（植物学专业论文）沙角衣藻胞外多糖和磷酸酶的研究.pdf

沙角衣藻胞外多糖和磷酸酶的研究 植物学专业 研究生 刘英华指导教师 傅华龙教授 兰利琼副教授 本文以沙角衣藻为研究对象 主要考察了几种营养因子不同浓度对沙角衣 藻胞外多糖产量的影响 本研究结果表明沙角衣藻胞内和胞外多搪含量与培养 条件有关 但各种条件的影响结果不同 在本研究中 碳酸氢钠对沙角衣藻 生长情况影响不大 2 0 0 5 g l 浓度的碳酸氢钠的培养基中 沙角衣藻均可 生长 在l 5 g l 的碳酸氢钠浓度下 沙角衣藻生长最好 碳源碳酸氢钠对沙角 衣藻胞外和胞内的产量有较大影响 随着培养液中碳酸氢钠浓度的降低 胞内 多搪含量减少而胞外多糖含量增加 说明碳酸氢钠浓度的减低有利于多搪的分 泌 高浓度的硝酸钙促进沙角衣藻生长 随着硝酸钙浓度增加 沙角衣藻胞内 和胞外多搪产量变化不大 在磷不足的培养基中 即浓度为0 l g l 时 沙角衣 藻生长受到一定的抑制 但多糖大量分泌到胞外 在沙角衣藻生长的不同阶段 多搪产率也不同 在快速生长期 胞外多糖合成较快 但胞外多搪在快速生长 后期积累最快 整个多糖积累滞后于藻细胞生长 p h 值对沙角衣藻胞外多搪产 量的影响不大 在p h 值为1 0 时 胞外多搪产量达到最大值 分离纯化了胞外多糖并对其进行化学组成分析 沙角衣藻培养液经离心 浓缩 有机溶剂处理后得胞外多糖固体 经d e a e 一纤维素柱纯化得成分较纯胞 外多 糖 收集吸收峰中间的部分 水浴浓缩 透析 经s e p h a d e x g 2 0 0 分子筛 层析为单一对称峰 说明离子柱层析分离沙角衣藻胞外多糖可以得到较好效 果 离子层析得到的多搪液通过氯化钡一一明胶法测总硫酸根 硫酸一咔哇法 测己糖醛酸含量 可得沙角衣藻胞外多糖中己糖醛酸含量为1 2 5 硫酸根的 百分含量为2 0 8 e 沙角衣藻是一种上壤藻 通过分泌释放胞外多糖 丰富了土壤各种营养元 素 并粘结土壤颗粒 在土壤表层形成一定厚度的结皮 本文通过不同浓度胞 外多糖对土圾表层水分分布的研究 表明随着沙角衣藻的胞外多搪浓度的增 加 土壤持水量增加 水分挥发率减低 说明沙角衣藻胞外多糖可以提高土壤 的水分利用率 对于沙角衣藻转化利用难溶性磷矿石的研究中 我们进一步研究了在沙角 衣藻一水稻体系中 设计了三种培养基一 全磷培养基 只含磷矿石的培养基 不含任何磷源的培养基 考察了三种实验体系中 有效磷浓度和溶液中碱性磷 酸酶和酸性磷酸酶的活性变化 本实验室的前期研究表明 沙角衣藻和水稻组 成的体系中 沙角衣藻不但可有效的转化利用磷矿石为有效磷 还可以缓解同 一体系中水稻的缺磷状况 本实验的研究表明 随着培养基中有效磷浓度的减 低 沙角衣藻碱性磷酸酶活性增高 但酸性磷酸酶活性与培养基中有效磷浓度 的关系不清楚 关键词 沙角衣藻胞外多搪碱性磷酸酶 t h e r e s e a r c h o f t h e e x o p o l y s a c c h r i d e a n d t h e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y o f t h ec h l a mdm口刀as s a j a o l e w i n s p e c i a l i t y b o t a n y a u t h o r l i u y i n g h u a t u t o r p r o f f u h u a l o n g n 外部环境的影响因素主要为光 照强度及时间 p h 值 温度 a l 度 培养时间等 培养基成分的影响因素主要 是磷 钙 镁 钾等理化因子及不同的碳 氮营养源的影响 9 7 1 对这些外 部影响因素的研究 有助于为大规模培养提供理论依据 本章考察了几种对沙 角衣藻生长影响较大的营养盐浓度梯度对沙角衣藻细胞生长及胞外多糖的影 i句 1 材料方法 1 1材料 沙角衣藻c h l a m v d o m o n n s s a 刀a o l e w i n 本实验室长期培养 1 2培养基 专用培养基 n a h c o 0 5 g 1 n h s o 0 i g 1 k c 1 0 0 5 g 1 1 1 g s o 7 h 0 0 1 5 g l c a n 氏 4 h o 1 5 g l k h p o 0 5 g l f e c i 0 o l g l 接新鲜藻泥 室温通气培养 自然光照 实验采用对数生长后期培 养藻 培养周期约为2 4 天 实验所用药品均为国产分析纯或化学纯 1 3参数测定 1 3 1 藻细胞浓度的测定 分光光度法 7 5 1 g 型分光光度计 沙角衣藻在不同时间镜检计数并测其6 4 5 n m 处o d 值 吸光度与藻细胞浓度成 线性关系 见图1 以后的实验均通过测量藻液在6 4 5 n m 处的吸收值 o d 值 来表 示藻细胞浓度 图1 藻细胞浓度标准曲线 0 4 0 3 5 0 3 0 2 5 0 2 0 1 5 0 1 0 0 5 0 v 0 0 5 0 7 x 0 0 0 1 5 记 好 乙洲叔 知欲 2 4 6 藻细胞浓度 1 0 0 个 m l 1 3 2 多糖的提取 实验所用藻类均是取对数生长后期藻液 取5 0 0 m 1 左右藻液经离心收集藻 泥和上清液 藻泥在6 0 恒温干燥并恒重 研磨成粉 藻粉加乙醚研磨 热水 抽提 去蛋白 提取 胞内 多 搪川 离 心得到的 培养上 清液 