糖基化终产物对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1α mRNA表达的影响.doc

糖基化终产物对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA表达的影响【摘要】目的探讨糖基化终产物(AGEs)对U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA表达的影响，及AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。 方法将U937细胞用不同浓度（100、200、400 mg/L）AGEs孵育24 h及同一浓度（400 mg/L）AGEs孵育0、12、 24及36 h，采用原位杂交(PTPCR)方法检测巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA的表达水平。 结果对照组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1呈弱表达；100、200及400 mg/L AGEs孵育24 h后，各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA 表达的平均积分光密度值较对照组均显著升高（P0.05）；400 mg/L AGEs孵育12、24 及36 h后，各组U937细胞内巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA表达的平均积分光密度值均高于0 h（P0.05）。结论AGEs以时间及剂量依赖的方式促进U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1 mRNA的表达。 【关键词】 动脉粥样硬化;糖基化终产物;U937细胞;巨噬细胞炎性蛋白1糖尿病患者由于动脉粥样硬化（AS）而发生的心脑血管病、肢端坏疽等并发症均明显高于非糖尿病人群1，且发生早、进展快、预后差，是当今糖尿病患者致死致残的重要原因，确切机制尚不清楚。糖基化终产物(AGEs)是蛋白质非酶糖化的终末不可逆聚合物，以高水平聚集在糖尿病患者体内。近年大量研究证明，AGEs因介导多种病理过程在糖尿病血管并发症的发病中起重要作用。巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP1α）属于CC型趋化因子，对病灶中单核细胞及淋巴细胞的招募起着重要作用。本研究旨在探讨AGEs在糖尿病As中的作用。1 材料与方法1.1 材料人单核细胞株937细胞购自中科院上海细胞所；RPMI1640培养基GIBCO公司；胰蛋白酶、D葡萄糖、牛血清白蛋白购自华美公司；DEPC购自SIGMA公司；胎牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司；佛波酯(PMA) 购自Sigma公司；Trizol、逆转录试剂盒试剂购自美国GIBCO公司；MIP1α引物由上海生物工程有限公司合成；DNA marker（X174Hincdigest）购自大连宝生物工程有限公司。1.2 AGEs的制备参照Horiuchi等2的方法将1.6 g牛血清白蛋白（BSA）与3.0 g D葡萄糖溶于10 ml 0.5 mol/L（pH7.4）PBS中，0.22 μm微孔膜滤过除菌，37孵育90 d，实验前用0.5 mol/L（pH7.4）PBS 透析去除未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，余条件一致。1.3 U937细胞培养及分组937细胞在10% FBS RPMI 1640培养基中悬浮生长,每23 d传代一次。加入0.1 μmol/L佛波酯诱导分化48 。实验组分为两组：不同浓度组分别于含100、200及400 mg/L AGEs的无血清培养液培养24 h；不同孵育时间组于含400 mg/L AGEs的无血清培养液分别培养0、12、24及36 h；对照组加含未修饰BSA的无血清培养液培养。所有实验均重复3次。1.4 细胞总RNA的提取及逆转录聚合酶链反应收集各组细胞，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。取各组细胞的总RNA各1 μg,按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，取2 μl cDNA进行PCR循环(94变性1 min,58退火1 min,72延伸2 min,共35个循环,末次延伸7210 min,4储存)。 MIP1α引物序列4为:正链5′ CTGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG 3′,负链5′CTGCCGGCTTCGCTTGGTTA 3′,PCR扩增产物长度为197 bp；βactin引物序列为:正链5′ ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3′,负链5′CATCTCTTGGTCGAAGTCCA3′,扩增产物长度为308 bp。PCR体系总反应体积为50 μl，包括1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2 ，0.2 mmol/L dNTP,引物各20 pmol/L,Taq酶2 U。反应后取终产物10 μl在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离,应用凝胶成像系统（美国αinnotach公司IS5500型）分析软件测定条带吸光度值,计算MIP1α/βactin积分吸光度比值。