（遗传学专业论文）半滑舌鳎mhcⅡb两型基因的克隆、多态和表达研究.pdf

半滑舌鳎m h c b 两型基因的克隆 多态和表达研究 半滑舌鳎m h ci i 厅两型基因的克隆 多态和表达研究 摘要 半滑舌鳎 c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s 是一种重要的经济鱼类 具有生长快等 优点 近年来 对其研究主要集中在养殖 发育 群体遗传等方面 对其重要的 功能基因如免疫相关基因还知之甚少 主要组织相容性复合体 m h c 是脊椎 动物中普遍存在的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群 因其在免疫系统 中的重要作用而备受关注 目前已在多种鱼类中扩增得到m h c 基因 本文利用 r a c e 技术得到半滑舌鳎m h ci i 类曰基因的e d n a 全长 同时扩增研究了其多态 性 发现了该基因的两型 获得了两型的基因组全长和表达情况等 首先 从实验室构建的半滑舌鳎e d n a 文库中得到了m h ci i 类b 基因的完 整开放阅读框 o p e nr e a d i n gf r a m e o r f 利用r a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s r a c e 技术得到了该基因的c d n a 全长 共1 2 1 5 b p 其中o r f 7 5 0 b p 5 末端非翻译区 u n t r a n s l a t e dr e g i o n u t r 2 8 b p 3 u t r4 3 7 b p 在编 码的2 4 9 个氨基酸中 前2 1 个氨基酸组成信号肽 第2 1 5 到2 3 7 位氨基酸为跨 膜区域 在p l 和p 2 区有4 个保守的半胱氨酸残基 生物软件分析表明 该基因 编码的氨基酸有1 个n 连接的糖基化位点 4 个蛋白激酶c 磷酸化位点 6 个酪 蛋白激酶i l 磷酸化位点 2 个酪氨酸激酶磷酸化位点 4 个豆蔻酰化位点等保守 结构 二级结构显示该基因编码的蛋白为混合型蛋白 三维结构和人的d r b 的 三维结构非常相似 序列比对发现半滑舌鳎m h ci ib 蛋白和牙鲆 大菱鲆 三 刺棘鱼等的m h ci ib 一致性较高 进化树中首先跟三刺棘鱼聚在一起 然后和 牙鲆 大菱鲆 大黄鱼等相聚 设计位于o r f 两侧的引物 用高保真酶从9 条鱼中扩增该基因的o r f 挑 取阳性克隆进行双向测序 结果得到2 4 个非重复序列 这些序列在核苷酸水平 上存在明显差异 进化树中聚为两支 分别命名为m h c c y s e d a b l 和 m h c c y s e d a b 2 其中m h c c y s e d a b l包含 1 4种等位基因 c y s e d a b i o 1 0 1 c y s e d a b i 1 4 0 1 m h c c y s e d a b 2 包含8 种等位基因 c y s e d a b 2 0 1 0 1 c y s e d a b 2 0 8 0 1 两型均在p 1 区的变异最大 且核苷酸变 异多为非同义替换 因此 2 4 种不同的核苷酸序列产生了2 2 种等位基因 还有 两个序列在氨基酸水平上分别和c y s e d a b i 0 1 0 1 c y s e d a b 2 0 2 0 1 一样 但核 半滑舌鳎m h ci ib 两型基因的克隆 多态和表达研究 苷酸序列存在差异 将其分别命名为c y s e d a b i 0 1 0 2 c y s e d a b 2 0 2 0 2 其中 c y s e d a b l 各等位基因的距离为0 4 6 7 c y s e d a b 2 各等位基因的距离为0 4 8 5 c y s e d a b l 各等位基因与c y s e d a b 2 各等位基因的距离为8 5 1 6 6 另外 还发 现两个缺失突变的等位基因 分别缺失2 b p 和7 b p 推测为假基因 在核酸水平 上分别属于c y s e d a b l 和c y s e d a b 2 因此分别命名为c y s e d a b l p s e l c y s e d a b 2 p s e i 在检测的9 条鱼的m r n a 水平上除l 条检测不到c y s e d a b 2 的表达外 其余均能检测到两型的表达 同时 克隆研究了其中一个个体的3 u t r 发现有2 种3 u t r 序列 c y s e d a b l 和c y s e d a b 2 各有1 种 表明两型各至少存在一个位点 但两型之 间的3 u t r 区差异不大 仅存在2 个核苷酸变异和l b p 长度差异 随后扩增研究了5 个个体的内含子1 得到两型的内含子1 各5 种 每型的 内含子1 分别聚成一支 差异明显 表明两型各至少有5 个位点 个体分析表明 每个个体每型各至少有1 2 个位点 利用5 和3 u t r 的引物和e x t a q 扩增得到两型的基因组全长 两型均由6 个外显子 5 个内含子组成 均约2 4 k b 在外显子的长度和分布上完全一致 但两型之间和型内内含子的长度和核苷酸存在较明显差异 两型的内含子除内含 子1 可以作为划分两型的依据外 其它内含子因差异不明显或存在两型的交叉 