（微生物学专业论文）p13菌株的抑菌活性、抑菌机理及系统发育学分析.pdf

上海师范大学硕士学位论文摘要 论文题目 p 1 3 菌株的抑菌活性 抑菌机理及系统发育学分析 学校专业 微生物学 学位申请人 白燕 指导教师 肖明 摘要 荧光假单胞菌 舰嵇豳玳铡缀鼻船阳 蜀 凇 p 1 3 是分离自上海市嘉定区油菜作 物根际的一株生防细菌 对荧光假单胞菌p 1 3 的抑菌活性和抑菌机理研究分析结 果如下 一 平板对峙实验表明荧光假单胞菌p 1 3 对油菜菌核病菌 尼 d 砌幻 w 昆加踟 姗z 水稻纹枯病僻能 c 幻胛纽册砌回 小麦赤霉病菌 砌口如朋 口m f 胛p 口 聊 番茄灰霉病菌 肋砂廊c 伽p p 口 和玉米小斑病菌 b 垂7 0 伽西肌叫枷 具有明显的拮抗作用 二 荧光假单胞菌p 1 3 发酵液对油菜 品种为中双1 0 号 玉米 品种为农大 1 0 8 小麦 品种为鲁麦2 3 号 水稻 品种为p 2 5 湘 番茄 品种为红冠 5 种植 物种子萌发的影响实验结果表明 荧光假单胞菌p 1 3 对所有植物具有促生作用 其中 荧光假单胞菌p 1 3 对油菜种子 番茄种子 水稻种子的促生作用明显 三 荧光假单胞菌p 1 3 发酵液涂抹油菜的离体叶片后接种油菜菌核病菌 z p d f f z 以s c 昆 0 f f d r 甜朋 菌丝块 与涂抹清水对照比较 菌核病菌在保护叶片上 形成的病斑明显小于对照叶片 四 温室生物测定显示 温室盆栽油菜小苗叶片涂抹菌株p 1 3 发酵物后接种 菌核病菌 同对照比较 荧光假单胞菌p 1 3 具有显著生防效果 防治效果达到 为 暑 五 多批次的温室实验结果表明 荧光假单胞菌p 1 3 的不同施用方法及施用 浓度对油菜菌核病的防治效果有很大的影响 菌悬液浇灌处理较菌悬液浸种法对 菌核病具有更好的防治效果 菌悬液浇灌处理引入该菌株防治油菜菌核病的最佳 浓度在l 1 0 1 0 1 1 0 1 1 c 纠m l 范围较适宜 六 荧光假单胞菌p 1 3 能诱导油菜幼苗对油菜菌核病的系统抗病性 根际浇 灌p 1 3 不同浓度的发酵液 能增强地上部分对油菜菌核病的抗病能力 产生系统 摘要上海师范大学硕士学位论文 性的抗病作用 对荧光假单胞菌诱导植株产生系统性抗病现象的机理正在探讨之 中 七 经鉴定荧光假单胞菌p 1 3 能发酵产生次级代谢产物2 4 二乙酰基间苯三 酚 2 4 d i a c e t l p l l l o r o g l u c i n o l 2 4 d a p g 为全面揭示其生防机理奠定了基础 八 从荧光假单胞菌p 1 3 基因组中克隆了2 4 一d a p g 生物合成j p 办国基因的 片段 它与已发表的多个菌株的尸向f d 同源性高达9 9 为研究荧光假单胞菌p 1 3 系统发育关系 本研究中采用聚合酶链式反应 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r 的方法成功扩增了菌株p 1 3 的1 6 sr d n a 的序 列 所克隆的序列全长为1 3 5 5 b p 经b l a s t 比对1 6 sr d n a 序列的方法 对菌 株p 1 3 进行了系统发育学和遗传进化分析的研究 研究结果表明 菌株p 1 3 与已 报道的荧光假单胞杆菌 脚p 面所d 玎傩 肛 旭s c p 瑚 的1 6 sr e i n a 基因的序列有 9 9 9 的同源性 结果表明了菌株p 1 3 与荧光假单胞杆菌在进化上的关系最近 关键词 荧光假单胞菌p 1 3 油菜菌核病菌 平板对峙实验 2 4 二乙酰基 间苯三酚 砌 d 基因 1 6 sr d n a h 论文类型 b 应用基础 上海师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t n p 如朋彻哪够p l3i sab i 0 1 0 舀c a lc o n 舡o ls t r a i ni s o l a t e d 矗o mt 1 1 er h i z o s p h e r e o fr a p e b r a s s i c an a p o b r a s s i c a i nj i a d i n go fs h a i l 曲a i w 1 1 i c hp o s s e s s i n gi n h i b i t i o n a c t i v i 够o fab r o a d s p e c 旬r u mo fp l a n td i s e a s ef 妇g u s i nm e 咖d y t 1 1 eb i o c o n t r o l c h a r a c t e r i z a t i o n so f 丹p 面川d 咒口s d p s c e 雕互p p13w e r ea n a l y s e di ns e v e r a la s p e c t n l er e s u l t sw e r ea sf o l l o e d 1 n p 砌聊d 刀傩乃 d 酷c p 瑚印 p 13s h o w e d 黟e a ti 1 1 l l i b i t i o nt o 彪加f 加尬 卵彪 d 打d z 尺向忍d c 幻刀砌s d 肠刀f n 锄缈f 甜聊g r 口优加p a r 所 b d 匀y f 括c f 门e 旭日a n d b 勿d 切括聊础i i ld 砌一c u l t u r et e s tmp l a 土e 2 w bs t u d i e dm