高中生物 5.2《多聚酶链式反应扩增DNA片断》教学设计 新人教版选修1.doc

课题2多聚酶链式反应扩增dna片段教材内容解读要点1多聚酶链式反应 多聚酶链式反应是一种体外迅速扩增dna片段的技术，它能以极少量的dna为模 板，在几小时内复制出上百万份的dna拷贝。要点2pcr原理（1）在用pcr技术扩增dna时，dna的复制过程与细胞内dna的复制类似细胞内参与dna复制的各种成分和基本条件以及各自的作用如下表：参与的组分在dna复制中的作用解旋酶打开dna双链dna母链提供dna复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料dna聚合酶催化合成dna子链引物使dna聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（2）dna的方向通常将dna的羟基(oh)末端称为3端，面磷酸基团的末端称为5端。（3）引物引物是一小段dna或rna，它能与dna母链的一段碱基序列互补配对。用于pcr的引物长度通常为2030个核苷酸。引物的作用：dna聚合酶不能从头开始合成dna，而只能从引物的3端延伸dna链，因此，dna复制需要引物。（4）dna的合成方向当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后，dna聚合酶就能从引物的3端开始延伸dna链，dna的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。（5）dna的变性与复性在80-100的温度范围内，dna的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的dna链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。（6）pcr对dna双链的解聚与结合控制pcr利用了dna的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。（7）taqdna聚合酶的应用pcr中的高温会导致普通dna聚合酶失活，而耐高温的taqdna聚合酶解决了这个问题，大大增加了pcr的效率，使pcr技术趋向自动化。（8）pcr扩增dna的基本条件pcr反应需要在一定的缓冲溶液中提供：dna模板，分别与两条模板链相结合的两种引物。四种脱氧核苷酸，耐热的dna聚合酶，同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行。 要点3pcr的反应过程pcr一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的dna单链会与引物结合，进行dna的延伸。这样，dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。要点4实验操作做pcr通常使用微量离心管，它是一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。具体操作时，用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分，再设计好pcr仪的循环程序就可以了。如果没有pcr仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为94、55和72，然后按照上表的要求，在3个水浴锅中来回转移pcr反应的微量离心管即可。pcr的突出优点是快速、高效、灵活和易于操作。要点5dna含量的测定dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(见下图)。可以利用dna的这一特点进行dna含量的测定。具体步骤如下：（1）将样品进行50倍稀释：取2lpcr反应液，加入98l蒸馏水。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入步骤1中的dna稀释液100l至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）计算dna含量。公式：dna含量(g)=50（260nm的读数）稀释倍数。要点6实验注意事项（1）为避免外源dna等因素的污染，pcr实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及 蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸气灭菌。（2）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严