都不适合作为划分依据 在内含子1 2 4 中发现了微卫星序列 内含子的多态 也再次说明了该基因的高度多态现象 在m r n a 水平检测不到c y s e d a b 2 表达 的s 1 个体 也扩增得到了c y s e d a b 2 基因组全长 没有发现剪切突变或缺失 插入突变 推测c y s e d a b 2 的表达可能和生理状态有关 用r t p c r 分别检测两型在不同组织和不同发育时期的表达 结果发现两型 在不同组织的表达情况类似 在大多数组织中 肝 脾 肾 鳃 脑 心 肠 卵巢 精巢 都表达 而且在脾 肾和心中表达量都较高 在肌肉和鳍中检测不 到 但是c y s e d a b 2 在鳃 肠 卵巢和精巢的表达不及c y s e d a b l 高 在发育 时期中 c y s e d a b l 在受精卵 原肠胚 眼芽和孵化后5 2 2 天有表达 且在孵 化后5 天表达开始呈现略微下降的趋势 但相同条件下检测不到c y s e d a b 2 型 在发育时期的表达 说明两型在功能上存在一些差异 关键词 半滑舌鳎 m h c i l 类最多态 两型 表达 半滑舌鳎m h cl j 曰两型基因的克隆 多态和表达研究 cio nin g p oiy m o r p his ma n de x pr e s sio ns t u d yo ft w o s u b t y p e sm h ccia s si ibf r o mh a if s m o o t ht o n g u es oie c y n o g o s s u ss e m i a ev i s a b s tr a c t h a l f s m o o t ht o n g u es o l e c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s i sa l li m p o r t a n te c o n o m i cf i s h a n dh a sm a n ys t r o n g p o i n t ss u c ha sg r o wf a s ti na q u a c u l t u r e r e c e n t l y t h e r ea r em a n y s t u d i e sf o c u so ni t sa q u a c u l t u r e d e v e l o p m e n ta n dp o p u l a t i o ng e n e t i c s b u tl i t t l ei s k n o w na b o u ti t s i m p o r t a n tg e n e s s u c ha si m m u n e r e l a t e d g e n e s m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x m h c e n c o d e si m m u n o g l o b u l i n l i k er e c e p t o r si nn e a r l y a l lv e r t e b r a t ea n di sh i g h l yp o l y m o r p h i cg e n ef a m i l y i ti sg i v e n g r e a ta t t e n t i o nf o ri t s i m p o r t a n tr o l e si ni m m u n es y s t e m s a tp r e s e n t m a n ym h cg e n e sa r es t u d i e di n s e v e r a lk i n d so ff i s h e s t h i sp a p e rd i s c u s s e dt h ee d n ao fm h cc l a s si ib g o tf r o m h a l f s m o o t ht o n g u es o l e s t u d i e di t sp o l y m o r p h i s m d i s c o v e r e dt h et w os u b t y p e s a n d s t u d i e dt h et w os u b t y p e s s p e c i f i cg e n o m i co r g a n i z a t i o na n d e x p r e s s i o np a t t e m f i r s to fa l l t h eo p e nr e a d i n gf r a m e o r f o fm h cc l a s si ibw a sg o tf r o mt h e e d n al i b r a r yo fh a l f s m o o t ht o n g u es o l ec o n s t r u c t e db yt h el a b a n dt h e nt h ef u l l e d n a s e q u e n c ew a sg o tb yu s i n gr a c e r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s