、-proteobacteria、CFB（黄杆菌/嗜纤维菌/拟杆菌群）、厚壁菌门（Firmicutes），种属类型丰富。 （3）适宜PH值。三种药用植物内生细菌均不适宜在较强酸性的环境下生长，在PH值为7.09.0的中性偏碱性环境下可获得较好长势。 （4）耐盐性。本次研究中各菌株在NaCL浓度为0%8%的培养基中均可成长，说明菌株耐盐性极强，均为耐盐菌。 （5）抗药性。党参、黄芪、连翘三种内生物细菌皆存在对抗生素的抗药性，可丰富其生物学作用。 3讨论 本次研究对黄芪、连翘及党参这三种青藏高原药用植物内生细菌做了一些研究，在借助于各项检测手段的基础上，分析了植物内生细菌与环境的关系，就其本质来说，属于对所处环境的适应性。这也在一定程度上给我们开辟了新思路去认识植物内生细菌，还需深入进行探索。 参考文献 1方晓梅,张玉琴,魏玉珍等.药用植物内生细菌的多样性及其抗HIV活性次级代谢产物的初步筛选C.第四届全国微生物资源学术暨国家微