（生物物理学专业论文）纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 摘要 纳豆是日本的一种传统大豆发酵食品，由纳豆菌( b a c i l l u sl l a ，砌在一定的温度和 湿度条件下，通过发酵蒸煮大豆制备而成，它被认为是日本人长寿的“秘方”。纳豆的营 养价值和保健价值都很高，每百克纳豆含有蛋白质3 1 2 克，脂肪1 9 9 克，碳水化合物 2 2 8 克；钙33 1 m g ；磷5 0 3 m g ；铁13 7 r a g ；纳豆的蛋白质中，合有全部的人体必须氨基 酸，可与牛肉相比美，蛋白质中有5 0 以上是水溶性蛋白质，还富舍不饱和脂肪酸，亚 麻油酸、脂质、卵磷脂等，富含b 族维生素，特别是补血的维生素b ，：较多。经常食用 纳豆具有抗氧化，抗衰老、溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，还可预防骨质疏松、 提高蛋白质的消化率。 纳豆激酶( n a t t o k i n a s en k ) 是纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t f s n a f f 。) 产生的一种丝氨酸蛋白酶。1 9 8 7 年日本学者须见洋行首先发现。通过研究发现， 纳豆激酶具有纤溶活性，可治疗和预防血栓病，它还可激活体内的纤溶酶原，从而增加内 源性纤溶酶的量与作用。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品， 如链激酶( s t r e p t o k i n as e ，s k ) 、尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) 、重组组织型纤溶酶原激活荆 ( r e c o m b i n a n t t is s u et y p e p l a s m i n o g e na c t i r a t o r ，r t p a ) 、对甲氧苯甲酰纤溶酶原链激 酶激活剂复合物( a n is o y l a t e dp l as m i n o g e n s t r e p t o k i n as ea c t i v a t o rc o m p l e x ，a p s a c ) 和尿激酶原( p r o u r o k i n as e ，p r ou k ) 等，均在不同程度上存在一定的缺陷，或者毒性比较 强、副作用比较大，或在体内半衰期比较短，药效难以发挥，或来源紧缺、价格昂贵，很难 成为一种犬众药品。纳豆激酶却有望弥补这些缺陷，因此国内外学者认为它极有可能成 为新一代抗检药物。近年来，国内外学者掀起对纳豆和纳豆激酶的研究热潮。 本论文对纳豆激酶固态发酵奈件优化，分离纯化及其应用性等几个方面进行了研 究，最终得到了如下的结果： 从日本市售纳豆产品中，分离出6 株纳豆茵，定名为1 。一6 ”；日本成赖研究所提供 的2 株菌株7 。和8 + 、荷兰友人赠送的一株菌株9 + 。以各个菌株产纳豆激酶和超氧化物 歧化酶的能力为控制指标进行筛选，挑选出一株生产纳豆激酶和超氧化物歧化酶均较高 的菌株( 64 ) ，定名为n s - 6 ；产纳豆激酶较高的菌株( 4 + ) ，定名为n s 一4 。 以n s 一6 菌株为出发菌株，通过混合菌种发酵扣添加不同的调味物质改进纳豆的口 味。结果表明：接种量为4 、食盐的添加量为4 、蔗糖的添加量为8 、山楂果珍粉 0 2 、蜂蜜0 1 、发酵培养2 6 小时，纳豆的口味较好，没有氨味，而且黏液较多。 口味中甜的成分不是很大，结果较好适合中国人的口味。从根本上调节了纳豆口味不 适合中国人的特点。 吉林农业大学硕士学位论文纳豆最酶的固体发酵，分离纯化及应用研究 以n s - 4 菌株为出发菌株，对固体发酵生产纳豆激酶的培养条件和培养基进行了优 化，考察了物料厚度、含水量、发酵时问以及大豆培养基中添加附加碳源、氮源、磷酸 盐、金属离子等对发酵产酶的影响。结果表明：固体发酵的培养条件为物料( 大豆) 厚 度在2 c m 以下，起始p h 自然，培养温度为3 7 ，相对湿度为6 0 一7 0 ，发酵时间为 2 4 小时。种子培养基最佳碳源为葡萄糖，浓度为1 ；最佳氮源为蛋白胨，浓度为1 5 。种子培养基的配方纽成为：蛋白胨1 5 ，葡萄糖1 ，酵母膏0 1 ，氯化钠0 3 。发酵培养基的配方组成为：5 0 9 浸泡大豆，0 1 的麦芽糖、o 1 半乳糖、水分含量 5 0 ，于2 5 0 m l 三角瓶中。采用以上的优化配方，结合最佳的培养条件进行发酵培养， 重复3 次试验，取平均值，纳豆激酶的产量基本稳定在2 2 5 0 i u g 大豆，约为最初产酶 量的两倍。 本实验通过对纳豆粗提物的分离纯化，提高纳豆激酶的溶栓活性，为抗捡药物制刑 的开发提供科学的依据。溶栓酶的活性采用纤维蛋白平板法测定，分离结果采用 s d s p a g e 凝胶电泳进行检测。对硫酸铵分级沉淀以及凝胶过滤分离纳豆激酶的条件进行 了优化，结果表明：3 0 牵7 0 的硫酸铵浓度对去除杂蛋白开口沉淀纳豆激酶作用较好。 s e p h a d e x g 5 0 凝胶过滤的流速为0 5 m l m i n ，分离纯化倍数为1 9 倍，收率为4 2 i 。 