r a c e t h ee d n a c o m p r i s e sa2 8 b p5 u t r u n t r a n s l a t e dr e g i o n u t r a7 5 0 b po r fa n da 4 3 7 b p3 u t r t h ef i r s t2 1p u t a t i v ea m i n oa c i d sf o r mt h es i g n a lp e p t i d e a n dt h e 2 15 t h 2 3 7 t ha m i n oa c i d sc o n s t i t u t et h et r a n s m e m b r a n er e g i o n t h e r ea r ef o u r c o n s e r v e dc y s t e i n e si nt h epla n db ed o m a i n a n da l s oo n en g l y c o s y l a t i o ns i t e f o u r p r o t e i nk i n a s ecp h o s p h o r y l a t i o ns i t e s i xc a s e i nk i n a s ei ip h o s p h o r y l a t i o ns i t e t w o t y r o s i n el i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t ea n df o u rn m y r i s t o y l a t i o ns i t ei nt h ep u t a t i v e a m i n oa c i d t h es e c o n d a r ys t r u c t u r es h o w st h a tc l a s si ib p r o t e i ni sam i x e dp r o t e i n a n di t st e r t i a r ys t r u c t u r ei sv e r ys i m i l a rt oh l a d r b i t sp u t a t i v ea m i n oa c i di d e n t i t y i sq u i t eh i g h i t l lt h es a m eg e n ef r o mt h r e e s p i n e ds t i c k l e b a c k j a p a n e s ef l o u n d e ra n d t u r b o t a n di tc l u s t e r sf i r s t 谢t ht h a tf r o mt h r e e s p i n e ds t i c k l e b a c k t h e n 诵t l lj a p a n e s e f l o u n d e r t u r b o ta n dl a r g ey e l l o wc r o a k e ri np h y l o g e n e t i ct r e e w h i c hd e m o n s t r a t e 半滑舌鳎m h ci ib 两型基因的克隆 多态和表达研究 h a l f s m o o t ht o n g u es o l e sc l o s e rr e l a t i o n s h i pw i t ht h o s ef i s h e s t h e no r fp o l y m o r p h i s mw a ss t u d i e db yu s i n gp r i m e r si n5 u t ra n d3 u t ra n d l l i g hf i d e l i t yp o l y m e r a s ef r o m9i n d i v i d u a l s p o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e df r o m b o t l ld i r e c t i o n s w h i c hr e s u l t e di n2 4n o n r e d u n d a n ts e q u e n c e s t h e r ea r ea p p a r e n t d i v e r g e n c ea m o n gt h o s es e q u e n c e s w h i c hc l u s t e ri n t ot w os u b g r o u p s a n dn a m e da s m h c c y s e d a b la n dm h c c y s e d a b 2 r e s p e c t i v e l y m h c c y s e d a b li n c l u d e s 14 a l l e l e s w h i l em h c c y s e d a b 2i n c l u d e s8a l l e l e s a n dt h em o s tv a r i a b l er e g i o ni sp 1 d