在 8 的 恒温干 燥箱 中浓缩到l 0 0 m l 取出冷却后加等倍的无水乙醇 待产生沉淀后 离心收集沉 淀物 将沉淀溶解于蒸馏水中 并定容 得到胞外多糖粗提取液阶 侧 1 3 3 多糖含量的测定 利用改进的葱酮法 以葡萄搪为基准物做标准曲线 原理 掖类a r 硫w脱 水生成搪醛或其衍生物 可与蕙酮试剂缩合产生颜色物质 反应后溶液呈蓝绿 色 于6 2 0 n m处有最大光吸收 显色与糖含量呈线性关系杭 2 图2 蕙酮比色标准曲线 1 2 之 0 8 0 6 0 4 0 2 0 划安占0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 葡萄糖含量 其他营养盐浓度不变 1 4 2 c a n o 4 h 0 浓度的影响 c a n 0 z 4 h 0 浓度分别为0 5 1 5 3 0 4 5 g 1 其他营养盐浓度不变 1 4 3 k h p o 浓度的影响 k h p o 浓度分别为0 1 0 5 1 0 1 5 g 1 其他营养因子同标准培养基 1 4 4 p h 值的影响 培养基的p h 值分别为8 0 9 0 和1 0 0 共三组 每天以n a o h 或h c l 溶液调整 2 实验结果及讨论 2 1 沙角衣藻生长和胞外多 糖的 产量关系 表1胞外多糖产量与培养时间的关系 时间 天 271 21 72 22 73 2 胞外多搪 m g 1 5 11 5 52 4 66 2 78 6 21 2 6 51 4 7 6 衣藻干重 m g 1 8 0 31 8 2 02 9 5 35 5 2 66 8 5 37 3 2 87 5 6 4 图3胞外多搪产量 户们n钊门朴nu门000 八oj任门 n介0 匕d人 il 孟 卜 习 切吕 侧浅菇诚 2 7 1 2时 间k b a y 2 2 2 7 3 2 8 0 0 7 0 0 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 图4衣藻生长曲线 切三 侧十缀伴 32一 27一 2 9 2 71 2时ia na y 间隔时间取样 测定沙角衣藻生长量及胞外多糖含量 结果如图 生物量 的增长是典型的s 生长曲线 在1 2 2 7 天内快速生长 然后进入稳定期 整个 多糖的增长滞后于细胞数量的增加 胞外多搪含量与藻的生长期相关 对数生 长前期 胞外多糖含量低 在对数生长后期 胞外多糖大量产生 有报道认为 蓝藻和红藻从对数生长后期到静止期胞外多糖产率最高 本实验的结果和其基 本一致 说明胞外多搪是由成熟细胞大量合成并分泌到培养液的 在对数生长 后期 细胞分裂生长缓慢 基数大 是胞外多糖积累得高峰期 沙角衣藻多糖 含量较高 可以 为土壤微生物提供较多的营养源队 2 2几种主要营养盐浓度对沙角衣藻多糖含童的影响 2 2 1 n a h c o 浓度的影响 不同n a h c o 浓度下的沙角衣藻生长情况如图5 所示 培养后期胞外多搪产量对比如图6 所示 表2不同n a h c 0 3 浓度下沙角衣藻的生长情况 藻细胞浓度 1 0 第2 天第7 天第1 2 天 第1 7 天第2 2 天 第 2 7 天 n a h c o 浓度2 o g 10 5 3 4 6 51 5 0 21 8 4 6 2 0 2 12 0 4 7 n a h c o 浓度1 5 g 10 5 2 4 9 51 5 6 81 9 4 4 2 0 8 22 1 3 6 n a h c 0 浓度1 o g 10 5 4 4 0 61 4 7 61 7 5 2 1 8 6 41 9 7 5 n a h c o 浓度0 5 g 10 5 13 7 41 4 2 31 6 1 01 7 4 61 8 4 4 做图如下 图5不同n a h c o 浓度下沙角衣藻的生长曲线 4 2 岁1 门 1 5 g 1 a l g 1 q 5 岁 l 肠20151050 乞一开划说星界昌邢厌岌 7 1 2 1 7 培养时间 天 2 2 2 7 表3不同n a h c o 浓度下培养2 4 天沙角衣藻胞外多糖的产量 不同 n a h c 0 3 浓度 g 1 2 01 5 1 00 5 胞外多糖产量 m g 1 6 0 16 5 57 8 28 9 5 胞内多糖产量 占细胞干重 595 44 53 2 图fi不同n a h c o 浓度下沙角衣藻胞外多搪的产量的比较 一 一 1 2000806040200 之如巴 咽礼舞姚京留 1 50 5 n a h c 0 3 的浓度 g 1 图7 不同 n a h c o 浓度 f 的沙角衣藻胞内多糖产最 裂点勺 口dq工 走0 侧十 间气绍憾仁男 不同 n a h c o 浓度 在微藻培养的营养盐研究中 碳源碳酸氢钠作为一种重要的碳源 是研究 得比 较多的 营养盐之一 它对微藻的生长和生化组成有重要影响 3 1 41 s o 在本 研究中 n a h c o 对沙角衣藻生长情况影响不大 高浓度和低浓度的n a h c o 下沙 角衣藻均可生长 在实验所用的几个浓度中 1 5 g 1 的n a h c o 浓度是藻细胞生 长的最佳浓度 但是 碳源碳酸氢钠对沙角衣藻胞外和胞内的产量有较大影响 随着培养液中碳酸氢钠浓度的降低 胞内多糖含量减少而胞外多搪含量增加 说明碳酸氢钠浓度的减低有利于多 糖的分泌 2 2 2 c a n o 4 h 0 浓度的影响 不同钙离子浓度下的沙角衣藻生长见下图 