ei n n u e n c eo fn p 谢b 肌d 门傩 d 他卵p 瑚印 p 13f e r m e n t a t i o 衄 b r o 廿lt ot h es e e dg e m i m t i o no fr a p e z h o n g s h u a r 培n o 10 m a i z e n o n g d a10 8 w h e a t l 啪a in o 2 3 r i c e p 2 5 i 锄g a l l dt o m o t o h o n g g u a n t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a t n p 材如所d 刀伽 d 船c p 船妒 p13c o u l dp r o i n o t e 也e 伊o w mo 参t h e t e s t e df i v ep l a i l t s e s p e c i a l l yt l l ea c t i v 埘t or a p e t o m o t aa 1 1 dr i c e 3 1 ke x p 嘶m e mt 1 1 a tw h e nf i r s tp a 缸i n gn p 甜如肌 聍伽 o e s c e 咒s 印 p13 f c m e n t a t i o 衄b r o t l lt 0 t 1 1 ee xv i v ol e a v e sa r l dt h e ni n o c u l a t i n g p d f 加砌 s c 沱加f 幻 掰h y m 甄t h ed i s e a s es p o t so nt h ep r o t e c t i v el e a v e sw e r eo b v i o u s l yl e s s 也a nt h o s eo nt h cc o n t r o lo n e st h a tp a i n t e dw a t e r 4 q e e i l h o u s eb i o a s s a yo fn p 如m o 傩 甜d 阳j c p 船印 p 13s h o w e dt h a ts t r a i n pl3c o u l do b v i o u s l ys u p p r e s sp l a n td i s e 弱ew h e np a i n t i n gp13f e m e m a t i o i mb r o t l lo n t 1 1 e r a p el e a v e s b e f o r ei i l c u l a t e 跆 d 打扮砌s c 昆加疗d 朋h y p h a 1 1 1 eb i o c o n t r o l e 伍c i e n c y 糯7 n 墨 5 m a n yg r e e n h o u s ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss i 印e dt h a t d i 腩r e ma p l i c a t i o na n d u s e d e n s i t r 衍l lg r e a t 如l l yi i l n u o r e n c et h eb i o c o i 灯o la c t i v i t rt o 尼 d 巧玎玩s c 彪加f f d 聊 n l e 研g a t i o nm e t l l o di sb e 他rn 眦s e e d c o a tm e t h o da 1 1 ds e e d s u s p e n s i o nm e t h o d t h eb e s td e n s i t yf o r 确g a t i n gp 1 3i s1x1 0 l o 1 1 0 l l c 矗删 6 n p 甜面聊d z 傩 d 旭s c p 瑚印 pl3c o u l di n d u c e 协er a p es e e d i l l g so w n i n gm e s y s t e md i s e 硒er e s i 她m c et o 跆 d 玎珂砌s c 跆 d 玎d 肌 i r r i g a t i n g p13f e m e n t a t i o r u l i i i a b s t r a c t 上海师范大学硕士学位论文 而n ld i f r e r e n td e n s i 够t 0t h er a p er h i z o s p h e r ec a nr e i n f o r c et l l ed i s e a s er e s i s t a i l c eo f t l l ea e r i a lp a r t 7 p 如所d 嬲夕 d 陀s c p 瑚印 p l3c a i lp r o d u c tt h es e c o n d a r rm e t a b o l i t e 2 4 一d i a c e t y l p l l l o r o g i u c i n o l 2 4 一d a p g n l i sw i l lh e l pu st 0r e v e a lt h eb i o c o n t r o l m e c h a i l i s mo fn p 删b 所d 刀鲫 甜d 比s c p 脚印 p13o v e r a l l 8 w bc l o n e dm ep