以高效液相色谱法对大豆发酵制品( 纳豆，纳豆冻干粉) 中的大豆异黄酮组分 d a i d z e i n 进行了测定，结果表明：发酵后其异黄酮组分d a i d z e i n 含量均显著提高。 对纳豆及纳豆激酶制品进行了应用研究。初步设计了生产适合中国人口味的纳豆的 生产x - 艺路线，开发了以纳豆为原料的相应产品。并对纳豆激酶制品的应用开发提供了 技术基础和应用方案。希望能够为吉林省大豆资源的转化，提高大豆产品的附加值作出 应有的贡献。 关键词：纳豆纳豆激酶固体发酵分离纯化纤维蛋白平板法 i l 吉林农业大学硕士学位论文 纳豆馓酶的固体发酵、分高纯化及应用研究 b s t r a c t n a t t oi sak i n do ft r a d i t i o n a ls o y b e a nf e r m e n t e df o o di nj a p a n i ti sm a n u f a c t u r e db y m i x i n gs t e a ms o y b e a n ，i n o c u l a t i n gb a c i l l u sn a t t ot ot h em i x t u r ea n dc u l t u r i n gu n d e rd e f i n i t c t e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t y i ti sc o n s i d e r e dt h es e c r e c to fl o n g e v i t yo fj a p a n e s e n a t t oh a v ea l a r g en u m b e ro f n u t r i t i o n a la n dh y g i e n i c a lv a l u e t h ep r o t e i ni s3 1 2 9 ；f a ti s 19 9 9 ；c a r b o h y d r a t e i s2 2 8 9 ；c ai s3 3 l m g ：pi s5 0 3 m g ；f ei s1 3 7 r a gp e r1 0 0 9n a t t o a n dt h ep r o t e i no f n a t t oi n c l u d e a 1 1t h ep r e r e q u i s i t ea m i n oa c i d c a l lb ec o m p a r e dw i t hb e e f u p w a r d so f5 0 i sw a t e r - s o l u b i l i t y p r o t e i n t h e r ea r eag r e a td e a lo fu n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，l i p i d ，l e c i t h i n ，v i t a m i n b ，e s p e c i a l l yt h e v i t a m i n b l 2 ，e t c e a t i n gn a t t of r e q u e n t l yw i l lh a v et h c t i o no fa n t i o x i d a n t ；a n t i d o a t ；d i s s o l v i n g t h r o m b u s t i c ，a n t i t u m o u r 、d e p r e s s i n gb l o o dp r e s s u r ee t c n a t t o k i n a s e ( n k ) i sas e r i n ep r o t e a s ee n z y m et h a ti se x t r a c t e df r o mat r a d i t i o n a l f e r m e n t e df o o di nj a p a n i ti sf i n d e db yx u j i a n y a n g h a n gd o c t o ri n1 9 8 7 i ti s r e p o r t e dt h a tn k h a v ea s t r o n gt h r o m b u s t i cf u n c t i o n c o m p a r e d w i t ht h e t h r o m b o t y t i ca g e n t ss u c ha s s t r e p t o k i n a s eu r o k i n a s ea n dr e c o m b i n a n t t i s s u et y p e p l a s m i n o g e na c t i v a t o r ，n a t t o k i n a s ei ss a f e r a n de a s i e rt ob ea b s o r b e d n a t t o k i n a s eh a sl o wm o l e c u l a rw e i g h t ，m o r ed i r e c ta n dp e r s i s t e n t e f f e c to nt h r o m b o s i s a tt h es a m et i m e ，i tc a nb ef e r m