培养后期胞外多搪产量如下图所示 表4 不同c a n 0 4 h 0 浓度下沙角衣藻的生长情况 藻细胞浓度 1 0 一一 第2 天第7 天第1 2 天 第1 7 天第2 2 天第2 7 天 c a n 0 4 h 0 4 5 g 1 0 4 84 9 5 1 6 1 41 9 2 6 2 1 4 52 1 7 4 c a n 0 4 h 0 3 0 g 10 4 64 5 21 5 2 6 1 7 4 2 1 9 8 22 0 0 3 c a n 0 4 h t0 1 5 g 八 0 4 2 3 9 41 3 6 61 6 2 5 1 8 2 31 8 1 7 c a n 0 4 h 0 0 5 g 10 4 1 3 6 71 2 1 2 1 3 0 11 5 4 01 5 2 4 图3不同c a n 0 3 2 4 h 2 0 浓度下沙角衣藻的生长曲线 1匕门 0心0山 4 5 g 1 3 g 1 l 5 g 八 0 g 乙 工 一 口门弓nu 1工 土 心01 喇粼澎停权负 7 1 2 1 7 培养时间 天 2 2 2 7 表5不同c a n 0 4 h 0 浓度下培养2 4 天沙角衣藻的多糖产量 不同c a n o 2 4h 0 浓度 g 1 4 53 0 1 50 5 胞外多搪产量 m g 1 7 0 26 6 5 7 7 26 0 8 胞内多糖产量 占细胞千重 1 71 8 1 32 3 图9 不同钙离子浓度下的沙角衣藻胞外多糖产量 1 0 0 8 0 t 6040200 一 切三 侧礼器镜众邀 4 5 3 不同钙离子 浓度 0 5 g 1 图1 0 不同c a n o s x 4 h 2 0 浓度下沙角衣藻胞内多搪产量 25 2 星界气 1 o 5 帜一 叫生转憾畏留 不同c a n 0 3 4 h 2 0 浓度 g l 实验结果表明 c a 是沙角衣藻生长所必需的 高浓度的钙离子促进了 沙 角衣藻的生长 但胞外多搪影响不大 而低浓度的钙离子的培养基中 沙角衣 藻生长比较缓慢 但胞内多糖有所增加 在实验所用的三个浓度中 4 5 g 1 是细胞生长的最适c a n o 4 h 0 浓度 在1 5 g 1 的c a n o 4 h o 的培养基中 胞外多糖产量最高 胞内多糖产量最低 2 2 3 k h p o 浓度的影响 不同k h p o 浓度下的沙角衣藻生长见下图 培养后 期胞外多糖产量对比如图1 2 所示 表6 不同k 2 h p o 浓度下沙角衣藻的生长情况 藻细胞浓度 1 0 一 第2 天第7 天第1 2 天第1 7 天第2 2 天第2 7 天 k h p 0 浓度1 5 g l 0 5 35 0 31 6 4 11 9 8 42 0 5 42 0 7 9 k h p o 浓度1 o g l 0 4 94 9 51 5 6 41 8 4 61 9 5 41 9 3 k h p o 浓度0 5 g l 0 5 64 8 71 4 6 71 7 5 41 9 2 31 9 5 3 k h p o 浓度0 l g l 0 4 22 6 41 0 5 81 4 4 11 5 0 71 4 2 4 图1 1不同 k 2 h p 0 a 浓度下沙角衣藻的生长曲 线 2 5 2 0 1 5 1 0 今一 1 门卜 1 去一 一片 5 9 八 o g l 5 g l 1 g 八 901 训彩端停暇岌 1 2 1 7 培养时间 天 表7 不同k h p o 浓度下培养2 4 天沙角衣藻的多糖产量 不同k z h p o 浓度 g 1 1 51 00 50 1 胞外多糖产量 mg 13 9 0 58 1 28 8 61 0 2 3 胞内多搪产量 占细胞干重 0 53 36 45 6 图1 2不同k 2 h p 0 4浓度下沙角衣藻胞外多搪产量 一 一 且 n甘00一u 日八目八u 心 nr 匕4勺乙 一 朗已 圳礼蒸挑索星 不同 k h p 0 4 浓度0 5cg 1 图1 3 不同 k h p 0 4 浓度下沙角衣藻胞内 多搪产量 一 一 胜 宁星异七 勺j门乙1 八曰户 属 啊代舞姚长型 1 5 不同 k l h p o 浓度 0 5 g l 实验结果表明 磷是沙角衣藻生长的限制因子 在满足沙角衣藻生长的磷 浓度 0 5 g 1 时 磷浓度的增加对沙角衣藻生长有促进作用 但胞外多 糖分 泌增加不多 而在缺磷的培养基中 0 l g ll 沙角衣藻生长比 较缓慢 但胞 外多糖分泌较多 磷酸氢二钾对沙角衣藻多糖产量影响较大 尤其是培养基中 磷不足时 即0 1 g 1 时 多糖大量合成并分泌到胞外 表8 不同p h 值培养2 4 天沙角衣藻多糖产量 一 1 3 一 不同p h 值 891 01 1 胞外多搪产量 m g 1 7 0 28 2 69 0 47 5 6 胞内多糖产量 占细胞 干重 5 30 81 23 4 图1 4 不同p h 值胞外多搪产量 8 n门 八曰门 口d几乃乙 1 留 洲忆称协 讯灵 不同p h 值 图1 5 不同 p h 值胞内多塘产夏 且 邀薪祀 即暇 9 几j勺山1工n 屠十 训礼称镜仁邀 不同p h 值 表1 4 所示 当p h 值为1 0 时 沙角衣藻多糖产量最高 随着p h 值的升高和降 低 胞外多糖产量下降 p h 值为9 和1 0 时 胞内多糖较少 在胞内多糖含量较 高的培养基中 胞外多搪含量比较少 而胞内多糖较少的培养基中 胞外多糖 较多 有不少研究者己意识到营养状态对藻类释放胞外聚合物的重要性 