a r t i a ls e q u e n c eo f2 4 一d i a c e t r l p h l o r o g l u c i n o l 2 4 一d a p g b i o s y n t h e s i sp 厅肋lg e n e 1 1 弛h o m o l o g yb a s e d o nt h e 尸厅z dg e n er e z c h e du pt o9 9 i nt h i sr e a s e r c h w es u c c e s s 如l l y 锄p l i f y e dt h e16 sr d n ap a n i a ls e q u e n c e so f s t r a i np13u s i n gt l l em e t h o do fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r 舭dm e1 e n g c l lo f s e q u e n c ei s1 3 5 5 b p b yc o n 妇s t i n gt h e1 6 sr d n ap a n i a is e q u e n c e so f s 纰i n p 1 3a 1 1 d o t l l e rb a c t 舐a ls 乜面n si i lb l a s t w en n i s h e d 1 es t u d yw o r ko fs 仃a i np 1 3 s i d e n t i f i c a t i o na n de v o l u t i o na n 2 l l y s i s t h ef i n d i n g si n d i c a t e dt i l a t m e r ew 部9 9 9 h o m o l o g rb e t e e n 位1 6 sr d n ap a r t i a ls e q u e n c e so fs 瞳a i n p 1 3a i l d1 6 sr d n a p a n i a ls e q u e n c e so fs o m e 风e 以b 聊d 甩傩加f d 愆s c p 瑚s 廿a i n s t h er e s u l td i s p l a y e dn l a t s 仃a i npl3w a sm o s tc l o s et on p 甜如所d 挖甜夕甜d 旭s c p 船i ne v o l u t i o nr e i a t i o n s h i p k e y w o r d s a p 扰如脚d 刀伽伽d p s c e 淞p 13 彪 o 打刀励j c 彪加疗d 列朋 d u a l c u l t u r e t e s t 2 4 d i a c e t y l p h l o r o g l u c i n o l 尸办z dg e n e 16 sr d n a i v 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外 不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果 其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意 作者签名 日期 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权 保留送交论文的复印件 允许论文被查阅和借阅 学校可以公布论文的全部或部 分内容 可以采用影印 缩印或其它手段保存论文 保密的论文在解密后遵守此 规定 作者签名 导师签名 日期 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 微生物农药的研究进展 植物病害 l 是影响农业生产的主要因素之一 每年都要给国家造成巨大的经 济损失 因此植物病害防治成为一项很重要的工作 人们在很早以前就开始利用 各种有益的微生物资源处理植物的种子 块茎或根系等来达到促进植物生长 保 护植物免受病虫害危害的目的 目前 植物病害的防治方法主要是以利用抗病植 物品种和化学防治为主 2 枷 选用抗病植物品种可以达到经济有效的防治效果 但要获得一个理想的抗病品种 并不是一件容易的事情 而且抗病品种往往推广 几年以后容易丧失抗性 一般化学防治方法在病害防治中起到重要的作用 但它 又受到三个因素的限制 一是目前高效低毒的杀菌剂农药品种较少 二是环境条 件对防治效果影响很大 在环境条件适宜病原菌侵入和传播时 防治效果不令人 满意 三是容易造成环境污染 在寻求安全有效的防治措施过程中 植物病害的生物防治 5 日益引起人们的 关注 人们希望研制出高效的生物农药来代替化学农药 与传统的化学农药相比 生物农药有很多明显的优势 低毒 低残留 与环境相容性好 无污染 无公害 对病虫具有较好的活性 不伤及天敌和不易产生抗性 生物防治是指利用有益生物防治植物病害的各种措施 迄今所利用的主要是 有益微生物 有益微生物亦称拮抗微生物或生防菌 微生物防治 6 i 措施通过调节 植物的微生物环境来减少病原物接种体数量 降低病原物致病性和抑制病害的发 生 有些有益微生物已被制成多种类型的生防制剂 大量生产和应用 微生物防 治主要用于防治土传病害 也用于防治叶部病害和收获后病害1 7 1 1 1 微生物防治的机制 微生物防治主要是利用有益微生物对病原物的各种不利作用 来减少病原物 