o m a i n m o s to ft h es u b s t i t u t i o n sa m o n ga l l e l e sa r en o n s y n o n y m o u s w h i c hl e a dt o2 2 a l l e l e sf r o mt h e2 4s e q u e n c e s t h e r ea r ea l s ot w os e q u e n c e s w h i c hd i f f e rf r o ma l lt h e o t h e rs e q u e n c e si nn u c l e o t i d e s b u th a v et h es a m ep u t a t i v ea m i n oa c i d sa s c y s e d a b l 0 101a n dc y s e d a b 2 0 2 0 1 r e s p e c t i v e l y s ot h e y 黜n a m e da s c y s e d a b l 木0 1 0 2 a n dc y s e d a b 2 奉0 2 0 2 r e s p e c t i v e l y t h e i n t r a g r o u p a l l e l e s d i v e r g e n c ei nc y s e d a b la n dc y s e d a b 2i s0 4 6 7a n d0 4 8 5 r e s p e c t i v e l y a n dt h e i n t e r g r o u pa l l e l e sb e t w e e nc y s e d a b la n dc y s e d a b 2i s8 5 16 6 s t i l l t h e r ea r e a n o t h e rt w os e q u e n c e sw h i c hh a sad e l e t i o nm u t a t i o no f2 b pa n d7 b p r e s p e c t i v e l y a n da r ep r e s u m e da sp s e u d o g e n e s f o rt h e yh a v es i m i l a rn u c l e o t i d es e q u e n c ea sf r o m c y s e d a b l a n d c y s e d a b 2 s ot h e y a r en a m e da s c y s e d a b l p s e l a n d c y s e d a b 2 p s e l r e s p e c t i v e l y a n dm o s to ft h ei n d i v i d u a l se x p r e s s eb o t ho ft h et w o s u b t y p e s e x c e p tt h es 1i n d i v i d u a lw h i c hc a n n o tb ed e t e c t e dt h ec y s e d a b 2 s e x p r e s s i o n a tt h es a n l et i m e 3 u t rw a ss t u d i e da n dt w ok i n d so f3 u t rs e q u e n c e sw e r e d i s c o v e r e d i tt u r n so u tt h a te a c hs u b g r o u po w no n e3 u t rs e q u e n c e w h i c hi n d i c a t e s t h a te a c hs u b g r o u ph a sa tl e a s to n el o c u s h o w e v e r t h ed i v e r g e n c eb e t w e e nt h et w o 3 u t rs e q u e n c ei ss m a l l w h i c hi n c l u d e so n l yt w ob a s e p a i rv a r i a t i o n sa n dl b p d i f f e r e n c ei nl e n g t h t h es t u d yo fi n t r o n1f r o m5i n d i v i d u a l si n d i c a t e ss i m i l a rr e s u l t s i n t r o n1f r o mt h e s a m es u b g r o u pc l u s t e rf i r s ta n dd i s t i n c td i f f e r e n c ew a sd i s c o v e r e db e t w e e nt h et w o s u b g r o u p s f i v ek i n d so fc y s e d a b li n t r o n la n df i v ek i n d so fc y s e d a b 2i n t