并展开 了实验 但是藻类释放胞外多搪有种属特异性 各种营养限制因子常常导致不 一 1 4 一 同的结果 h e l l e b u s t 在1 9 6 0 年研究了 2 2 种不同 种类的单细胞的海藻并注意到 一系列的种间特异性 不同种类的藻类释放胞外多搪的速率不同 这些差异在 自 然条件下当然也会很显著 培养时间对微藻胞外多搪含量影响也很大 大多 数的研究者发现在缓慢生长期和静止生长期比对数生长期有更多的胞外多糖 释 放 yj 第二章沙角衣藻胞外多糖的纯化及理化特性 由第一章我们知道沙角衣藻在其生长过程中产生大量的胞外多搪 随培养 基成分而变 一般从培养液中初次抽提到的多糖是多糖的混合物 进一步提纯 常按多糖的分子量 分子形状 化学组成等特点进行分级 常用的分级方法为 有机溶剂沉淀 离子交换 凝胶柱层析 亲和层析等 许多微藻的胞内 胞外 多糖中含有糖醛酸和硫酸根 以 聚阴离子形式存在 故我们选择了阴离子交换 树脂d e a e 一一纤维素柱作为胞外多糖的提纯方法 d e a e 一一 纤维素柱的分离原 理是按照胞外多糖中己 搪醛酸的梭基和硫酸基的取向 类型及数量差异 用不 同离子强度的n a c l 溶液洗脱而分离 多糖的纯度标准不能 用通常化合物的标准 来衡量 因为即使是多搪纯品其微观也是不均一的 它的纯度只代表相似链长 的平均分布 我们通常所说的多糖纯度其实是一定分子量范围的均一组份 多 搪的纯度鉴定常用的方法有超速离心法 聚丙烯酞胺凝胶电泳法 比旋光法 凝胶层析法等 一般要同时采用两种以上的方法才能确定 其中凝胶层析法是 按照多搪的分子大小不同进行分离 在洗脱过程中 大分子不能进入凝胶内部 而沿颗粒间的空隙最先流出柱外 小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结 构 流速缓慢 以致最后流出柱外 这样 不同分子大小的组份会在不同时间 被洗脱出来 表现为不同的洗脱峰 如果多搪纯度较高 只含一种组份且大小 均一 其上柱洗脱时只会有一对称清晰的洗脱峰 本章首先对该沙角衣藻胞外多搪进行分离 提纯 纯度鉴定 再对该胞外 多糖成分进行定量分析 1 材料与方法 1 1 供试材料 处于生长后期的沙角衣藻培养液 1 2 实验方法 1 2 1 胞外多糖粗品的提取 取5 0 0 m l 左右藻液经离心收集藻泥和上清液 离心得到的培养液 上清液 在8 0 的恒温干燥箱中浓缩到l 0 0 m l 取出冷却后加等倍的无水乙醇 待产生 沉淀后 离心收集沉淀物 将沉淀溶解于p h 值8 0 的磷酸缓冲液中 定容 得 胞外多搪粗提取液 1 2 2 多塘的分离纯化 2 6 2 0 c m 的d e a e 一一纤维素柱用p h 值8 0 的磷酸缓冲液平衡2 4 小时 取5 m l 多糖粗品溶液 浓度约为 2 m g m l 上柱 以 3 0 m l h 的流速0 1 0 4 m o l 1 的n a c 1 线性梯度洗脱 自 动部分收集器分管收集 5 m l 管 洗脱液透析去盐后用硫酸 一 葱酮法检测 以6 2 0 n m 光吸收值对洗脱管数作图 收集吸收峰中间部分 8 0 0c 水浴浓缩 蒸馏水透析浓缩 留 少量浓缩液作纯度鉴定 a l i j 1 2 3 多 糖的纯度鉴定一 葡聚糖凝胶层析 用s e p h a d e x g 2 0 0 凝 胶柱 1 3 5 6 c m 层析预留的多 糖浓缩液l m l 浓度约 为5 m g m l 缓冲液平衡2 4 小时 蒸馏水洗脱 洗脱速度为2 0 m l h 自 动部分 收集器4 m l 管分管收集 蕙酮法跟踪检测 作流出体积和搪浓度的关系曲线 如为单一对称峰 则表明 胞外多 搪成分单一151 训 1 3多糖结构分析 不少藻类胞外多搪都含有较高比例的搪醛酸和硫酸根 而且搪醛酸和硫酸 根的存在是许多酸性多搪具有特殊生理活性的重要原因之一 也是藻类完成许 多重要生命活动不可缺少的成分 本文用硫酸一咔哇法检测糖醛酸 明胶比浊 法 测 定 硫 酸 根 含 量 ar x 2 结果与讨论 2 1 胞外多糖的分离纯化 沙角衣藻培养液经离心 浓缩 透析 醇沉得浅灰色絮状物 溶于水 形 成透明粘稠液体 双缩脉试剂 f o l i n 一一酚试剂反应呈阴性 说明多搪链上 无蛋白组分 成分较单一 多搪粗品经d e a e 一一纤维素柱层析纯化 收集吸收 峰中间部分的洗脱液 透析后浓缩得多搪液 表9 胞外多搪经d e a e 一 纤维素柱所得o d 值 管数 o67891 01 11 21 31 4 0 0 4 9 0 n m0 0 6 0 0 90 1 60 1 50 1 20 0 90 0 60 0 70 0 90 0 8 管数 1 51 61 71 81 92 02 12 22 32 4 o d 4 9 0 n m0 1 0 0 1 30 1 60 1 50 1 70 2 20 2 5 0 2 80 3 10 3 3 管数 2 52 62 72 82 93 03 13 23 33 4 o d 4 9 0 n m 0 3 2 0 3 20 3 10 2 90 2 40 2 40 2 3 0 2 10 1 90 1 7 管数 3 53 63 73 83 94 04 14 24 34 4 o d 4 9 0 n m 0 1 40 1 20 1 5 0 1 60 1 30 1 70 1 40 1 2 0 0 90 1 3 图1 