的数量和削弱其致病性 有益微生物还能诱导或增强植物杭病性f 8 通过改变植 物与病原物的相互关系 抑制病害发生 9 第一章绪论 上海师范大学硕士学位论文 有益微生物对病原物的不利作用主要有抗菌 a n t i b i o s i s 溶菌 l y s i s i 砌 竞 争 c o m p e t i t i o n l l 重寄生 h y p e 巾a r a s i t i s m 捕食 p r e d a t i o n 1 2 1 和交互保护 c r o s s p r o t e c t i o n 等 有益微生物产生抗菌物质 可抑制或杀死病原菌 这称为抗菌作用 例如 绿色木霉 乃玉砌d 比 啊口 扣胁 产生胶霉毒素 g l i o t o x i n 和绿色菌素 v i r i d i n 两种抗 菌素 颉颃立枯丝核菌 1 3 1 等多种病原菌 有些抗菌物质己可以人工提取 并作为 农用抗菌素定型生产 我国研制的井冈霉素是吸水放线菌井冈变种 幻册弦p s 矗 h c 印七淞v 强 f 孵 口 楚弘珊砷产生的葡糖苷类化合物 已广泛用于防治稻 麦 纹枯病 植物病原真菌和细菌的溶菌现象是比较普通的 它导致芽管细胞或菌体细胞 消解 溶菌现象有自溶性和非自溶性 后者可能是拮抗微生物的酶或抗菌物质所 造成的 也可能是细菌被噬菌体侵染所致 有潜在的利用价值 有益微生物的竟纠1 4 作用亦称占位作用或腐生竞争作用 主要是对植物体表 面侵染位点的竞争和对营养物质 氧气与水分的竞争 植物种子用有益细菌处理 后能够防治腐霉根腐病 1 5 就是由于有益细菌大量消耗土壤中氮素和碳素营养而 抑制了病原菌的缘故 土壤中的有益微生物对铁离子的竞争利用也是抑制根部病 原菌的重要原因 重寄生是指病原物被其它微生物寄生 1 6 的现象 哈茨木霉 乃记办 如 z 口 办口眩砌船 聊 和钩木霉 z 办 聊口f 甜坍 可以寄生立枯丝核菌和齐整小核菌菌丝 豌豆和 萝卜种子用木霉拌种可防治苗期立枯病与猝倒病 栗疫病病原菌 c 弦忍 以p c 护蛔 胛f r 泐 弱致病性菌株带有可传染的真菌病毒 已用于防治栗疫病 捕食作用在病害生防中已有应用 迄今在耕作土壤中已发现了百余种捕食线 虫的真菌 其菌丝特化为不同形式的捕虫结构 彳砌 d 6 d 哪属捕食性真菌已投入 商业化生产 其制剂用于防治蘑菇的食菌线虫和番茄根结线虫 交互保护作用是指接种弱毒微生物诱发植物的抗病性 从而抵抗强毒病原物 侵染的现象 在习惯上也列入微生物防治的范畴 1 7 1 有益微生物可能同时具有多种生防机制 l g 必须全面分析和利用 2 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 1 2 微生物防治措施及其应用 植物病害的生物防治有两类基本措施 其一是大量引进外源拮抗菌 其二是 调节环境条件 使已有的有益微生物群体增长 1 9 并表现拮抗活性 多种有益微生物已成功地用于防治植物根病 2 0 2 1 1 放射土壤杆菌 a 即6 叩幼f 甜m 阳硪d 6 口c 地 k 8 4 菌系产生抗菌物质土壤杆菌素a 8 4 其商品化制剂 已用于防治多种园艺作物的根癌病 利用拮抗木霉制剂处理农作物种子或苗床 能有效地控制由腐霉菌 疫霉菌 核盘菌 立枯丝核菌和小菌核菌侵染引起的根 腐病和茎腐病 利用菟丝子炭疽病菌防治大豆菟丝子也取得了较好的效果 施用生防菌 i o 是防治果实贮藏期病害的有效方法 用含酵母菌的2 氯化钙 水溶液浸渍果实 酵母菌通过竞争果面的营养物质和侵染位点而抑制苹果果实灰 霉病 青霉病 柑桔果实绿霉病 青霉病和桃果实褐腐病 枯草芽孢杆菌 肋c g z z 淞 s 材6 所括 渗入包被果实的蜡膜中能防治柑桔果实绿霉病和核果类褐腐病 我国通过亚硝酸诱变得到了烟草花叶病毒弱毒突变株系n 1 1 和n 1 4 黄瓜花 叶病毒弱毒株系s 5 2 将弱毒株系用加压喷雾法接种辣椒和番茄幼苗 可诱导交 互保护作用 已用于病毒病害的田间防治 有一定的防效 综合运用生防制剂和杀菌剂可以提高防治效果 2 2 1 降低杀菌剂用量 哈茨木 霉与五氯硝基苯共同施用防治萝卜立枯病和菜豆白绢病 与瑞毒霉共同施用防治 辣椒疫病 用吵印j l z 砌d 阳叩矽纪f 和豌豆根腐病 p m f 姗z 甜7 f 砌姗z 都是成功的实例 调节土壤环境 2 3 2 4 增强有益微生物的竞争能力是控制植物根病的又一成功 措施 向土壤中添加有机质 诸如作物秸秆 腐熟的厩肥 绿肥 纤维素 木质 素 几丁质等可以提高土壤碳氮比 有利于拮抗菌发育 能显著减轻多种根病 利用耕作和栽培措施 调节土壤酸碱度和土壤物理性状 也可以提高有益微生物 的抑病能力 例如 酸性土壤有利于木霉孢子萌发 增强对立枯丝核菌的抑制作 用 而碱性土壤有利于诱导荧光假单胞菌的抑病性 人们早已知道连作小麦多年的病田 全蚀病 2 5 功1 反而逐年减轻 甚至消失 这是由于土壤内积累了大量荧光假单胞菌等有益微生物而成为抑病土 d i s e a s e s u p p r e s s i v es o i l 的缘故1 2 8 对许多病害的研究表明 抑菌土在自然界是普遍存在 的 开发利用抑菌土是病害生物防治的又一重要领域 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 1 3 根际促生菌的介绍 土壤是各种微生物良好的栖息环境 生存着许多具有相互拮抗作用的微生 物 在生防菌的筛选 2 9 3 0 上 考虑到植物与微生物之问的相互作用关系 人们已 