e n t e db yb a c t e r i a ，w h i c hw i l ll o w e rt h e p r o d u c t i o nc o s t s on a t t o k i n a s ec a l lb ed e v e l o p e da san e wf i b r i n o l y t i cm e d i c i n e ， t h i sp a p e rs t u d yo nt h et h es o l i df e r m e n t a t i o no fn a t t o k i n a s e ，p u r i f i c a t i o n ，a n dt h e a p p l i c a t i o no fn a t t oa n dn a t t o k i n a s e a tl a s t , t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： w eg e ts i xb a c i l l u sn a t t os t r a i n sf r o mt h en a t t oo fj a p a n e s em a r k e t ，t o g e t h e rw i t ht w o s t r a i n sf r o mc h e n g l a ig r a d u a t es c h o o l ；o n es t r a i n sf r o mh o l a n df r i e n ds t o r e di nl a b w e c o m p a r e dt h ea b i l i t y t op r o d u c en a t t o k i n a s ea n ds u p e r o x i d e as t r a i n w a ss e l e c t e da n d n a m e dn k 一6 ，w h i c hh a v ec a p a b i l i t yo fp r o d u c i n gh i g hy i e l do fn ka n ds o d b a s i n go f fa s i m p l es o l i dm e d i u m a n o t h e rs t r a i nw a ss e l e c t e da n dn a m e dn k 一4 ，w h i c hh a v ec a p a b i l i t yo f p r o d u c i n gh i g hy i e l do f n kb a s i n go nas i m p l es o l i dm e d i u m u s i n gn k 一6 ，t h es o l i df e r m e n t a t i o nw a so p t i m i z e d t h eo p t i m a lc o n d i c t i o n ：i n o c u l a t i o n q u a n t i t y , 4 c u l t u r et i m e ，2 6 h s a l t ：s u g a r 。2 ：1 s a l t , 4 ；t h e t a s t eo fn a t t oi s g o o d n o l i i 吉林农业大学预士学位论文 纳豆澈酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 a m m o n i a st a s t e ，i ti ss u i t a b l et oc h i n e s e t h em e d i u mc o m p o n e n t sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h en a t t o k i n a s ep r o d u c t i o nb y b a c i l l u sn a t t os o l i df e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d t h eo p e r a t i n gf a c t o r s ，i n c l u d i n gt h et h i c k i n g o fs o y b e a n ，i n i t i a lw a t e rc o n t e n t ，f e r m e n t a t i o nt i m e ，a p p e n d a n tc a r b o na n dc o n d i t i o n sw e r e d e t e r m i n e da sf l o w ：t h et h i c k n e s so fm a t e r i a l s2 o c m ；n a t u r a li n i t i a lp h ；c u l t u r et e m p e r a t u r e ，3 7 r e l a t i v eh u m i d i t y , 6 0 一7 0 ；a n df e r m e n t a t i o nt i m e 2 4 h t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s