1.5 统计学处理所有数据采用xs表示。组间差异显著性比较采用单因素方差分析。2 结 果2.1 分化细胞的形态937单核细胞呈圆形、悬浮生长;经0.1 μmol/L佛波酯诱导分化后,细胞停止增殖,变为贴壁生长,且伸展伪足,成巨噬细胞外形。2.2 U937细胞内MIP1α mRNA的表达RTPCR结果表明，各组U937细胞均表达MIP1α mRNA。100、200、400 mg/L AGEs培养U937细胞24 h显著增高MIP1α mRNA的表达，其电泳条带相对积分吸光度值分别为对照组的1.23、1.69、2.26倍（P0.05）；400 mg/L AGEs培养12、24、36 h后，各组U937细胞中MIP1α mRNA的表达也明显增高，其电泳条带相对积分吸光度值分别为0 h组的1.45、2.23、2.48倍（P0.05）。 AGEs以时间及剂量依赖的方式促进U937细胞MIP1αmRNA的表达（P0.05）（见图1、2）。3 讨 论 AS形成炎症学说的提出，使细胞因子及炎性细胞与AS之间的关系成为关注热点。单核细胞趋化迁入血管内膜并分化成为巨噬细胞是AS发生的始动环节，并贯穿于As的全过程。在此过程中单核细胞受多种趋化因子的招募，其中单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP1）对单核细胞的趋化作用已被许多研究者所证实3，4。文献报道5,同时敲除MCP1基因和低密度脂蛋白受体基因的小鼠在喂饲高胆固醇饮食后,其动脉粥样硬化病变与单纯敲除低密度脂蛋白受体基因的小鼠相比明显减轻,但动脉的病变并未完全消失,主动脉壁内仍有巨噬细胞浸润，说明在单核细胞迁入内皮下间隙过程中,除MCP1外,还有其他趋化因子的参与。MIP1α与MCP1同属于C C型趋化因子，亦参与单核细胞的募集及泡沫细胞的形成6，7。而且，在食饵性AS斑块中有大量存在MIP1α,由此可见，MIP1α在AS的发生中亦起着重要作用。 糖尿病患者发生As危险性较正常人增加34倍。近年来研究表明，长期高血糖状态下蛋白质非酶糖化形成的糖基化终产物可能参与了糖尿病患者AS的发生8，9。AGEs主要通过受体介导发挥其作用，目前发现包括单核细胞在内的多种细胞上有AGEs受体的表达。已有研究发现，糖基化终产物可明显增强单核细胞MCP1的表达10，而关于糖基化终产物对单核细胞表达MIP1α的影响目前尚未见报道。本研究结果提示，糖基化终产物以时间及剂量依赖的方式促进U937细胞巨噬细胞炎性蛋白1α mRNA的表达，这在一定程度上对糖尿病患者易患AS的机制提供了可能的解释。 本实验所采用的糖基化终产物浓度分别为100、200及400 mg/L，而糖尿病患者血浆糖基化终产物浓度多在100400 mg/L之间，故本实验中所用的糖基化终产物浓度基本符合人体的病理条件。我们的研究表明控制血糖水平减少AGEs形成及使用AGEs抑制剂（如氨基胍）可使单核细胞MIP1α mRNA的表达下降，降低对单核细胞的趋化作用，从而减少糖尿病患者大血管病变的发生率。【参考文献】 1Garcia MJ，McNamara PM，Gordon T,et al.Morbidity and mortality in diabetics in the Framingham population.Sixteen year followup studyJ.Diabetes,1974；23(1): 10511.2Horiuchi S，Araki N，Morino Y.Immunochemical approach to characterize advanced glycation end products of maillard reactionJ.J Biol Chem,1991；266(12):732932.3Uguccioni M,DApuzzo M，Loetscher M,et al.Actionof the chmotactic cytokines MCP1,MCP2,MCP3,RANTES,MIP1and MIP1on human monocytesJ.Eur J Immunol，1995；25(1):648.4Reape TJ,Groot PH.Chemokine and atherosclerosisJ.Atherosclerosis,1999；147(2):21325.5Gu L，Okada Y，Cliton SK,et al.Absence of monocyte chemoattract protein1 reduces atherosclerosis in low density lipoprotein receptor deficient miceJ.Mol Cell,1998；2(2):27581.6Gosling J，Slaymaker S，Gu L,et al.MCP1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein BJ.J Clin Invest,1999；103(6):7738.7Lee SC，Brummet ME，Shahabuddin S,et al.Cutaneous injection of human subjects with macrophage inflammatory protein1 induces significant recruitment of neutrophils and monocytesJ.J Immunol,2000；164(6):3392402.8刘宏，侯凡凡，宋敏，等.晚期糖基化终产物修饰蛋白刺激人血管内皮细胞表达黏附分子的研究J.解放军医学杂志，2001；26(5)：31921.9Hangaishi M，Taguchi J，Miyata T,et al.Increased a