经把生防菌株的研究重点放在植物根表面或根际土壤中筛选 这样筛选出的微生 物接种后 在根表面具有很好的定殖能力 尤其是在某些植物根际周围的土壤中 存在着一类既可以防治病害又可以促进植物生长的微生物 3 1 1 这类微生物就是目 前已经引起人们关注的根际促生菌p g p r p l a n t 衲w t i lp r o m o t i n g r h i z o b a c t e r i a 1 3 2 1 所谓根际 r h i z o s p h e r e 就是指土壤与植物根部相接触的局部区 域 这里是土壤微生物的特殊生态环境 根际微生物 3 3 1 的研究已有1 0 0 多年的历史 但我国起步较晚 1 9 0 4 年土壤细 菌学家h i l t n e r 在研究豆科植物时 首先提出根周围土壤中微生物生长旺盛 为代 谢活性最高的区域 并命名为 根际 根际通常以细菌占优势 其生长受根部 组织释放出的氨基酸及维生素等营养所刺激 细菌生长所需的氨基酸种类在根周 围比没有根的土壤多f 3 4 微生物释放到根周围的代谢产物既可刺激植物的生长 又能防治某些植物病害 因此植物根部系统与微生物之间有着极为密切的联系 3 5 当种子萌发 根生长穿过土壤时 有机物的释放能够激活根际的微生物群落 影响根际微生物的数目与种类 这种现象叫做根际效应 r h i z o s p h e r ee 疏c t 近 年来 国内外应用有益根际微生物制成菌剂 作为生物肥料或生物农药施入作物 根际 为根际引进和富集这些有益的种类 发挥它们促进植物营养和抑制植物致 病菌的作用 从而获得增产和防病的效果 因此 生防微生物的成功应用有赖于对发生在土壤和根际的生态互作 3 6 的研 究 预知根际的生态条件 是生防微生物及制剂成功推向市场的重要条件 这不 仅要研究生防微生物本身 同时也要研究生防微生物与植物 先定殖的微生物及 环境的互作 根际促生菌p g p r p l a n t 觚 hp r o m o t i n gr h i z o b a c t j e r i a 包括很多种细菌 其 中主要包括假单胞菌属 册p 删6 聊d 甩伽s p p 和芽孢杆菌属 肋c f 刀螂s p p 假单胞菌 2 2 生长迅速 能够利用广泛的有机物伽 在实验室易于培养和遗传操作 是目 前研究较多的一类细菌 4 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 荧光假单胞菌 丹p 砌所d 门傩 触 彤s c e 瑚 属于假单胞菌属 3 8 3 9 1 是一类革兰氏 阴性杆状细菌 一般可在k b 培养基上产生水溶性的黄绿色荧光色素 4 0 对人畜 无害 它们广泛存在于土壤中 是定殖于植物根际的优势细菌种群 此类细菌的 多数株系具有拮抗或促生作用 4 l 其中一些菌株兼具防治植物病害和促进植物生 长的双重功效 4 2 1 自2 0 世纪7 0 年代以来 人们已经分离到大量拮抗植物病害的 荧光假单胞菌 这些菌广泛分布在世界各地 可产生多种抗生素 对多种植物病 害具有拮抗作用 起着天然生物防治的作用1 2 8 1 1 9 8 0 年美国的h o w e l l c r 从棉 花土壤中分离到荧光假单胞菌p f 5 可产生多种抗生素 对砂砌f 掰 艮拥 m 等多 种病害有良好抗性 1 9 8 6 年美国的m m 砒o wl s 等从小麦根际分离出的p 触d 陀s c e 埘2 7 9 可抗g 础材掰口玎船d 叼 c e sg 阳聊f 挖括等病害 瑞士的k e e l c 等分离 到p 肛d 坨s c p 瑚c h a 0 4 3 可抗尸肋f 加 m m 聊 砌口 f 聊d 砂印d 加 19 8 7 年 中国农科院的彭于发获得抗小麦全蚀病的荧光假单胞菌c n l 2 1 9 9 1 年张春明报 道了用荧光假单胞菌防治桃树根癌病 1 9 9 8 年上海交大的许煜泉筛选到了防治 甜瓜枯萎病的m 1 8 4 4 1 2 0 0 2 年周洪友 4 5 1 等人分离到的p 扰d 旭s 钾凇c p f 1 0 对 小麦全蚀病 棉花立枯病及番茄青枯病等有较好防治效果 1 4 生防细菌在微生物防治中的应用研究进展 近年来 国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存和活 动 使这一防治策略发展迅速 其中拮抗细菌在植物病害防治中起到非常重要的 作用 无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中 细 菌的作用是非常明显的 其主要优势在于 1 细菌的种类和数量众多 在植物 根际和植株表面大量存在 2 细菌对病原菌的作用方式较广 可以通过竞争 拮抗和寄生 诱导植物产生抗性等多种方式对病原菌产生影响 3 具有惊人的 繁殖速度 4 许多细菌存在于植物根际和植株表面 对植物的生态比较适宜 5 细菌大多可以人工培养 便于控制 在实践中易于操作 6 有些细菌不仅能防 治病害而且可以增加作物产量 舶 自2 0 世纪7 0 年代初 k e m a 1 9 7 3 利用土壤放射杆菌 鲫妇c 幻 f m 阳访d 6 口c 纪厂 k 8 4 菌株防治桃根癌病口鲫6 钟纪 f 姗z 胁m 皇加招珊 取得成功以来 利 用有益细菌的实验例次占所有有益微生物及其他措施防治病害实验总数的比重 第一章绪论上海师范大学硕七学位论文 在不断增加 并取得了较为理想的效果 大量的研究表明 生防细菌不仅在其生 长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物 