6 胞外多塘经d e a e 一 纤维素柱的峰图 0 2 0 1 5 0 1 0 0 5 0 曰uo6甲澎qo 2 03 0 管数 2 2 多 糖纯度的鉴定 表1 0 胞外多搪的s e p h a d e x g 一一2 0 0 柱层析 洗脱管数 34689 1 01 11 31 41 5 o d 6 2 5 n m0 0 6 0 0 80 1 0 1 50 3 10 50 30 1 6 0 1 1 0 0 8 图1 7胞外多搪在s e p h a d e x g 2 0 0 柱层析上的洗落 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 三蕊忍恻00 1 0 管数 将纯化的多糖精品液上1 3 5 6 c m s e p h a d e x g 一一2 0 0 柱层析 以 葱酮法跟 踪检测搪含量 结果如图1 7 所示 洗脱峰为单一对称峰 说明以d e a e 一一纤维 素柱分离胞外多搪可达到较好的分级效果 凝胶排阻层析又称分子筛层析 是 根据样品物质分子大小这一物理性质对物质进行分离分析的 既有很好的分离 效果 又不影响样品物质的生物学活性 因而在现代生物化学和分子生物学研 究领域中广泛用于蛋白 多搪 核酸 酶等生物分子的脱盐 纯化 分子量测 定 等 生 化 分 析 工 作 6i v ij 沙角衣藻培养液经离心 浓缩 有机溶剂处理后得胞外多糖固体 经 d e a e 一一 纤维素柱纯化得成分较纯胞外多搪 经s e p h a d e x g 2 0 0 分子筛层析得 到单一对称峰 说明离子柱层析可得较满意效果 2 3 多 糖结构分析 2 3 1硫酸 一咔哇法测己糖醛酸含量 一 1 8 原理 己 糖醛酸与浓硫酸作用形成生色原 后者定量地与咔哇显色 以 葡萄 糖醛酸作对照 标准曲线绘制 精确吸取0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 m l 浓度为 1 0 0 m g 八葡萄搪醛酸于带塞试管 加水至1 o m l 冰水浴加入6 o m l 浓硫酸 摇 匀后8 5 水浴2 0 分钟 冷后加入0 2 m l 咔哇液 室温保持2 小时 5 3 0 n m 测光吸 收 以搪醛酸浓度对光吸收值作标准曲线 样品测定 取1 o o m l 多搪液 浓度为5 2 m g l 同 标准曲 线制作之操作 比 色测定 根据标准曲线和样品浓度可得搪醛酸含量 表i l硫酸一一 咔哇法测己 糖醛酸含量标准曲 线 己糖醛酸浓度 m g 1 01 02 03 04 05 0 o d 值5 3 0 n m 00 0 4 1 0 1 20 1 7 0 2 5 0 3 图1 8 己糖醛酸标准曲线 0 4 已吕蕊华00 己糖醛酸含量 l m g l d 由葡萄糖醛酸的浓度和5 3 0 n m 处光吸收值可得它们的线性方程 y 二 0 0 0 6 2 x 一 0 0 0 9其中 y 5 3 0 n m 处光吸收值 x 葡萄糖醛酸浓度 m g 1 将y o 0 3 1 2 代入 可得x 6 4 8 m g l 由胞外多糖的浓度5 2 m g l 可得沙角衣藻胞外多糖中己糖醛酸含量为 6 4 8 5 2 0 2 4 8 7 5即1 2 5 2 3 2总硫酸根含童 原理 利用盐酸水解法 多搪中的硫酸基与无机钡离子反应井在含明胶的 溶液中保持悬浊状态 比浊测定表明此悬浊液的光吸收与硫酸基呈线性关系 标准曲线制备 硫酸钾在1 0 5 1 1 0 干燥恒重后 以l m o l 1 h c i 配成 0 6 m g m l 标准液 精确吸取0 0 2 m 1按0 0 4 m l 递升 于带塞试管中 各管以1 m o l l h c 1 补加至总体积0 2 m l 另加入3 8 m l 3 三氯乙酸和l m l 氯化钡一一明胶 试液 混合后在室温下静置1 5 2 0 分钟 测定3 6 0 n m 光吸收 以0 管作对照 得 a l 另以同样标准溶液系列 只是用明胶试液代替氯化钡一一明胶试液 以 0 管作对照 测定3 6 0 n m 光吸收 得a 2 以 a 1 a 2 对硫酸基浓度作标准曲线 样品测定 精确称量样品 以l m o l 1 h c i 作溶剂 配制1 5 m g m l 样品液 封 管1 0 0 加热2 3 小时 冷却后吸取0 2 m 1 进行分析 余操作同标准曲 线制作 表1 2 氯化钡一一明胶法测总硫酸根含量标准曲线 标准品硫酸钾浓度 m g m l 00 1 50 3 0 0 4 50 6 0 0 7 5 o d 值3 6 0 n m 00 0 7 6 0 1 60 2 60 3 7 0 4 9 0 6 图1 9硫酸根标准曲线 0 5 0 4 今j今 1八 八曰八 nu 曰成 胃划00 0 1 a0 2 0 4 硫酸跟含量 0 6 0 8 m g m l 由标准品k 2 s o 的数据可得硫酸根浓度和其3 6 0 n m 处o d 值的关系为 y二0 6 5 3 7 x一0 0 1 9 1 其中y 3 6 0 n m处o d 值x 硫酸根浓度 m g m l 将y 为0 0 9 8 代入 可得x 为0 2 0 8 即硫酸根浓度为 2 0 8 m g m l a 一 2 0 一 结合胞外多搪浓度1 o m g m l 可得沙角衣藻胞外多搪中硫酸根的百分含量为 2 0 8 许多微藻的胞内 外多搪中含有搪醛酸和硫酸根 如 s y n