o p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o r sa n dp r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ：5 0 9 s o y b e a n ，l gm a l t o s e ，l gg a l a c t o s e a n d5 0 i n i t i a l w a t e rc o n t e n t t h eo p t i m i z e dc o n d i c t i o na l l o w e dt h en kp r o d u c t i o nt ob e i n c r e a s e df r o m10 0 0 i u gt o2 2 5 0 i u 值d r ys o y b e a n i ti sa b o u th i 曲e rt w i c et h a ni n i t i a l p r o d u c t i o n i no r d e rt oi n c r e a s et h ef i b r i n o l y t i ca c t i v i t yo fn a t t o k i n a s e ，t h ec r u d ee x t r a c to fn a t t ow a s p u r i f i e db yu s i n gs e p h a d e x g 5 0c h r o m a t o g r a p h y ，f i b r i n o l y t i ca c t i v i t yf r a c t i o n sw e r es e l e c t e d t h r o u g ht u b em e t h o d f i b r i n o l y t i ca c t i v i t yo f n a t t o k i n a s ew a sm e a s u r e da c c o r d i n gt ot h ef i b r i n p l a t em e t h o d t h em o l e c u l a rw e i g h to fn a t t o k i n a s ew e r ee v a l u a t e di ns d s - p a g ea f t e r i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n e f f e c t i v ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r e so fn kw e r e s t u d y e db y ( n h 4 ) 2 s 0 4f r a c t i o np r e c i p i t a t i o na n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h eo p t i m a ls a t u r a t e d c o n c e n t r a t i o no f ( n h 4 ) 2 s 0 4w a s3 5 a n d7 0 ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yw e r et h a tt h ev e l o c i t yo 5 m l m i n l t h er e s u l t s h o w st h ee n z y m ea c t i v i t y r e c o v e r yi s4 2 1 p u r i f i c a t i o nf o l d si s1 9 a tl a s t ，w ec o n s i d e r e dt h ea p p l i c a t i o no fn a t t oa n dn a t t o k i n a s e w eg o tt w ok i n d so f p r o d u c t s a n dd e s i g n e ds e v e r a l p r o d u c t sf o r m a t i o n w ep r o v i d e d t h e g r o u n d w o r ka n d a p p l i c a t i o np r o j e c tt oi m p u l s et h ep r o c e s so f i n d u s t r i a l i s t i o no f n o v e ls o y b e a np r o d u c t s k e yw o r d s ：n a t t on a t t o k i n a s es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o np u r i f i c a t i o n f i b r i np l a t e m e t h o d v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论义是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材荆。