通过直接或间接作用 达到 阻碍或杀死植物病原菌的效果 而且这些细菌大多是从植物的根围和叶围等处分 离得到的 对植物具有较好的亲合性 接种后易于在植物上定殖 生防效果持久 稳定 目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌 b 口c f 刀淞s 6 r f 如 4 7 1 假单胞杆菌 珊e 如川d 嬲s p p 土壤放射杆菌0 d 6 口c 胞 f 材聊 础d 6 口c 胞 以及其他一些细 菌 1 芽孢杆菌 觑f 刀搬s p p 目前国内外应用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛 如马铃薯疮痂病 番茄青 枯病 苹果红腐病 小麦赤霉病 4 8 1 及其它一些土传和地上部病害 防治这类病害 的生防菌是营腐生生活的g 细菌 可以内生芽孢 抗逆能力强 繁殖速度快 营 养要求简单 易定殖在植物表面 目前用于生防细菌的种类有 枯草芽孢杆菌旧 s 6 z 捃 多粘芽孢杆菌 p d 锄肺 蜡状芽孢杆菌 c 盯p 淞 巨大芽孢杆菌 7 l p 即纪 f 甜聊 和短小芽孢杆菌 b p 甜m f 如 等 2 假单胞杆菌 风p 砌脚d z 鲫s p p 该细菌大量存在于植物的根围和叶围 土壤中是以不同生物型的荧光假单胞 杆菌 尸 夕甜d 绀卯珊 为主 而在植物叶表主要以丁香假单胞菌 p 吵f 馏口p 为主 这类细菌以及草生欧氏杆菌 e 办p 6 f c d 肠 某些菌株对植物气生部分病害有一定的 影响 目前应用的主要种类有荧光假单胞菌 尸 甜d p j c p 船 洋葱假单胞菌妒 c 印p c 蛔 和恶臭假单胞菌 尸 p f f 沈 等 国内利用荧光假单胞菌防治多种植物病害 1 4 5 1 如小麦全蚀病 4 9 g 伽 m 口 z o 唧p s 剐m f 甩捃 棉花幼苗猝倒病 砌f 聊 甜7 f 聊册z 马铃薯软腐病 e m 砌砌c 甜d 幻1 o 脚等 3 土壤放射杆菌似矿d 6 口c 幼f 姗l 阳扔6 口c 胞力 土壤放射杆菌0 矿d 6 础陀 f 甜肌阳d 幻6 口c 纪 阳 m d z d 6 口c 胞厂 已在澳大利亚进行 商品化生产 防治由彳g r d 6 口c 册f 朋厂口d 幻6 口c 纪 阳 m l 咖c 抬瑚侵染引起的桃 樱桃等果树根癌病 6 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 2 荧光假单胞菌的生防机理研究进展 2 1 荧光假单胞菌的抗病机理 荧光假单胞菌的抗病机理包括有效的根部定植 抗生作用 根际营养竞争 特 别是对铁的竞争 诱导植物抗性和分泌降解为微生物的酶等 其中抗生作用是 重要的机理之一 现已证实 荧光假单胞菌可产生1 0 多种有抗菌作用的次生代 谢产物 包括藤黄绿脓菌素 p y 0 1 u t e o r i n p l t 鲫 硝吡咯菌素 p y r r o l i l i t r i n p r n 5 1 1 吩嗪类物质 2 4 二乙酰基间苯三酚 2 4 d i a c e 够l p m o r o g l u c i n o l 2 4 d a p g 5 2 1 噬 铁素 s i d e r o p h o r e s 1 5 3 1 卵菌素 o o m y c i na 氢氰酸 h c n 1 5 4 1 几丁质酶等 这些 次生代谢物详见表l l 表1 1 荧光假单胞菌产生的主要抗生素种类 抗生素 a n t b i o t i c s 抗真菌抗生素 a n t i f i 唱a la i l t i b i o t i c s p h e n a z i n e s p h e n a z i n e 1 c a r b o x v l i c a c i d p h e n a z i n e 1 c a r b o x 啪i d e p v r r o l n i t r i n p v o l u t e o r i n 2 4 刁i a c e 训p h j o r o g j u c i n o j r h a l i l i i p i d s o o m v c i na c e p a c i a m i d ea e c o m v c i n s d d r v i s c o s i n 锄i d e b u 咖i a c t o n e s n b u t v l b e n z e n e s p l p h o n 锄i d e p y o c y 矾i n 抗细菌抗生素 a n t i b a c t e r i a la n t i b i o t i c s p s e u d o m o n i ca c i d a z o m v c i n 参考文献 r e f e r e n c e b 瞰灿e a de ta 1 1 9 9 4 p i e r s o n 柚dp i e f s o n 1 9 9 6 c h i n a w b e n ge ta 1 19 9 8 t h 鲫a s h o w 卸dw e i l 铽1 9 8 8 h o w e la l l ds t i p a n o v i c 19 8 0 s h 粕a h 鞠e ta j 1 9 9 2 b k i me ta 1 2 0 0 0 h o w i e 觚ds u s l o w 1 9 9 1 j i a oe ta 1 1 9 9 6 m i f i