胎儿生长受限子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较.doc

胎儿生长受限子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较作者：黄谱,苟文丽,米阳,张瑞,孙云萍单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院妇产科，陕西西安 710061；2. 陕西省妇幼保健院产科，陕西西安【摘要】 目的 比较胎儿生长受限(FGR)子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱的差异，探索蛋白质组学技术在FGR引起子代神经系统发育异常的研究中应用的可能性。方法 建立SD大鼠的FGR模型，分离子代大鼠海马组织并提取总蛋白；进行双向电泳，比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织的蛋白质表达差异。结果 FGR子代大鼠与正常大鼠海马组织双向电泳图谱分别检出647和626个蛋白点，对2张电泳图进行匹配后发现有18个蛋白点仅在FGR子代大鼠海马蛋白双向电泳图谱中表达，28个蛋白在2组大鼠海马组织中含量发生了3倍以上的变化，其中FGR组上调25个，下调3个。结论 初步建立了FGR动物模型比较蛋白质组学的技术方法；FGR子代大鼠海马蛋白质组与正常大鼠存在明显差异，差异点的发现为深入研究FGR引起子代高级神经活动异常的发病机制提供了有益的线索。 【关键词】 胎儿生长受限；海马；学习记忆；双向电泳Comparison of twodimensional electrophoregrams of hippocampusproteome between the offspring of rats with fetal growthrestriction and control ratsHUANG Pu, GOU Wenli, MI Yang, ZHANG Rui, SUN Yunping(1. Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Obstetrics,Shaanxi Provincial Maternal and Child Health Hospital, Xian 710003, China)ABSTRACT: Objective To compare the global protein patterns between the hippocampus of fetal growth restriction (FGR) offspring rats and control rats hippocampus by means of twodimensional electrophoresis (2DE) so as to explore the possibility of applying proteomics technology in research on FGRinduced developmental abnormality of the offsprings nervous system. Methods FGR model of SpragueDawley rats was constructed according to the method of passive smoking. The offspring were assigned into FGR group and control group. The hippocampus proteins were extracted. 2dimensional electrophoresis was conducted to compare hippocampus protein expression between FGR offspring rats and normal rats. Electrophoregrams were obtained with immobilized pH gradient (IPG) isoelectric focusing electrophoresis as the first dimension, and then with vertical SDSPAGE electrophoresis as the second. The electrophoregrams were visualized using silver staining and analyzed with ImageMaster software. Results Totally 647 and 626 protein spots were obtained in the offspring of FGR rats and control rats hippocampus maps respectively, of which 28 spots increased or decreased in quantity. Other 18 spots were found exclusively in FGR group hippocampus maps. Conclusion Proteomics method of FGR was established. The differentially displayed proteins may provide further insight into molecular mechanisms of abnormality of neural system development of FGR offspring.KEY WORDS: fetal growth restriction (FGR); hippocampus; learning and memory; 2 dimensional electrophoresisSupported by the National Natural Science Foundation of China (No.30471826) and the Key Scitech Research Project of Shaanxi Province (No.2004K17G11) 胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)是指各种因素导致胎儿在宫内生长发育受到限制，是造成围生儿病率的主要原因之一1。