与我一同丁作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。， 学位论文作者签名：矛闻、1 签字日期： 。，r 年砖月。? 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等；复制手段保存、汇编学 位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：辛，i 孙j 签字f _ _ = | 期：。，年p 6 月，7 日 学位论文作者毕业去向：奇秆枷甚 通讯地址 专杆咿移埔、螂瓣术脚抄 气秘籽冯，蛳积木爷t 导师签名：氆、射 签字日期：p r 年口护月。7 日 电话：，辛) n 易彦净，u 邮编：f 净p f f 箩 吉林农业大学硕士学位论文纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 1 前言 1 1 纳豆概述 1 1 ，1 、纳豆的起源 纳豆一词来自日本平安时代( 7 9 4 1 1 9 2 年) 。当时寺庙的厨房都称做“纳所”，纳豆 来自僧人的素食。另据史料记载，纳豆起源于日本江户时代，距今已经有近百年的历 史。还有传说，是鉴真和尚将中国云南的豆豉传到日本后变成纳豆。它是- - s t 大豆发酵 食品，深受f j 本人的喜爱”i 。市场上销售的纳豆以咸味为主，日本本土年销售纳豆1 22 0 万吨。近年来由于医学专家发现纳豆有溶血栓、防治骨质疏松、抑制大肠杆菌病毒等功 效，吃纳豆的人越来越多。 1 1 2 、纳豆的生产 纳豆作为日本一种历史悠久的传统大豆发酵食品，它被认为是日本人长寿的“秘方”。 纳豆的制作工艺分传统法和工业法两种，传统法依地区和配方不同而各有差异，工业法 全国比较统一。“。其传统的制作方法是将黄豆浸泡，煮熟后，包在用热水消毒过的稻草 中，利用稻草中的芽孢杆菌发酵而得。现代化生产则是将煮熟的大豆接种纳豆菌( b n ) 制得。 1 1 3 、纳豆的营养价值 纳豆在制作过程中，原料大豆所含的氨基酸，不仅不减少，反而由于发酵过程中 所产生的蛋白酶的水解作用而增加。纳豆的蛋白质中含有全部的人体必须氨基酸，可与 牛肉相比美。同时由于发酵使大豆蛋白质分解，纳豆的消化率( 8 5 ) 比蒸煮大豆( 6 8 ) 还高，因而营养更容易吸收。蛋白质中有5 0 以上是水溶性蛋白，还富含不饱和脂肪酸， 麻油酸、脂质、卵磷脂等。富含b 族维生素，特别是补血的维生素b 。较多。 在t 0 0 9 食品的可食部分的营养中，纳豆比蒸煮的大豆的蛋白质高0 5 9 、纤维素商 0 2 9 、钙高2 0 m g 、铁高i 3 m g 、钠高l m g 、钾高9 0 m g 、维生素b 。高0 4 7 r a g ”j 。有预防高血 压，抗氧化，抗衰老的作用。另外，纳豆中含有大量的粘性物质，其中主要成分是高聚 谷氨酸( y - - p g a ) “，y 一多聚谷氨酸因其具有较高的保湿性能，目前在食品及其他 ：1 ：业中具有广泛用途。 11 4 、纳豆的医疗功能 114 1 溶解血栓 “医食同源”对纳豆来讲，真是太恰如其分了。1 9 8 2 年，日本宫崎医科大学的须见 洋行教授从2 3 0 多种食品中发现了只有纳豆可以溶解血栓这个事实。他将脑血栓等患者 吉林农业大学硕士学位论文 纳豆澈酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 长期服用的血栓药放在1 定量的人造血栓上，花了一个晚上才溶解。而一粒纳豆放上去 仅用了： 个小时就将同样量的血栓全部溶解了。 114 ，2 防治骨质疏松症 纳豆里含有相当高的维生素k 。因骨质疏松而骨折的人恰恰是血液中维生素k ：的含 量过低。平时人们总是补钙和维生素d ，却忽略了补充维生素虬。维生素k ：可骨蛋白质， 而这种蛋白质可以与钙共同生成骨质，增加骨的密度，须见博士做了一个试验，吃1 0 0 9 纳豆4 小时之后血液中的维生素的浓度可以增加为原来的7 0 倍。因此他建议，为了防治 骨质疏松症，即便不是每天吃纳豆，至少每周也要吃两次。但实际上，由于健康普及讲 座和电视的宣传，在日本每天都吃纳豆1 n 2 次的人随处可见。这也反映了日本人对纳豆 的重视程度。1 9 9 5 年，东京大学医学部曾对6 0 0 0 名6 0 岁以上的骨质疏松患者做过调查研 究，结果证实，服用维生素k ：不仅可以减缓腰疼，而且骨骼的重量也增加了。还证实了 易患骨折的人，其血液中的维生素k 。的浓度仅为健康人的二分之一左右。 1 1 4 3 抗菌，消毒 通过须见博士对纳豆的抗菌功能的研究表明：将纳豆加入0 1 5 7 病毒里4 天之后，病 毒全部被抑制而死亡。通过研究，纳豆菌之所以能够抗菌消毒，是因为它能产生吡啶二 羧酸等抗菌物质。而且，纳豆也正是由于有了这些很强的抗菌物，才会在充分发酵之后 不易腐烂。常食纳豆对癌症、糖尿病、高血压、动脉硬化、肥胖病、妇女痛经等可以起 到预防和缓解及治疗的作用。 11 44 调整肠功能 大豆中约有2 8 的碳水化合物，其中2 3 是半纤维素、纤维素和木质素等食物纤维， 这些食物纤维在食用后可防止便秘、预防大肠癌和直肠癌，还可起到防止甘油三酯的 增加和降低血清胆固醇等效果。另外，食用纳豆后，纳豆菌在肠中发芽增殖，作为营养 物质能在肠内生活几周，分泌各种酶和维生素，促进小肠粘膜细胞的增殖。同时纳豆中 的纤维素类物质可以与寡糖偶合，从而促进双歧杆菌增殖，对肠道菌群的微生态平衡起 重要调节作用，保证肠功能的正常。 