e re ta i 1 9 9 8 h o k e b e 唱e ta 1 19 9 8 n i e l s e ne ta 1 1 9 9 9 t h r a n ee ta i 2 0 0 0 g 锄a r de ta i 1 9 9 7 k i me ta 1 2 0 0 0 b 踟n 锄dr o w e 1 9 8 1 f u l l e re ta 1 1 9 7 1 s h o j ie ta 1 1 9 8 9 目前 研究最为深入的抗生素类型主要是吩嚷类 硝吡咯菌素 藤黄绿脓菌 7 第一章绪论 上海师范大学硕士学位论文 素 2 4 二乙酰基间苯三酚等 其它抗生素类型也有一定的研究 2 1 1 2 4 二乙酰基间苯三酚 2 4 一二乙酰基间苯三酚 2 4 一d i a c e 够l p h l o r o 西u c i n o l 2 4 d a p g 是一种具有广 谱抗菌活性的抗生素 能抗病毒 抗细菌 抗真菌 抗蠕虫 在防治多种植物病 害中发挥重要作用 例如 产2 4 d a p g 的荧光假单胞菌c h a 0 5 5 1 能够抑制烟草黑 根腐病 番茄根腐病 黄瓜猝倒病和小麦全蚀病 2 1 2 吩嗪类物质 已报道的由假单胞菌产生的吩嗪类抗生素主要有吩嗪 1 羧酸 p h e n a z i n e l c a r b o x y l i ca c i d p c a 吩嗪一l 羟基 p h e n a z i n e 1 h y d r o x y 吩嗪 1 甲酰胺 p h e n a z i n e 1 c a r b o x 锄i d e p c n 吩嗪类抗生素能够抑制多种植物根部病 原体 如荧光假单胞菌m 18 产生的羧基吩嗪能抑制黄瓜枯萎病 p f2 7 9 2 8 l 产生 的p c a 能抑制小麦全蚀病 这类抗生素在细胞内可作为电子载体 传递电子到 目标细胞 从而增加了细胞内的超氧化物自由基 使目标细胞中毒死亡 2 1 3 硝吡咯菌素 硝吡咯菌素 p y r r o l n i t r i n p m 是一种首先在吡咯菌素假单胞菌中分离到的广 谱抗真菌抗生素 荧光假单胞菌p 0 5 5 6 1 c h a o 等都能产生硝吡咯菌素 它能显 著抑制真菌病害 如水稻纹枯病菌等 一般认为 硝吡咯菌素的生防机理是在低 浓度情况下破坏氧化磷酸化的偶联机制 在高浓度下则是阻止了参与呼吸作用的 黄素蛋白和细胞色素c 的电子运输路径 2 1 4 藤黄绿脓菌素 藤黄绿脓菌素 p y o l u t e o r i n p l t f 5 7 是一种芳香族聚酮类抗生素 常温下为黄 色晶体 溶于乙酸乙酯 甲醇等有机溶剂 微溶于水 藤黄绿脓菌素能够有效地 抑制植物病原菌终极腐霉和黑根腐病病原菌 荧光假单胞菌p f 5 c h a o 2 7 2 等 都是能够分泌藤黄绿脓菌素的假单胞菌 8 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 这些拮抗物质多是一些低分子量的化学物质 通常在很低浓度下就可阻碍病 原微生物的生长发育 如假单胞菌g c b 2 6 分泌的吩嗪 1 羧酸能够防治辣椒疫霉 黄瓜炭疽病菌 其最小抑制浓度为5 g m l 药效仅次于商业化的甲霜灵和百菌清 h o w e l l 等研究发现 如果在棉花种子表面加l o 一种子的藤黄绿脓菌素 即可抑 制由终极腐霉引起的枯萎衰退 生防荧光假单胞菌产生的抗生素有以下特点 1 许多同一假单胞菌株能够 产生多种不同的抗生素 如荧光假单胞菌c h a 0 它能产生硝吡咯菌素 藤黄绿 脓菌素 2 4 二乙酰藤黄酚等 对不同病原菌具有不同程度的抑制作用 2 荧光 假单胞菌分泌的许多抗生素具有广谱抗菌活性 不仅对大量的植物病原真菌具有 抗性 同时还能抗细菌 原生动物 但一般对人畜无害 2 2 荧光假单胞菌的促生作用机理 促生机理 5 8 删主要包括两方面 一是产生活性物质或改善矿质营养直接促进 植物生长 二是产生代谢物质或竞争作用抑制或阻碍根区病原微生物的发展 间 接促进植物生长 3 生物活性物质研究中的新技术 3 1 色谱在活性物质筛选中的应用 天然活性物质的发现是一个耗时且工作量非常大的工作 为了提高纯化的速 度 现已开发出并联制备高效液相色谱衄曲p e r f o 彻a n c el i q l l i dc h r o m a t o 伊a p h y h p l c 6 1 1 相比常规的单通道h p l c 速度提高了2 4 倍 然而 从复杂的混合样品 中检测和辨别出有活性的新化合物仍然是天然产物研究中的瓶颈问题 按照传统 的混合物中活性物质跟踪的办法 从粗提物和发酵液开始对活性物质进行初筛 跟踪到活性物质分离提取和结构解析往往需要数月到一年的时间 因此 寻找快 速简便的方法将活性物质跟踪和分离相结合是天然产物化学家追求的目标 色谱 是常用的高效分离分析技术 将其与活性筛选相结合可以对活性物质进行有目的 的跟踪 使活性物质被发现和分离的时间大大缩短 9 第一章绪论上海师范大学硕七学位论文 3 1 1 生物自显影 b i o a u t o g r a p h 技术 薄层色谱 t h i nl a y e rc h r o m a t o g r 印h 弘t l c 以上样量少 方便 价廉 易操作 等优点而成为天然产物提取过程中应用最广泛的技术 将薄层色谱与生物检测相 结合所形成的生物自显影技术是应用历史较长也较成熟的通过色谱进行活性物 质筛选的方法 6 2 1 主要应用于抑菌和酶抑制活性物质的检测 6 3 