r o n l s e q u e n c e sw e r eg o t w h i c hi n d i c a t et h a te a c hs u b g r o u ph a sa tl e a s t f i v el o c ia n d i n d i v i d u a ls t u d ys h o w st h a te a c hi n d i v i d u a lh a sa tl e a s to n et ot w ol o c io fe a c h i v 半滑舌鳎m h ci ib 两型基因的克隆 多态和表达研究 s u b g r o u p t h eg e n o m i cw h o l el e n g t hw a sg o tb yp r i m e r si n5 u t ra n d3 u 1 r i 己a n de x t a q n t u r n so u tt h a tb o t ht h et w os u b t y p e sc o n s i s to fs i xe x o n sa n df i v ei n t r o n s b o t ho f w h i c hs p a na b o u t2 4 k b t h et w os u b t y p e sh a v et h es a m ee x o nl e n g t ha n dd i s t r i b u t i o n b u th a v eg r e a td i v e r g e n c ei nt h ei n t r o nl e n g t ha n ds e q u e n c e ns h o w st h a to n l yi n t r o n lc a nb et h e p a r a m e t e rt od i s t i n g u i s ht h es u b g r o u p s a l l o t h e r sc a n n o tf o rt h e s i m i l a r i t ya n dc r o s s o v e ri nt h en u c l e o t i d es e q u e n c e s t h e r ea r ea l s om i c r o s a t e l l i t e si n i n t r o n1 2a n d4 t h e g e n o m i cs e q u e n c eo fc y s e d a b 2f r o ms1i n d i v i d u a lw a sa l s o g o t a n dn om u t a t i o ni nr n as p l i c i n ga n dn od e l e t i o n i l n s e r t i o nm u t a t i o ni no r fw a s d i s c o v e r e d w h i c hs h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fc y s e d a b 2m a yb er e l e v a n tt ot h e b o d y sp h y s i o l o g i c a le n v i r o n m e n t t h ee x p r e s s i o np r o f i l eo fd i f f e r e n tt i s s u e sa n dd e v e l o p m e n t a ls t a g e sw e r es t u d i e d b yu s i n gr t p c r n 圯t w os u b t y p e sh a v es i m i l a re x p r e s s i o np a t t e mi nd i f f e r e n t t i s s u e s a n de x p r e s si nm o s tt i s s u e s 1 i v e r s p l e e n k i d n e y g i l l b r a i n h e a r t i n t e s t i n e o v a r ya n dt e s t i s a n dh a v eh i 曲e x p r e s s i o ni ns p l e e n k i d n e ya n dh e a r t w h i l et h e e x p r e s s i o ni nm u s c l ea n df mc a n n o tb ed e t e c t e da n dc y s e d a b 2h a sal o w e r e x p r e s s i o ni ng i l l i n t e s t i n e o v a r ya n dt e s t i st h a nc y s e d a b l i nd e v e l o p m e n t a l s t a g e s c y s e d a b lc a nb ed e t e c t e di nf e r t i l i z e de g g g a s t r u l as t a g e