基因工程在抗生素生产上的应用.doc

基因工程在抗生素上的应用姓名：XXX学号：2008311XXXX学院：XX学院班级：XXXX0801中国武汉二一 年 十一 月【摘 要】抗生素是一种生物体产生的在现代医学中常用的化合物，人们对抗生素产量和种类的需求日益增加。本文简要介绍了基因工程技术可能对抗生素生产所起的积极作用。【关键词】抗生素 生产 基因工程1 引言基因工程技术就是利用实验方法将所要重组对象的目的基因，即目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，产生稳定整合，构建成能产生外源基因控制的预定的目标产物的工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。利用基因工程技术进行药物制造的主要步骤是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等1。利用基因工程技术生产药品具有诸多优点：利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用建立有效的保障。可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。内源性生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造。利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程是生物技术的重要部份，是医药产业发展的支柱。就表达的代谢产物而言，基因工程是发酵工程、酶工程，细胞工程的核心部份在抗生素生产中构建工程菌后，它也是其它工程的龙头部份2。2 抗生素抗生素是微生物（包括细菌、真菌、放线菌等）或动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，以及用化学方法合成或半合成等其他方法衍生的化合物，对许多其它微生物（如细菌、真菌、立克氏体、支原体和衣原体等）有抑制或杀灭作用3。研究表明，抗生素除抗菌作用外，还有抗肿瘤、抗病毒、抗原虫、抗寄生虫和抑制某些特异酶的功能。至今发现的天然抗生素有9000多种，微生物产生的就多达3000种以上4。根据来源可将抗生素分为放线菌产生的抗生素、真菌产生的抗生素、细菌产生的抗生素和动植物产生的抗生素四种；根据抗生素的作用可将抗生素分为抗细菌类、抗真菌类、抗结核分支杆菌类、抗癌细胞类、抗病毒和噬菌体类及抗原虫类六种。常见的抗生素有青霉素、链霉素、四环素、红霉素、庆大霉素等。3 抗生素的生产3.1 抗生素生产的一般过程任何一类微生物来源的物质的生产都可由“菌种选育扩大培养产物分离和提纯”这三个阶段来概括，抗生素作为微生物的次级代谢产物，主要产生和积累于微生物连续培养的稳定期，因此也可以通过发酵工程的技术手段来生产。而基因工程则主要应用于菌种的选育阶段。3.3 菌种的选育3.3.1 诱变育种诱变育种是一种普遍使用的育种方法，而在微生物育种中更为常见，同时也是提高微生物生产能力的有效手段。自然状态下的突变率仅10-8左右，而用物理或化学方法处理能使突变频率提高1000倍以上，但由于突变的不定向性，使所需的突变性状极少出现。近年来人们正在设法使诱变相对定向化5，并结合其他手段，以提高诱变效率。3.3.2 原生质体融合微生物原生质体融合技术是发展于20世纪70年代，即把二个亲株的细胞壁分别通过酶的作用加以剥除，并在高渗环境中释放出只被原生质膜包着的球状原生质体发生混合，继而在PEG、电刺激等的作用下，细胞质发生融合，使二套基因组之间发生接触、交换，进行基因组的遗传重组，即可在再生细胞中获得重组子6，从而获得同时具有两个亲株性状的新个体。3.3.3 常规杂交常规杂交在微生物育种中一般指接合重组。据Mazieres等7报道卡那霉素产生菌和巴龙霉素产生菌阻断变株经杂交后可得到新霉素产生菌；利福霉素B产生菌和利福霉素W产生菌进行种内杂交形成的重组体，可产生几种新的经基化或脱氨基衍生物8。通过杂交产生新抗生素的机制十分复杂，多数难以判断是什么基因发生了转移，也有可能是原来存在于受体菌株中的“静止基因”发生了活化和表达，但不同产生菌的杂交仍是获得新衍生物的一个重要方法。另外，常规杂交常常用来制作染色体图和进行基因定位，这对于研究抗生素产生菌的遗传背景是极为有用的。3.3.4 基因工程这是目前最为理想的定向育种新方法。把亲缘关系或近或远的菌株的基因进行体外重组，可使有用产物的基因数量扩增实现高产，或可得到新物质。抗生素产生菌的生化代谢过程仍然不太清楚。近年发现有几十种抗生素合成过程受质粒影响，在多数情况下，质粒与抗生素的产生并不存在明确的相关注，只起某种词节作用。