FGR子代智力发育水平可能有所下降23，我们前期的研究从行为学角度已证明，FGR子代大鼠的水迷宫测试成绩下降，提示孕期发生FGR对胚胎和胎儿脑组织的发育有所影响，并对出生后子代早期及远期空间学习记忆能力造成损害4。海马是边缘系统的重要组成部分，在学习记忆、情绪反应及植物神经性功能等方面发挥着重要作用。蛋白质组学(proteomics)技术是利用双向电泳(2dimensional electrophoresis, 2DE)对组织进行大规模蛋白分离，然后应用质谱等技术对分离的差异蛋白进行鉴定，通过比较正常与疾病组织的差异表达蛋白，寻找疾病相关蛋白质。本研究应用双向电泳技术，通过比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱差异，从蛋白分子水平探索FGR子代大鼠海马蛋白质组的变化及FGR在子代大鼠学习记忆障碍中的作用机制，为防治FGR子代智力异常提供新的线索和理论基础。1 材料与方法1.1 实验动物 选取体重230260g的健康成年SpragueDawley(SD)大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。1.2 主要试剂与仪器 丙烯酰胺、溴酚蓝、甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,N四甲基乙烯二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝染料R250等购自Sigma公司；二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、基质α氰基4羟基肉桂酸(CCA)、三氟乙酸(TFA)等购自Promega公司；乙二胺四乙酸(EDTA)购自GibcoBRL公司；苯甲基磺酰胺(PMSF)购自深圳赛泰克生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、3(3胆酰胺丙基)二乙胺1丙磺酸(CHAPS)购自Calbiochem公司；考马斯亮蓝染料G250、低分子量标准蛋白、线性固相pH梯度预制胶条(pH 310NL，18cm)、IPG缓冲液(pH 310NL)、银染试剂盒等购自Amersham Pharmacia Biotech公司。Ernst Leitz Wetzlar显微镜(德国)；JY92超声波细胞粉碎机(宁波新芝)；Beckman L765超速离心机(美国Beckman公司)；自动凝胶染色仪(美国Hoefer公司)；IPGphor固相pH梯度等电聚焦仪、Ettan Dalt II电泳仪、Powerlook 2100xl图像扫描仪、ImageMaster5.0 2DElite图像分析软件(瑞典Amersham Pharmacia Biotech 公司)。1.3 实验方法1.3.1 FGR动物模型的建立5及分组 动物饲养室内温度控制在2632，湿度控制在85%左右，所有动物均无交配史，于发情期将雌、雄大鼠按照21比例合笼过夜，次日清晨行生理盐水阴道拭子涂片，以显微镜下检出精子之日定为受孕第1天，即分笼饲养，供应足够的水、饲料。孕鼠随机分为2组，模型组及对照组各15只。模型组于妊娠118d置于自制容器中，每天分别于800和1800各吸烟1h，每次燃烟量4支；对照组每天于同样时间段在相同容器中，不施加任何干预，待其自然分娩。以正常组新生鼠体重的第10百分位数为标准，模型组新生鼠体重低于此值者为FGR组6，正常组新生鼠为对照组。1.3.2 仔鼠海马组织蛋白质样品的制备 随机取出生后8周的FGR组和正常对照组雌性大鼠各3只，快速断头处死后，迅速冰台上取出大脑，冰浴下分离海马，预冷三蒸水洗去血渍，称重。剪碎组织，研磨成粉末，装于2mL离心管中。样品按150g/L的比例与裂解液(40mmoL/L TrisHCl，pH 8.5；8mol/L尿素；40g/L CHAPS；5mL/L两性电解质)混合，并加入终浓度为1mmol/L PMSF，2mmol/L EDTA，40mmoL/L的DTT处理样品。冰浴下超声匀浆5min(超声2s；间隔3s)，于4 14000r/min离心30min，上清和沉淀分开保存于-80冰箱。改良Brodford法7测定上清蛋白质浓度。1.3.3 双向电泳 双向电泳第一向为固相批pH梯度等电聚焦(Immobilized pH gradients, IPG)，第二向为十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)。采用胶内加样(ingel rehydration)，蛋白上样量为200μg/胶，上样总体积是350μL，用pH 310 NL 18cm IPG胶条在25恒温下进行等电聚焦(电压8000V，总电压时间积46000Vh)，之后分别在含10g/L DTT和25g/L碘乙酰胺的平衡液中平衡15min，行垂直SDSPAGE电泳。参考GRG 8方法，将电泳参数适当调整后进行大鼠海马蛋白质双向电泳。1.3.4 银染 待分析的凝胶放入固定液中(含400mL/L 乙醇、100mL/L冰乙酸)固定30min；加入增敏液(含300mL/L乙醇、2g/L硫代硫酸钠、68g/L乙酸钠)敏化30min；去离子水洗涤3次，每次10min；加入2.5g/L硝酸银溶液(含0.148g/L甲醛)染色20min；去离子水洗涤2次，每次1min，加入显影液(25g/L无水碳酸钠和0.074g/L甲醛)显影至斑点清晰为止；加入终止液(含14.6g/L乙二胺四乙酸二钠)，终止10min；去离子水洗涤3次，每次5min；最后用10mL/L冰醋酸，4保存。1.3.5 图像采集与分析 染色后的凝胶用图像扫描仪获取图像，光学分辨率采用600dpi，像素深度12 bits。数字化图像文件运用ImageMaster 5.0胶分析软件分析，比较蛋白质斑点差异。