e y eb u ds t a g ea n d 5 2 2d a ya f t e rh a t c h i n g a n dh a sad r o pf r o m5d a ya f t e rh a t c h i n g w h i l ec y s e d a b 2 c a n n o tb ed e t e c t e du n d e rt h es a m ec o n d i t i o n w h i c hi n d i c a t et h a tt h et w os u b t y p e s m a yh a v ed i f f e r e n tf u n c t i o n s k e yw o r d s h a if s m o o t ht o n g u es ole c y n o g l o s s u s s e m i l a e v i s m h c c ia s si i 厉p o i y m o r p h i s m t w os u b t y p e s e x p r e s s i o n v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本 在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含未获得 洼 垫趱查基丝 置墓塑4 直盟鳆 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料 与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均己舀e 论文中作了明确的说明并表示谢意 剿拢刘睹鹳 飙拌日期 泗8 年铜罗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或 扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同时暌权中国科学技术信息研究所将本学位论 文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向社会公众提供信息服务 保密 的学位论文在解密后适用本授权书 撇作糍 獬 签字日期 瑚年6 月7 日 房 尹 彩 蝴搬啡 安 增 字 期 签 日 师 字 导 整 半滑舌鳎m i i ci ib 两型基因的克隆 多态和表达研究 第一章文献综述 我国有着悠久的水产养殖历史 是水产养殖大国 是世界上唯一养殖总产 量超过捕捞总产量的国家 其中的海水鱼类养殖是继藻类 虾类 贝类养殖之后 发展起来的新兴产业 被称为海水养殖的第四次浪潮 由于海水鱼类的养殖附加 值大 市场价格高 消费量大 因此海水鱼类的养殖发展迅速 后劲足 南方的 海水鱼类养殖以大黄鱼 鲷 石斑鱼等为主 北方的海水鱼类养殖以鲈鱼 鲆鲽 鱼类 牙鲆 大菱鲆 为主 2 0 0 4 年全国鲆鲽鱼类苗种产量1 亿多尾 养殖产量达 4 万多吨 据不完全统计 2 0 0 5 年我国鲆鲽鱼类苗种产量超过4 万吨 而之后 半 滑舌鳎的养殖也迅速兴起 其育苗和养殖技术已逐渐成熟且进入了产业化阶段 如在2 0 0 5 年 半滑舌鳎的商品苗总量年突破5 0 0 万尾 孙中之等 2 0 0 6 但是在我国海水养殖业中仍然存在不少问题和困难 特别是基础研究薄弱 病害频发 缺少抗病优良品种等问题 已成为制约海水鱼类养殖业可持续发展的 关键因素 目前 培育高产 抗病的海水养殖品种 已经成为推动海水养殖业持 续 健康 稳定发展的关键 而生物技术的迅速发展为培育抗病力强 生长快和 品质优的养殖鱼类新品种提供了新的技术手段 尤其近几年来 水产养殖生物功 能基因组和分子标记技术的迅速发展为鱼类品种培育提供了大量可用的基因资 源和分子技术 以基因转移 分子标记和基因标记为主的分子育种技术由于具有 快速 高效 定向等特点而受到广泛关注 并在海水养殖鱼类品种培育上展现出 良好的发展前景和巨大的应用潜力 因此 现代生物技术育种在深入了解海水养 殖动物遗传背景的前提下大大缩短了育种周期 选育了许多高产抗病品种 提高 了良种培育的生产效果 所以 理解鱼类免疫功能和免疫机制 获得免疫相关基 因在鱼类养殖中具有重要的理论价值和实际意义 第一节鱼类免疫相关基因的研究进展 鱼类是特异性免疫和非特异性免疫并存的脊椎动物 但与哺乳类相比 鱼类 的特异性免疫系统不够发达 特异性免疫机制还不完善 因此 在鱼类对外界感 染及病原生物侵袭的防御反应中 非特异性免疫起着重要作用 非特异性免疫是 在鱼类长期进化过程中逐渐建立起来的一种天然防御功能 这种免疫的特点是受 遗传因素控制 具有相对稳定性 对多种病原体感染均具有一定程度的抵抗作用 但因为没有特异性 一般也不十分强烈 半滑舌鳎m h ci l 占两型基因的克隆 多态和表达研究 非特异性免疫主要包括 1 皮肤 粘膜的屏障作用 2 吞噬细胞的吞 噬作用 如中性粒细胞 细胞毒性细胞 单核吞噬细胞 其中单核吞噬细胞包括 血液中的单核细胞和各组织中的吞噬细胞 这些细胞的作用 一方面表现为对病 原体的吞噬 消化 杀伤作用 另一方面在处理寄生虫抗原过程中参与特异性免 疫的致敏阶段 3 体液因素对病原体的杀伤作用 补体系统因某种原因被活 化后 可参与机体的防御功能 如补体 细胞因子 趋化因子及溶菌酶和抗菌肽 