e c h o c y s t i s p c c 6 8 0 3 胞外多糖含搪醛酸 硫酸基分别为1 6 4 和1 0 p c c 6 7 1 4 胞外多糖分 别含搪醛酸 硫酸基1 6 7 1 2 6 j e a n m i c h e p a n o f f 1 9 8 8 h a l o p h i l i c c y a n o h a c t e r i u m l l n 1 1 胞外多 搪由 六种单 糖组成 蛋白 和硫酸基分别占多 糖总 重量的1 0 和1 2 h i r o a k i s u d o 1 9 9 5 s p i r u l i n a p l a t e n s i s 胞外多搪含 1 3 的硫酸根 t e a s e b e 1 9 8 7 n e l s o n 等1 9 3 1 报道从巨藻中得到的褐藻 多糖由几乎等量的岩藻糖和硫酸醋组成 丁新等1 9 9 6 报道杜氏盐藻千粉9 8 稀 碱抽提2 3 小时所得的盐藻多糖含5 3 的硫酸根和6 7 的搪醛酸 该多糖经 d e a e s e p h a d e x a 2 5 及s e p h a d e x g 2 5 分级 得四 种不同 级份的多 糖 除级份 1 外 其余三种级份都被不同程度地硫酸化 其中级份4 含有高达1 3 7 的搪醛 酸和2 7 6 的 硫酸根 s r s a 第三章沙角衣藻胞外多糖对土壤表层持水量和水分分布的 影响 沙角衣藻是一种广泛分布的土壤藻 在土壤藻的生态演替过程中 在初级 土壤基质上 土壤藻主要是通过水分截留促进硅酸a质等矿物的分化 光合作 用中产生的碳酸类物质进一步加速了这种矿化过程 而藻类分泌胞外多搪的过 程不仅能促进不溶性复合物释放营养的最重要的微生物过程 而且能影响土壤 的持水量 本实验室前期研究表明 该藻具有转化磷的能力口 本文通过研究其 对土壤持水量的影响和水分分布的作用 对研究和综合治理荒漠化有很大的意 义 1材料和方法 1 1材料同前 1 2方法 藻类培养基和多搪提取方法同前 1 3沙角衣藻胞外多糖汁土维持水量和水分分布的影响 1 3 1不同浓度胞外多 糖对水分 运动的影响知 洲 取不同浓度的胞外多搪 以2 m l 4 g 沙 以4 0 目筛子过筛 混合 装入i o m l 的注射器中 4 5 烘干 后在上面加一块滤纸 快速加入5 m l 水 记 录注射器从 加水至第一滴水滴出的时间为水分在沙中的运动时间 1 3 2 不同浓度胞外多 糖对水分 挥发速率的影响 取不同浓度的胞外多糖 以2 m 1 5 g 沙混合 装入直径2 5 c m 的小试剂瓶中 在4 5 烘干1 6 h 称水分含量变化 确定水分挥发速率 1 3 3 不同浓 度胞外多 糖对土攘持水量的影响 取不同浓度的胞外多搪 以滴定管在小试剂瓶上工 c m 处滴定 直到表面刚起 水为止 记录滴数为土壤持水量 2 结果与讨论 2 1 胞外多糖时水份在土壤中 运动的阻碍作用 如图2 0 所示 随着沙中胞外多糖浓度的增高 水分运动的速度减慢 透过 时间增大 水分透过时间增长 不利于水分的下渗 土壤藻在自 然界中形成粘结 在一起的稳定植物团块 即藻结皮 在土壤结皮中 结皮越厚 结皮的时间越长 雨水下渗所需时间增长 不利于雨水的下渗 但有利于表层土壤充分吸收水分 2 2 胞外多糖对土 壤持水量的 影响 随着胞外多搪浓度的增高 其最大持水量逐渐增高 图2 1 在1 8 m g m l 时 比对照增加3 6 4 0 在降水过程中 多糖含量越高 表层土壤保墒能力越强 因 此可充分利用降水进行生长 表1 3 不同浓度胞外多搪对土壤水分运动及含量的影响 胞外多搪浓度 m g m l 00 51 01 52 水滴经过时间 s 3 53 84 76 07 1 土壤含水量 滴 2 2 一1 2 4l 2 52 83 0 图2 0 不同浓度胞外多搪对水分运动的阻碍作用 门n uc钊八曰八曰门 八口nu 0乃7 u 0月任qd门乙1 念 亘盆 0 4 5 0 9 胞外多糖浓度 1 3 51 8 m g m l 图2 1 不同浓度胞外多糖对土壤持水量的影响 0 4 5 0 9 1 3 e 不同胞外多糖的浓度 m g m l 工o0laol冲八口1勺0 几j勺do q山 1 上 燕震 1 8 2 3 胞外多 糖对土壤水分英发速率的影响 由图2 2 可以看出 土壤最低含水量随浓度的增加而增加 1 8 m g m l 胞外多 搪的含水量是对照的1 4 倍 较大地提高了土壤的含水量 并且延缓了土壤水分 挥发的速率 有利于保墒和在雨季来临时充分利用水分进行生长 提高土壤生 物量 表1 4 不同浓度的胞外多搪对水分挥发速率的阻碍作用 干燥时间 h 2 46 81 0 1 21 41 61 8 2 o m g m l 1 2 6 52 8 3 4 5 i 6 0 0 7 1 28 0 2 8 6 89 0 89 6 0 1 5 m g m l 1 2 72 9 64 4 46 2 7 7 5 28 4 69 0 6 9 4 29 8 7 1 o m g m l 1 6 1 53 1 25 1 86 5 97 6 7 8 6 49 4 49 8 99 9 4 0 5 m g m l 1 7 7 53 3 25 3 1 7 0 1 8 3 79 2 89 9 6 0 m g m 1 1 8 6 53 5 7j 6 97 8 3 9 5 29 9 6 图2 