1 2 纳豆中的其他功能因子 1 2 1纳豆激酶 12 1 1 纳豆激酶的发现 纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ) 是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯 草杆菌( b a c h u ss u b t i l i s 门口z t 国产生的一种丝氨酸蛋白酶，1 9 8 7 年由日本的须见洋 行等首先发现”。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品，如链 激酶( s t r e p t o k ir i n s e ，s k ) 、尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) 、重组组织型纤溶酶原激活剂 吉林农业大学硕士学位论文纳豆澈酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 ( f e c o m b in a n t t i s sl l e t y p ep 1l ：t s i l l in o g e na c t iv a t o f ，r t p a ) 、对甲氧苯甲酸纤溶酶原 链激酶激活剂复合物( a n i s o y l a t e dp l a s m i n o g e ns tr e p t o k i n a s ea c t jv i t o rc o m p i ( a i ) s a c ) 和尿激酶原( p r o u r o k in a s e ，p r ou k ) 等”，均在不同程度上存在一定的缺陷， 或者毒性比较强、副作用比较大，或在体内半衰期比较短，药效难以发挥，或来源紧缺 、价格昂贵，很难成为一种大众药品。研究表明，n k 是一种丝氨酸蛋白酶，能显著溶解体 内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间( e l l 、) ，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激 活剂( t p a ) ，从而更有效地发挥溶栓效果“。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新型 口服溶栓药物。对纳豆激酶的研究仅有1 0 9 左右，对其了解还不是很深入，至今取得的 成果有以下几个方面： 12 ，1 2 纳豆激酶的生化特性 纳豆激酶是一种单链多肽酶，由于测定方法不同，所测得的分子量也有明显不同，根 据已测得的氨基酸序列计算出n k 的精确分子量为2 7 7 2 8 。纳豆激酶的等电点为8 6 0 3 ， 在p h 6 ，o 1 2 ( ) 情况下，n k 比较稳定，p h 低于5 0 时，则很不稳定。4 0 保温3 0 m i n ，酶活无 损失，温度超过5 0 时，活力逐渐丧失，超过6 0 。c 时，则因蛋白变性而迅速失活。反复冻融 对n k 的活性影响不大。当n k 与煮沸过的小麦或大米提取液、肉汤以及血清蛋白和胃粘液 蛋白混合后，n k 的稳定性显著提高，甚至在酸性条件下，仍保持有酶活性。说明n k 在胃环 境中能保持一定的活性，因此可通过口服纳豆激酶来达到溶栓目的。n k 的活性不受 5 m r a o 几的c y s 抑制，而l m m o l l 的d f p 、5 m m o l 几的n e g u v o n 和1 0 0 pn o 】儿的p m s f 均完全抑 制n k 的活性，从而说明n k 是一种丝氨酸蛋白酶“”。 12 1 3 纳豆激酶的生物活性 纳豆激酶的酰胺水解活性。n k 作为丝氨酸蛋白酶，其酰胺水解活性可通过人工合成 的小分子短肽作为反应底物来研究。s u m i 研究：r n k 对血浆纤溶酶、尿激酶、弹性蛋白酶、 凝血酶、激肽释放酶等酶反应底物的水解活性，发现对n k 最敏感的底物为血浆纤溶酶底 物( h dv a tl e up n a ) “。f u j i t a 钡1 定了n k 对枯草菌素和胰凝乳蛋白酶的底物以及纤溶酶 底物的动力学参数，表明n k 的最适底物是枯草菌素的底物s u ca l aa l ap r op h ep n a ，从 而说明纳豆激酶是一种类似枯草菌素的蛋白酶，n k 是第一种类似枯草菌素而有纤溶活性 的蛋白酶“。1 。以氧化型胰岛素b 链为底物，研究n k 的酶切特性发现，n k 具有严格的限制性 酶切特点，首选酶切位点在l e u l 5t y r l 6 ，其次在s e t 9 f is l o 。此外，在( ；1n 4 l is 6 ，s 5 l e u 6 位点也有微弱的水解活性。与其它一些枯草菌素不同，n k 对氧化型胰岛素b 链c 端 7 r y r l 6a l a 3 0 之间肽段却无任何酶切特性“。 121 ，4 纳豆激酶的纤溶活性 n k 最引人注目的生物学功能为强烈的纤溶活性。s u mj 用纤维蛋白平板法测定n k 的活 吉林农业大学硕士学位论文 纳豆镦酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 性，】g 湿纳豆中提取的n k 活性相当于4 0 c u 纤溶酶或1 6 0 0 i u 尿激酶。