等可介导一系列免疫或应激反应 非特异性免疫可被一些和病原体具有相似结构 的外源物质刺激而人为地激活 例如病毒的双链r n a p o l y i c 脂多糖 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e l p s 等 非特异性免疫识别过程是通过细胞表面的一种 模式识别受体 p a t t e r n r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s p r r s 介导的 编码这些受体的基 因是一种非重排基因 编码产物具有广泛的识别活性 这也就决定了非特异性免 疫作用的广谱性 由于非特异性免疫在鱼类等水产动物的防御反应中所起的重要作用及其在 水产动物防病治病中的巨大应用潜力 近年来有关鱼类非特异性免疫相关功能基 因的克隆及免疫调节机理的研究已引起高度关注 并成为当今鱼类分子免疫学和 抗病机理研究的热点 下面主要介绍与鱼类免疫密切相关的基因 主要包括细胞 因子和趋化因子等 1 1 细胞因子 细胞因子 c y t o k i n e s 是机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的小分子 多肽类因子 能调节多种细胞生理功能 包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨 噬细胞产生的单核因子等 其中 白细胞介素 干扰素 集落刺激因子 c o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r c s f 肿瘤坏死因子 转化生长因子 t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r t g f p 等免疫细胞产生的细胞因子在免疫系统中起着非常重要的调控作 用 1 1 1白细胞介素 自细胞介素 i n t e r l e u k i n i l 是由淋巴细胞 单核细胞或其它非单个核细 胞产生的细胞因子 促使t 细胞和b 细胞增殖和分化 增强n k 细胞以及单核细胞 的杀伤活性 刺激造血细胞参与炎症反应 诱导抗体的产生 促进血小板的生成 促进骨 脂肪的形成 保护黏膜上皮 在细胞间相互作用 免疫调节 造血以及 2 半滑舌鳎m h ci ib 两型基因的克隆 多态和表达研究 炎症过程中起重要调节作用 在各种物种中目前已发现几 1 至几 2 9 等3 0 种以上的 成员存在 m 1 b 在多种鱼里都被发现 鱼类中的几 1 d 和其它物种的有些差异 进化树 中单独聚为一支 而i l 1 受体在鱼类里和其它物种中都非常保守 h u i s i n g 等 2 0 0 4 在虹鳟 o n c o r h y n c h u sm y k i s s 中 用多子小瓜虫 i c h t h y o p h t h i r i u s m u l t i f i l i i s 刺激后 在皮肤中m 1 b 的表达在感染后4 天上升至l j l 7 8 倍 在头肾和 脾中表达量上升较小 在这三种组织中几 1 受体i i 的表达都下降了 s i g h 等 2 0 0 4 s c a p i g l i a t i 等分析了虹鳟和舌齿鲈几一l p 的三级结构 发现该基因有一个p 三叶草型的模块在进化中保守 同时分析了虹鳟几 1 d 受体i 的模式以及虹鳟m 1 9 和其受体的结合模式 s c a p i g l i a t i 等 2 0 0 4 w a n g 等还在虹鳟中发现了一个i l l p l 的等位基因 比已知的i l 1 1 3 1 在内含子 i 上多2 1 l b p 并且多一个砌试s 腿位点 w a n g 等 2 0 0 4 h o n g 在虹鳟中研究t i l i p 的分泌机制 发现在培养细胞上 清中只能检测到2 4 k d a 的成熟蛋白 检测不到2 9 k d a 的前体 说明尽管缺少i c e 剪切位点 虹鳟的几 1 p 蛋白和哺乳类的产生和分泌过程类似 h o n g 等 2 0 0 4 p e l e g r i n 等在金头鲷 p a r u sa u r a t a 中也研究了i l 1 p 的产生和分泌机制 发现 l p s 巨噬细胞活化因子和细菌d n a 可以刺激金头鲷的免疫细胞产生3 0 k d a 左右 的几 1 b 且该蛋白不受a 1 1 p 刺激分泌 p e l e g r i n 等 2 0 0 4 i n g e r s l e v 等在2 岁龄 的大西洋鲑 s a l m os a l a r 中研究了i l 1 1 3 1 发现该基因在不同时期 不同组织 的表达变化不大 但在头肾和脾中该基因在5 月份由淡水到海水环境的时候表达 最高 说明此时分泌的激素对细胞因子产生了影响 在所有时期 鳃组织中的表 达都是最高的 说明鳃作为免疫器官的重要性 i n g e r s l e v 等 2 0 0 6 范玉顶在 牙鲆 p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s 中也克隆得到了i l 1 i i 型受体 编码4 2 0 个氨基酸 具有几 r 家族的典型结构特征 含有两个i g 样的结构和 个跨膜区 二级结构分 析表明它属于混合型蛋白 空间结构和人i l 1 