1 一 抑菌活性物质的检测 将分离混合样品的薄层板轻放在已培养好的靶子菌表面共同培养 或将靶子 菌的菌液喷洒于薄层板表面在适当条件下培养 根据能否形成抑菌圈及抑菌圈的 大小 判断各组分是否具有抗菌活性及其活性大小 从而指导进一步的分离纯化 工作 a n n i s 等以筛选具有阻断毒枝菌素合成的基因转录的活性化合物为目的 建立了薄层色谱检测阻断p 葡 萄 糖苷酸酶 p g l u c u r o f 曲a s e g u s 报告基因表达 的活性物质的方法 将含有靶子菌孢子悬浮液的琼脂培养基喷洒在已展开的t l c 表面 放在适当条件的培养箱中培养 当观察到有菌丝体和孢子生长时取出薄层 板 通过冷冻 解冻处理使菌丝体中的葡糖苷酸酶释放出来 喷洒葡萄糖缓冲液 再培养过夜 可观察到是否有抑制葡糖苷酸酶的活性物质 作者利用该方法对黑 胡椒粗提液中具有抑制葡糖苷酸酶活性的化合物进行了活性跟踪 分离得到了在 转录水平抑制黄曲霉毒素合成的化合物c p 2 趾l i i l a d 等利用抗药性的细菌和病源 酵母菌c a i l d i d aa l b i c a i l s 作为靶子菌 从植物中筛选具有抗多种耐药性病源菌的活 性物质 r a m i r e z 等以不同的菌种为靶子菌 将生物自显影技术用于牛奶中抗体 的检测 二 酶抑制活性物质的检测 将待检测的酶液和染料喷在已展开的薄层板上 根据颜色变化判断是否具有 与靶子酶有反应的组分及其活性大小 该方法应用最多的是乙酰胆碱酯酶抑制剂 的检测 r h e e 等研究了薄层板的基质对该方法的影响 结果表明硅胶板和氧化铝 板的效果最好 硅胶的厚度也同样影响检测结果 厚度为l l 姗的硅胶板的效果明 显但所需样品量和酶浓度较大 该方法对乙酰胆碱酯酶抑制剂的检测限取决于所 测样品本身的活性 范围一般为o 0 1 o 2 嵋 虽然t l c 的浓度检测限比孔板检测 实验的检测限高 但从质量检测限的角度相比较 t l c 的检测灵敏度明显高于孔 板检测 因此可作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的定性活性筛选方法 虽然生物自显影 1 0 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 法只是定性的活性检测方法 但将t l c 与其他检测方法 如紫外检测等 联用 再 结合已有的t l c 数据库 则可在分离提取的最初阶段排除已知活性物质的同时锁 定可能的新结构活性物质 生物自显影法的另一优点是不受有机溶剂干扰 通常 粗提物都溶于有机溶剂中 溶剂干扰是活性筛选实验中的难题 t l c 在完成分离 后将有机溶剂挥发 然后再进行检测 从而避免了有机溶剂的干扰 此外 将t l c 活性检测与定量孔板活性检测方法相结合 可为进一步的纯化提供更多有用的信 息 3 1 2 高效液相色谱 h p l c 技术 与薄层色谱相比较 高效液相色谱伽曲p e r f o m a i l c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c 具有分离效率高 灵敏度好 可定量 检测手段多等优点 是目前分离分 析中最常用的方法 6 4 6 5 1 高效液相色谱已经广泛地应用 鲫 成为一项不可缺少的技术 它的主要优点 是 1 分辩率高于其它色谱法 2 速度快 十几分钟到几十分钟可完成 3 重复 性高 4 高效相色谱柱可反复使用 5 自动化操作 分析精确度高 根据分离 过程中溶质分子与固定相相互作用的差别 高效液相色谱可分为四个基本类型 即液一固色谱 液一液色谱 离子交换色谱和体积排阻色谱 高效液相色谱在生 物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定 6 7 1 氨基酸及其衍生物 2 有机酸 3 甾体化合物 4 生物硷 5 抗菌素 6 糖类 7 卟啉 8 核酸及其降解产物 9 蛋白质 酶和多肽 1 0 脂类等 6 s 一 液 固色谱法 液 固色谱法1 67 通常称吸附色谱法 吸附剂有活性碳 氧化铝和硅胶 在液 固色谱法中用的载体都是硅胶 硅胶对溶质 分子的吸附能力不是平均分布在整 个硅脱表面的 在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用 这些区域为活 性位置 硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用 极性越强 而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长 在液 固色谱中 依靠流动相溶剂分子与 溶质分子竞争固定相互活性位置 从而使溶质从色谱柱上洗脱下来 与硅胶表 面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强 因而称强溶剂 反之为弱溶 剂 液一固色谱法的特点是适于分离色谱几何异构体 可用于脂溶性化合物质如 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 磷脂 甾体化合物 脂溶性维生素 前列腺素等 二 键合相色谱法 键合相色谱法是由液 液色谱法即分配色谱发展起来的 键合相色谱法将固 定相共价结合在载体颗粒上 克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶 解 及流动相通过色谱柱时的机械冲击 固定相