用三明治酶联免疫吸 附法测定，利用偶联h r p 的兔抗n k 抗血清作包被抗体，鼠抗n k 单克隆抗体作检测抗体，测 定n ( i ；性，灵敏度可达0 1ug 。，与枯草菌素b p n 及枯草菌素c a rl s b e r g 的交叉反应仅为 0 ，0 0 0 2 帅0 0 0 0 0 2 6 l 。此方法的n k 活性与纤维蛋白平板法测定结果相关系数为( ) 9 6 7 ， 表明n k 为纳豆中唯一有纤溶作用的蛋白水解酶。但最近的报道显示，纳豆中除了纳豆激 酶外，还存在尿激酶、弹性蛋白酶，以及尿激酶原激活剂等“”“”。这可能是由于菌株 和生产工艺的不同造成的。 1 2 1 5 纳豆激酶的结构 纳豆激酶的核苷酸序列。n a k a m u r a 首次报道了包括调控顺序在内共1 4 7 3 b p 的n k 的 d n a 序列。n k 的基因以g t g 为起始密码子，随后是l1 4 3 b p 组成的阅读框架，编码信号肽、前 肽、成熟肽在内的共3 8 1 个氨基酸。结构基因的3 末端为连续的3 个密码子t a a ，t a g ，t a a 。 终止密码子之后一段序列可形成茎环结构，即p 因子非依赖性终止序列。起始密码子上 游】7 b p 处为核糖体结合位点a a a ( ；g a g 。s d 序列上游是a ：t 含量高达7 2 的转录调控区。但 在此区尚未找到与已知枯草杆菌蛋白酶启动子相类似的保守序列“”1 。 1 2 16 纳豆激酶的药理学研究 纳豆激酶在体外和体内均具有很好的溶解血栓作用。纳豆激酶( n a t t o k ii q a i s c ，n k ) 的体外溶栓作用十分明显。n k 最早就是因为其具有显著体外溶栓效果而被发现的，n k 是 一种丝氨酸蛋白酶，可将纤维蛋白水解成小肽和氨基酸，将酶提取液滴加到纤维蛋白平 板上，即出现透明的溶解圈，酶活性越大，溶解圈越大“1 “1 。用纤维蛋白平板法和溶解时间 标准曲线法测定，n k 的比活力是纤溶酶的4 倍。纳豆激酶的体内溶栓作用通过动物血栓模 型研究n k 的溶栓活性，发现n k 不仅抑制血栓的形成，同时还有很强的溶栓作用，并在一定 范围内成量效关系。用狗作为实验动物，从狗的股大静脉注入妞清纤维蛋白原和牛凝血 酶，使其形成体内静脉血栓，纳豆激酶可使其血栓在5h 内完全溶解，血液循环畅通。用小 鼠做实验动物，研究发现n k 对小鼠血栓模型也有明显的溶栓作用。在小鼠颈总动脉中注 射醋酸造成内皮细胞损伤，生发血栓，分别静脉注射n k 、纤溶酶和弹性蛋白酶，测定血流 再通率和纤维蛋白残留率，观察体内溶栓活性。1h 后血流的再通率分别是( 6 2 0 5 。3 ) 和( 1 5 8 4 5 ) ”。说明n k 的体内溶栓效果远远大于纤溶酶和弹性蛋白酶。以大鼠为实 验动物，研究发现n k 可由消化道吸收到血液中而起纤溶作用，而且n k 在发挥纤溶作用时， 不是激活纤溶酶原，而是直接作用于交联纤维蛋白”1 。“。n k 对交联纤维蛋白水解活性很强， 但对纤维蛋白原却不敏感，提示n k 在发挥纤溶作用时，不水解血浆纤维蛋白原，不易引起 出血倾向。最近研究发现，n k 可水解纤溶酶原激活剂的1 型抑制剂( p a i1 ) ，使其失活，从 而提高纤溶作用。这是由于p ml 是纤溶作用的主要抑制剂，它与t p a 的比例可调控纤溶活 吉林农业大学硕士学位论文纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 住，i ) a i l 的失活可直接使纤溶作用增强”。健康人口服纳豆激酶的效果实验表明健康人 服用n k ，可明显缩短优球蛋白的溶解时间( i ：l t ) ，促进纤溶活性，作用时间可维持2 8h ， 大大长于目前临床上使用的溶栓药物。此外，口服n k 后优球蛋白的纤溶活性( i f a ) 和纤维 蛋白降解底物( f d p ) 值迅速升高，表明纤维蛋白迅速降解。另外发现t p a 的量不断增加，第 4d 达到最高，是未服用n k 时的1 4 倍。n k 本身无t p a 抗原性，可以认为是n k n 激血管内皮 细胞引起t p a 的增加，进一步增加了人体的纤溶活性”“”1 。而且纳豆作为传统食品，尚未见 有任何毒副作用。 1 21 7 纳豆激酶活性测定 到目前为止，对于纳豆激酶的特性、药理及生产等方面都有了进步的研究”。 纳豆激酶活性测定方法作为研究的基础，也不断地建立并得到改进。现已有的活性测定 方法主要包括以下几种。 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法是最早用于n k 活性测定的方法之一。，它是参照尿激酶( u k ) 或组织 纤溶酶原激活剂( t p a ) 的测活方法而建立的。其原理是以凝血酶和纤维蛋白原制成人工 血栓平板，注入n k ，用溶解面积来表示n k 的溶纤维活性”1 。 纤维蛋白块溶解时间法( 简称c l t 法) 纤溶酶、t p a 、u k 等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定n k 活性的方法就是根 据以上各种方法稍加变动而建立的。“。2 0 下，在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理 盐水缓冲溶液、n k 溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌。置于3 7 c 恒温水浴。从纤维蛋白形成开 始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时 间( c l ，t ) 。同样以标准n k 或u k 或纤溶酶作为标准品，以c l t 对n k 浓度的对数作图，发现在 1 0 7 0ug 范围内有很好的线性关系。与平板法相比，c l t 法迅速快捷，分辨率高，且更适 于粗酶的活性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、 方便的计时装置，否则同时测定多个样品是比较困难的。 四肽底物法 纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，具有2 7 5 个氨基酸，与枯草杆菌蛋白酶( s u b t i1 【s in ) 同源性极高，其中与枯草杆菌蛋白酶b s n 和枯草杆菌蛋白酶c a r l s b e r g 的同源性分别为 8 5 和6 9 ：而与枯草杆菌蛋白酶e 只有两个氨基酸的差异。”1 。而且n k 与枯草杆菌蛋白酶f 的催化中心和结合中心相同，因此有人用测定枯草杆菌蛋白酶e 的方法来测定n k 的活性 ”1 。其具体操作也可参照枯草杆菌蛋白酶e 的测活方法”1 。在四肽底物s u ca 1 aa i ap r o p h ep n a 溶液中加入n k 酶液，在3 7 水浴中孵育l m i n ，测定单位时间内4 1 0 n m 处光吸收的变 吉林农业大学硕士学位论文 纳豆激酶的固体发酵、分离纯化及应用研究 化。n k 的活性定义为l m i n ，水解s u ca a p fp n a 时生成1ul 一硝基苯胺的n k 量为1 l i 。该方法 简便易行，可迅速测定酶的活性。缺点是该方法所得到的蛋白酶活性并不能完全表示其 溶纤维活性，二者之间是否有相关性有待进一步试验。 血清板法 血清板法是纤维蛋白平板法的改进。“。其原理是，纤维蛋白形成初期，在6 5 5 n m 处的 吸光度最大，随着n k 的加入，使纤维蛋白溶解，从而吸光度下降。试验发现，吸光度的减少 同n k 的浓度成线性关系。在血清板的小孔内依照平板法的制作方法，制成微型纤维平板， 然后在每个孔内加入不同浓度的标准n k 。反应开始4 h 内，每3 0 m i n 钡g 定一次0 0 6 5 5 值，计 算出每个时间的0 d 6 5 5 值同初始0 0 6 5 5 值的差一a0 1 ) 6 5 5 ，利用最小二乘法算出直线的斜 率一a 0 0 6 5 5 h 。以此斜率同n k 浓度的对数作图，可得到良好的线性关系。该方法的优点 是，可以同时测多个样品，而且在4 h 内可对酶活性进行测定，操作简便、快捷，样品消耗小 成本低。另外，a o d 6 5 5 值的变异系数c v 在5 以内，可信度高。应注意的一点是，人工血 栓的制作对消光值的测定是有影响的。不过如果反应开始时小孔内的血栓的吸光值在 0 2 以上，那么人工血栓的调制对0 1 3 6 5 5 值几乎没有太大的影响。 酶联免疫吸附法( e l 。i s a ) ”2 1 该法是以对n k 有特异性的单克降抗体与n k 发生特异性结合，然后再与连有标志酶的 多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过标志酶即过氧化物酶的反应 而测定n k 的活性。先将抗n k 的单克隆抗体同n k 酶孵育，之后再同多克隆抗体结合。加入 新配制的底物溶液和2 nh 2 s o ，测定4 9 0 n m 的吸光值。该法灵敏度很好，可达到o 1n g m i 。 同时特异性好，同枯草杆菌蛋白酶b p n i i 枯草杆菌蛋白酶c a r s b e r g 的交叉反应系数分别 为0 0 0 0 2 芹d 0 0 0 0 0 2 ，由此可看出，具特异性的单克隆抗体同酶的结合位点不是催化中 心。以经典的平板法所得出的n k 溶血栓活性同e l i s a 法测得的n k 量之间具有线性关系，回 归方程为y ( e l 。i s a ) - 8 o o x ( 平板法) 一1 8 9 8 ，相关系数为0 9 6 7 。这说明e l i s a 法可以很好 地反映n k 的溶血栓活性。同时e l i s a 法同圆二色光谱等其他方法的结果相结合，对n k 的结 构探索提供了一定的参考数据，从中可以看出，温度的提高使n k 活性下降，不是因为n k 一 级结构的破坏，而可能是破坏了酶的二级结构，包括n 螺旋和b 折叠。该法的缺点是操作 复杂，成本高。 综上所述，n k 的测活方法多样，各有优缺点。如今普遍使用的仍是经典的平板法和 ( ：i 1 l 法。 i 2 2 超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶”( s o d ) 是机体超氧自由基的清除剂，广泛分布于生物体细胞内 和各种体液中，超氧自由基是由于氧代谢过程接收电子不足而形成的，对机体有毒性， 6 吉林农业大学硕士学位论文 纳豆澈锋的固体发酵、分离纯化及应用研究 与肿瘤、辐射、损伤、衰老，炎症等有重要关系，s o d f 指阻止并消除自由基的连锁反应， 具有保护机体免疫受损伤的作用，对人、畜无毒副作用。目前，类s o d 活性已经成为抗 衰老药物和抗衰老保健品的一个重要指标”j 。广泛应用于医药、保健、食品、化妆品等 领域。市场上已上市的商品有老