2不同浓度胞外多糖对水分挥发速率的影响 n g q乙 日 11 1 806040 次并绷戮众关 挥发时间 小时 讨论 对藻结皮在土壤中的作用 有很多研究工作者曾做过研究 藻结皮 粘结土壤表面的颗粒 可以 减少土壤流失 并可有效防止降水的冲刷 藻类结 皮中的多糖可以提高土壤团聚体的含量 因此有利于提高土壤含水量 而从本 一 2 4 一 文的研究结构来看 土壤最大持水量在胞外多糖浓度为0 9 m g m l 时增加到将 近1 4 o 另外 它还影响土壤水分挥发速率 有利于充分利用水分 此外 荒 漠藻为沙漠提供了各种营养 为其他异养微生物的生长提供了可能 在我国曾 进行过固氮蓝藻对稻田肥力影响的大量研究 藻类能够为土壤提供碳源和氮源 是一种潜在的生物肥料 为荒漠化的综合治理提供一种新的理论上的途径 第四章沙角衣藻一杂交水稻实验体系中有效磷与磷酸酶变 化关系的研究 1 实验及方法 1 1实 验材料 1 1 1 沙角衣藻 c h l a m v d o m o n a s s a j a o l e w i n 及培养基配方 同前 1 1 2 杂交 水稻 0 s a t i v a l 本研究采用釉性杂交水稻d 优4 9 四川省 广汉市种子公司出品 1 1 3 培养基 h o a g l a n d 改良 培养基 同前 标准 1 1 4 磷矿石粉 过8 0 目筛 四川省什邝市磷肥厂提供 1 2 方法 工 2 1 沙角衣藻的无磷培养 分别配制全磷沙角衣藻培养基和无磷沙角衣藻培养基 滤除沉淀后取滤液 备用 培养藻种经全磷培养基培养一段时间后 3 0 0 0 r m i n 离心分离 再经无 磷培养基多次洗涤 接种至无磷培养基中继续培养一周 以消耗沙角衣藻体内 的有效磷 1 2 2 磷矿石粉的处理 用重蒸水浸泡磷矿石粉2 4 小时后再用重蒸水反复冲洗 直至其所含的可溶 胜有效磷经检测为零 烘干后置于干燥器中待用 1 2 3 杂交水稻的处理 水稻种子用重蒸水反复冲洗 浸泡水稻种子然后置于温室 2 5 0c 中培 养育苗 每天补充无磷h o a g l a n d 改良 培养基以保证水稻苗正常发育 1 2 4实验设计 实验所用培养器具为广日 透明塑料瓶 实验温度为2 5 0c 实验光照条件 为1 0 0 0 1 u x 光暗比为1 2 h 1 2 h 每个实验组各有三组平行实验 表1 5实验设计 编号培养基 m l 磷矿石粉 m g 藻种 个 m l 1 全磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 0 2 3 4 x1 0 2 全磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 0 0 3 无磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 3 0 2 5 3 x1 0 4 无磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 3 00 5 无磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 02 3 4 x 1 0 6 无磷h o a g l a n d 培养基1 0 0 0 0 1 2 5 实验体系的构建 将经过一周无磷处理的沙角衣藻和苗高约5 c m 的杂交水稻同时转入实验设 计的培养基中 形成一个实验体系 1 2 6参数测定 实验体系构建后利用使用血球计数板测定培养基中沙角衣藻的生物量 每 6 天用磷铝蓝比 色法 1 1 x 1 测定培养基中的有效磷浓度 测定胞外磷酸酶活性 其 测定方法如下 反应底物是p h 1 0 2 5 0 l m o l 1 k c i h m n a o h 柠檬酸钠一柠 檬酸缓冲溶液配制的2 m m o l l 的对硝基苯酚酸钠 待测液为由培养基离心除去 藻体后得到的上清夜 底物 1 m 1 和待测液 1 m l 在3 7 水浴3 0 m i n 终止 反应和显色剂均为o l m o l l n a o h 5 m l 然后在4 0 5 n m 处读o d 值 活力单位是 以每m l 总反应液中每小时释放l u g 的对硝基苯酚为一个活力单位 2 1 结果与讨论 培养基中的有效磷浓度变化 测定结果见表1 6 表1 6 不同实验时期各实验体系中有效磷浓度变化 编号 有效磷浓度 m g l 第2 天第8 天第1 4 天第2 0 天第2 6 天 12 9 61 29 37 66 5 22 7 11 3 89 987 3 30 0 50 60 9 11 7 1 8 40 0 40 0 3 61 3 81 5 41 4 3 50 0 20 0 1 90 0 3 2 0 0 4 40 0 4 9 60 0 3 80 0 4 60 0 2 50 0 5 20 0 3 7 由表1 6 可以得出以下三个折线图 血 一无藻的体系 一 加藻的体系 图2 3 全磷培养基中的有效磷 4 0 n n 八u q口0乙1 之切已 侧浅涟授仲 0 1 42 02 6 时间 d 图2 4 加磷矿石培养基中的有效磷 1 5 1 0 5 一 切曰 赵浅攀姨榕 时间 d 图2 5 无磷源的培养基中的有效磷 0 0 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 一 因日 侧送毯拼乍 1 4 时间 