图像分析过程包括蛋白点的检测、量化、背景消减和点的匹配。图像分析时首先将同组的3张双向电泳凝胶拟合成1张平均胶，以正常对照组大鼠海马蛋白质平均胶为参考胶，FGR组平均胶与之比较。根据斑点的位置、大小、形状等参数，图像分析软件自动将不同图像中的相同蛋白质点匹配，与参考胶中同一蛋白质点相匹配的点为同一蛋白质。蛋白质点的量被定义为构成这个点的所有像素强度值的总和，并用一个蛋白质点的量占该胶内所有蛋白质点总量的百分数进行校正，不能匹配的蛋白质点视为差异点。蛋白质分子的等电点和相对分子质量根据IPG胶条pH标示范围和相对分子质量蛋白标准品测算。2 结果 FGR组大鼠与正常对照组大鼠海马蛋白质双向电泳银染图谱见图1。两组大鼠各3只，共进行3对独立的双向电泳，使用ImageMaster5.0胶分析软件对两组6块胶图进行分析，结果显示胶图上的蛋白质点清晰，分离较好。组内胶图的平行性较好，FGR组3块平行胶点数分别为802、779、842，平均点数为807；对照组3块平行胶点数分别为737、570、778，平均点数695。FGR组大鼠海马蛋白总数稍多于正常对照组大鼠。蛋白质等电点和分子质量分布范围广，但多数集中在等电点pI 47、相对分子质量2000067000范围内。对2张胶图进行数字图像分析匹配后，各组匹配的蛋白质点数分别为647和626(图2)，其中有18个蛋白质点仅在FGR组大鼠海马蛋白电泳胶图中表达，28个蛋白在2组大鼠海马组织中含量发生了3倍以上的变化，其中FGR组上调25个，下调3个。3 讨 论 人类基因组计划已经进入后基因组时代，即功能基因组时代，蛋白质组学作为功能基因组学的重要支柱应运而生，成为21世纪生命科学发展的先导9。蛋白质组学是对一个基因组或一种细胞、组织、器官所表达的全部蛋白质成分进行分析，从蛋白质水平揭示疾病本质，具有重大理论与实践意义1011。作为基因功能的直接体现者，蛋白质构成细胞并发挥各种功能，是所有生命现象(遗传、健康、疾病等)的执行体，不仅是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子，也是大多数药物的药物靶点12。通过对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现疾病不同时期的蛋白标志物，这样不仅可以为疾病的早期发现提供重要的诊断指标，还对药物的发现具有指导意义。双向电泳技术由于具有高分辨率和高灵敏度成为分析复杂蛋白混合物的基本工具，是蛋白质组学研究的核心技术。 FGR是指胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的两个标准差或第10百分位数，是世界性的围生期严重并发症，发病率为2.75%15.53%13。FGR子代神经系统发育异常如脑瘫、智力障碍、行为异常等远比正常儿高，其发病机制目前尚不清楚。应用蛋白质组学技术可能对深入研究FGR子代学习记忆障碍的发病机制有所帮助。 本研究通过建立FGR动物模型，利用蛋白质组学技术，比较FGR子代大鼠与正常大鼠海马蛋白质组的双向电泳图谱，筛选出一些差异蛋白质点，进一步的研究工作是对这些筛选出来的差异蛋白质点进行质谱分析，明确这些蛋白质的身份及生物学功能，阐明其在FGR引起子代中枢神经系统发育异常中的具体作用，以深入研究FGR引起子代学习记忆障碍的可能分子生物学机制。实验结果显示，FGR组大鼠与正常对照组大鼠海马蛋白存在明显差异，主要表现在双向电泳图谱蛋白质斑点的增减以及染色面积的大小和染色的深浅上，提示FGR组大鼠海马蛋白发生了质和量的变化。这种变化可能原因是，孕期引起FGR的因素导致胎儿中枢神经系统发育异常，并且这种影响延续至子代出生后。FGR引起胎儿神经系统发育异常的蛋白质变化的研究国内外报道甚少。我们的研究应用蛋白质组学技术作为手段和方法，根据蛋白质斑点的相对分子质量和等电点以及蛋白来源等信息，利用MASCOT蛋白质组搜索引擎，对部分差异蛋白点进行检索，初步推测发生变化的蛋白质可能是一些与转录、细胞凋亡、钙调蛋白系统、信号传导系统以及内皮细胞一氧化氮合成酶系统相关的一些蛋白。鉴定这些蛋白质的成分，进而有针对性地对其分析，将有助于深入了解FGR引起子代学习记忆障碍的发病机制，并为早期预防和治疗FGR子代中枢神经系统发育异常提供可能的理论依据，为研究FGR子代高级神经系统发育异常的后续工作打下基础。【参考文献】 1AUCOTT SW, DONOHUE PK, NORTHINGTON FJ. Increased morbidity in severe early intrauterine growth restriction J. J Perinatol, 2004, 24(7): 35440.2BERGVALL N, ILIADOU A, JOHANSSON S, et al. Risks for low intellectual performance related to being born small for gestational age are modified by gestational age J. Pediatrics, 2006, 117(3):460467.3SIZONENKO SV, BORRADORI TC, BAUTHAY DM, et al. Impact of intrauterine growth restriction and glucocorticoids on brain development: insights using advanced magnetic resonance imaging J. Mol Cell Endocrinol, 2006, 25(7):163171.4黄谱，苟文丽，蒋马丽，等. 胎儿生长受限模型大鼠子代空间学习记忆能力改变的研究 J. 四川大学学报(医学版), 2008, 39(4):627630.5柯志勇，刘军，邱小汕. 三种宫内发育迟缓大鼠模型方法的比较 J. 中国当代儿科杂志, 2000, 2(1):2426.6MAULIK D. Fetal growth compromise: definitions, standards, and classification J. Clin Obstet Gynecol, 2006, 49(2