但链霉菌质粒的分离、提纯及在大肠杆菌中的克隆化技术上还有相当困难。抗生素分子的合成过程涉及儿十个酶，应确定这些酶的结构基因是否以一个操纵子的形式存在，如果抗生素合成酶结构基因在链霉菌中是以分散的形式存在，则将大大增加基因工程的困难。最近的研究结果表明，至今已确定的抗生素合成酶结构基因均以基因簇(dusters)的形式存在，而且大都定位于环状染色体基因图的下半圆上。这对于基因工程的应用展示了光明的前景。基因工程在抗生素研究中的应用主要涉及克隆载体、抗生素生物合成基因的克隆与表达。4 基因工程技术在抗生素生产过程中的几类应用4.1 提高抗生素的产量4.1.1 增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数增加生物合成中限速阶段酶系基因剂量有可能提高抗生素的产量。抗生素的生物合成基因成簇存在于菌体内，包括抗性基因、结构基因、调节基因，各基因之间以种种机制相互制约，相互调控，配对同步翻译，通过基因重组修饰可以提高产量。现已知晓，抗生素的产量与产生对该抗生素的抗性基因密切相关，因此可以通过外源抗性基因的拷贝数来提高菌种的抗性水平，达到提高产量的目的，如卡那霉素的抗性基因6-N-乙酞转移酶基因克隆到多拷贝数质粒pIJ702，然后转人卡那霉素产生菌卡那链霉菌ATCC12853中，得到的转化子产卡那霉素能力提高6倍，转人新霉素产生菌弗氏链霉菌ATCC10745，含重组质粒的转化子，产生抗生素能力亦有显著提高9。4.1.2 通过调节基因的作用调节基因的作用可以增加或降低抗生素的产量，在许多链霉菌中关键的调节基因嵌在控制抗生素产生的基因簇中，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的组成部分。正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调节，加速抗生素的产生。负调节则反之。因此，增加正调节基因或降低负调节基因的作用也是一种增加抗生素产量的可行方法。4.2 改善抗生素组分Hoopwood在1981年提出链霉菌之间生物合成基因重组可以产生新抗生素，其后率先利用基因克隆技术成功地将放线紫红素产生菌羟化酶基因转人Medennycin产生菌中并使之表达获得杂合抗生素Medennycin，将放线紫红素生物合成途径基因转移到Granatin产生菌内，通过两个不同链霉菌相互作用产生地杂合抗生素Dihydrogranatiylhodin(二氢榴菌紫素)10。-内酞胺抗生素是临床应用最广泛的抗生素，其生物合成途径研究最彻底，合成基因已被克隆和测序表达。其中编码异青霉素N合成酶（IPNS）即环化酶的研究倍受重视。因为，它是前体氨基酸L氨基己二酸(A)、L撷氨酸(V)、L半胺氨酸(C)转化为LLD-ACV三肤进而环化为青霉素，头孢霉素母核的关键酶。由于IPNS的专一性不强，可利用A、V及发生修饰的ACV类似物进行三肤合成并环化，研究证明采用150种人工合成的三肤底物进行体外酶促反应，发现有80种不同程度地转化产生-内酞胺衍生物，其中1/4有抗菌活性，意味着利用IPNS酶的催化特性，应用适当三肤底物可以合成全新的件内酞胺类抗生素。4.3 改进抗生素生产工艺半合成头抱菌素7ACA制造法，目前国内外仍以化学裂解法生产。最近国外报道二步酶法生产7ACA。头孢霉素酞基转移酶不能直接水解头抱菌素生产7ACA，必须先将头孢霉素C侧链氨基氧化为酮基才能进行水解，现已实现D一氨基酸氧化酶(DAO)编码基因和头孢霉素酞基转移酶编码基因直接转人头孢霉素C工程菌的构建工作，可直接制备7ACA。虽然，目前收率不高，但展现了基因工程的美好前景11。5 总结和展望抗生素在今后相当长的一段时间内仍将在人类医学事业中承担不可替代的重要作用，人们对抗生素的种类和产量也将有着越来越高的要求。但令人感到庆幸的是同样快速前进的基因工程技术，基因工程技术的使用将极大地推进抗生素的研究速度，提高抗生素的产量。参考文献1 夏焕章，熊宗贵，生物技术制药1999，P16，北京：高等教育出版社2 林文良，基因工程在抗生素生产研究中的应用，Strait Pharmaceutical Journal1999，11（1）：133 冯国明，如何正确认识和使用抗生素添加剂，湖南饲料2010，2：28304 韦革宏，杨祥，发酵工程2008，P203，北京：科学出版社5 Smith M et al，Trends Biochem，Sci1982，7：4406 朱建伟，朱为敏，遗传学方法在抗生素生产菌育种中的应用，中国医药工业杂志1989，20（2）：83897 Mazieres N et al，J Antibiot1981，34：9658 Schupp T et al，Ibid1981,34：9659 Cramert RD et