天 2 1 1全磷培养基中有藻与无藻两个体系中有效磷浓度的变化情况 由图可知 在全磷培养基的体系中 磷的浓度是有限的 由于水稻和藻类 的生长需要消耗有效磷 因此随着时间的增长 培养液中的有效磷含量逐渐减 少 且降低最快的时间是第2 至8 天 这与藻类和水稻的快速生长状况相对应 在 表2 和图1 中还可以看出 在有藻和水稻的共同体系中 有效磷的消耗比不含藻 类的体系稍快 2 1 2加矿石磷的无磷培养 基中 有藻与无藻两个体系中 有效磷浓度的变 化情 况 有藻的体系中溶液的有效磷浓度从一开始便迅速上升 说明处于磷饥饿状 态的沙角衣藻对磷矿石粉的转化 释放以及利用速度是很快的 这与杨逸萍等 对可利用颗粒磷的研究结果相似 但是 从表1 6 的数据和图2 4 可以看出 当实 验进行到1 4 天时 加藻的实验体系中 实验3 有效磷浓度还低于不加藻的体 系 实验4 这可能在实验前期 由于藻类的快速增殖 大量消耗体系中的 有效磷之故 同时也表明水稻也有一定的转化磷矿石的能力 从表3 的数据显 示 在水稻碱性磷酸酶的作用下 溶液中的有效磷含量梢有增加 而在后期有 藻的体系中转化磷矿石的能力强于水稻单独的转化能力 而且在这个时期 有 藻的体系中水稻生活力旺盛 而无藻的体系中 水稻生长状况次之 说明藻类转 化的有效磷也可供水稻利用 并促进水稻生长 2 1 3 无磷源的培养 基中 有藻与无藻两个体系中有效磷浓度的变化情况 由图2 5 可以看出 在没有磷矿石的体系中 有效磷含量变化很小 在后期浓 度稍有回升 但增加值最大不超过0 0 6 m g 1 这可能是由于后期藻体死亡和水 稻部分器官 分解引起的磷释放所致 2 2 碱性磷酸酶活性的变化 表1 7 各体系中碱性磷酸酶活性变化 编号 碱性磷酸酶活性变化 活力单位u 第2 天第8 天第1 4 天第2 0 天 第2 6 天 100 1 8 70 1 8 7 0 50 5 2 20 0 9 70 0 3 2 50 30 3 3 30 6 5 0 7 40 7 7 0 7 20 7 8 4 0 50 6 60 3 70 3 9 0 4 o0 2 20 4 40 4 4 0 6 50 5 6 60 2 20 1 8 0 1 40 0 90 0 3 根据表1 7 作图如下 一 无藻的体系 一 加藻的体系 图2 6全磷培养基中醉活力变化 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 朽 感 鹅省 第2 天第8 天第1 4 天 培养时间 第2 0 天第2 6 天 图2 了 加磷矿石培养基中酶活力的变化 i o s 0 6 0 4 0 2 0 翻哥只华盈 第2 天 图2 8 第8 天第1 4 天 培养时间 第2 0 天第2 6 天 没有磷源培养基中酶活力的变化 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 拿斗只印一遨 第2 天第8 天 第1 4 天 培养时间 第2 0 天第2 6 天 2 2 1 全磷培养基中碱性磷酸酶活力的变化 图2 6 所示在整个培养过程 碱性磷酸酶的活性变化明显 在实验开始阶段 有效磷充足 体系中碱性磷酸酶活性不高 实验后期 随着藻类和水稻的生长 体系中有效磷浓度的减少 碱性磷酸酶活性也随之升高 而加了藻的体系中 酶 活性变化比无藻体系中的酶活性变化更大 特别是在后期 这也反应了该体系 中的缺磷状况 2 2 2 加磷矿石的培养基中 碱性磷酸酶活力的变化 图2 7 表示由于实验的前期处理 沙角衣藻的磷酸酶活性己被激活 当把处 于磷饥饿下的沙角衣藻放入含有矿石磷的无磷培养基时 表现出表现较高的碱 哇磷酸酶活性 且随着时间的延长 活性加大 使得酶活力一直维持在一个较高 的水平 从表1 7 的数据表明 这样体系中的有效磷含量持续增加 而没有加藻 类的体系中 水稻的碱性磷酸酶活性变化与图2 中有效磷的变化是相对应的 在 前8 天 当体系中的有效磷极少时 体系中的碱性磷酸酶活力呈上升趋势 而 在第8 天后 当体系中的有效磷浓度有所上升以后 体系中的酶活力就呈下降 趋势 然而 水稻转化的有效磷量低于有藻的体系 详见表1 7 根据实验观察 水稻碱性磷酸酶活性的降低也可能是由于水稻长期缺磷 导致生活力下降 所 以分泌胞外磷酸酶的能力降低所致 2 2 3 没有加任何磷源的培养基中 碱性磷酸酶活力的变 化 培养基中剩余的磷源只能维持有限的生物量 在实验进行中 藻体渐渐死 亡 水稻发育迟缓 有的叶片出现枯萎 在不含藻的培养基中 随着水稻的生活 力渐渐下降 碱性磷酸酶活性也随之降低 而在加了藻的体系中 培养基中的 碱性磷酸酶随着藻类的死亡逐渐升高 这说明在缺磷胁迫下 藻诱导出较多的 碱性磷酸酶或磷酸酶的活性大大提高 所以随着藻类的解体 溶液中的磷酸酶 活力依然是处于升高的状态 2 3酸性磷酸醉的活性变化 表1 8酸性磷酸酶的活性变化 编号酸性磷酸梅活性变化 活力单位u 第2 天第8 天第1 4 天第2 0 天第2 6 天 10 3 5 20 4 7 2 0 3 1 70 4 2 10 3 5 2 20 3 4 30 4 3 8 0 3 5 20 1 5 20 3 3 4 30 4 8 20 4 6 40 6 6 40 1 7 90 1 7 9 40 5 3 40 4 3 80 30 2 3 9 0 3 6 5 50 4 30 4 2 10 3 5 2 0 2 4 80 3 60 30