r i 晶体结构模型非常相似 同源性 分析表明该序列和真鲷 虹鳟的相似性比较高 分别为6 0 o 和4 7 4 r t p c r 检测表明 i l 1 ri i 在正常牙鲆的大多数组织中均表达 注射鳗弧菌6 d 时后在肾 和脾的表达量显著增加 分别是对照组的1 9 倍和2 o 倍 范玉项 2 0 0 7 在硬骨鱼类中 i l 2 首先在红鳍东方豚 f u g ur u b r i p e s 的基因组中被发现 红鳇东方豚的i l 2 有1 4 9 个氨基酸 包括3 个a 螺旋和2 个半胱氨酸 有i l 2 家族的 3 半滑舌鳎m h c 占两型基因的克隆 多态和表达研究 特征 但和已知其它物种的也 2 氨基酸相比一致性较低 2 4 3 4 用凝集素刺 激肾细胞 其表达量上升 b 硼等 2 0 0 4 i l 6 在鱼类里也是首先通过红鳍东方豚基因组被发现的 红鳍东方豚的i l 6 有2 2 7 个氨基酸 含有i l 6 的g c s f m g f 模块 4 个 螺旋和2 个半胱氨酸 但和 已知其它物种的i l 6 氨基酸相比一致性也较低 2 0 2 9 用l p s 和p o l y i c 刺激 后在脾细胞中表达显著上升 b 矾等 2 0 0 5 8 在多种鱼类被研究过 牙鲆的i l 8 是从构建的白细胞c d n a 文库中得到 的 编码1 0 9 氨基酸 在保守区域有4 个半胱氨酸残基 构成趋化因子c x c 特征 推测的氨基酸序列和七鳃鳗的i l 8 有5 2 相似性 在注射l p s 后的头肾和脾中以 及l p s 刺激后的白细胞中可以检测到表达 在注射l p s 后的肌肉和肝中检测不到 未刺激的组织和白细胞中也检测不到 l e e 等 2 0 0 1 虹鳟的i l 8 包含9 7 个氨 基酸 和前期得到的七鳃鳗 牙鲆中的儿 8 一样 在第一对半胱氨酸上游缺少e l r 模块 而是d l r 该基因包含4 个外显子 3 3 0 0 b p 左右的内含子 在脾 心 肝 头肾和鳃中低量表达 脑中检测不到表达 用l p s 刺激没有检测到该基因在 体内的明显变化 但是在l p s 或p o l y i c 刺激后的巨噬细胞系 r t s 1 1 中可用 r t p c r 和n o r t h e r nb l o t 检测到表达上升 l a i n g 等 2 0 0 2 后用多子小瓜虫刺 激虹鳟 i l 8 在皮肤中的表达上升明显 在头肾和脾中表达量上升较小 s i g h 等 2 0 0 4 在斑点叉尾鲴 i c t a l u r u s p u n c t a t u s 中也得到类似i l 8 的趋化因子 有两种剪切形式 分别编码1 1 4 和1 11 个氨基酸 有4 个外显子和3 个内含子 具有 典型c x c 趋化因子的结构 但和哺乳类的该基因差异大 r t p c r 显示两种剪接 形式都表达 用斑点叉尾鲴爱德华氏菌 e d w a r d s i e l l ai c t a l u r i 感染后在斑点叉 尾鲴和蓝鲶鱼 i c t a l u r u s f u r c a t u s 中表达上升3 5 倍 c h e nl 等 2 0 0 5 j i m c n e z 等用重组的虹鳟i l 8 去免疫 观测对其它细胞因子的影响 发现其可以提高儿 邛 n 吓 理1 在脾中 作用强 和头肾 作用稍弱 的表达 j i m e n e z 等 2 0 0 6 i l 1 0 在鲤鱼 c y p r i n u sc a r p i o 中有1 8 0 个氨基酸 含i l 1 0 模块 由5 个外显 子 4 个内含子构成 基因组结构和哺乳类相似 在肾 肝 脾 肠中表达 l p s 刺激后在头肾和肝中表达 s a v a n 等 2 0 0 3 i l 1l 有两种 i l 11 瘌i l 1 l b 两者氨基酸一致性低 但基因结构显示均为 哺乳类i l 1 1 的同源基因 在虹鳟 鲤鱼等鱼中得到了该基因 该基因在鲤鱼的 4 半滑舌鳎m h ci i 口两型基因的克隆 多态和表达研究 大部分组织和器官中表达 在体外的巨噬细胞中用l p s 刺激后表达上升 且受皮 质 甾 醇抑制 h u i s i n g 等 2 0 0 5 虹鳟中的i l 1 8 基因长约3 7 k b 有6 个外显子 5 个内含子 和人类基因结构 相似 编码1 9 9 个氨基酸 无信号肽 有i c e 剪切位点 成熟肽为1 6 2 个氨基酸 和其它物种相比该基因相似性较好 有几 1 家族模块 在脑 鳃 肠 心 肾 肝 肌肉 皮肤和脾中表达 在头肾白细胞和r t s 1 1 细胞中的表达不受l p s 或 p o l y i c 或虹鳟重组i l 1p 刺激 而在r t g 2 成纤维状细胞系 细胞中表达受l p s 和重组几 1 b 影响下降 同时 在虹鳟中还发现了一种可变剪切 编码1 8 2 个氨基 酸 在多种组织表达但表达量比前者低 在l p s 和p o l y i c 刺激下表达量上升 但 在r t g 2 细胞中表达不受重组l 1 p 影响 z o u 等 2 0 0 4 在红鳍东方豚的基因 组中也发现了几 1 8 和推测的受体复合体 h u i s i n g 等 2 0 0 4 红鳍东方豚的i l 2 1 有15 5 个氨基酸 4 个仅螺旋和4 个半胱氨酸 但和己知其 它物种的m 2 一致性较低 2