微生物检验病原性放线菌及检验.doc

第三十章病原性放线菌及检验本章考点：1.放线菌属（1）生物学特性（2）致病性（3）微生物学检查2.诺卡菌属（1）生物学特性（2）致病性（3）微生物学检查一、放线菌属放线菌属的细菌是革兰阳性无芽孢厌氧杆菌，多为动物体表面，特别是口腔正常菌群的成员，少数可引起内源性感染。其中，衣氏放线菌是人类放线菌病最常见的菌种，牛放线菌主要引起牛放线菌病。（一）生物学特性1.形态与染色：革兰阳性，无芽孢、荚膜和鞭毛，无抗酸性。菌体常形成分枝状无隔菌丝，但不形成空中菌丝。有时断裂成短杆状或球状。在患者病灶和脓汁中可找到肉眼可见的黄色小颗粒，称为“硫磺颗粒”，是放线菌在病灶组织中形成的菌落。将其压制成片，镜检可见颗粒呈菊花状，中央为革兰阳性的丝状体，周围为粗大的革兰阴性棒状体，呈放射状排列。2.培养特性：本菌培养比较困难，厌氧或微需氧。在有氧环境中一般不生长，初次分离加5%CO2可促进生长。生长缓慢，在培养基上需34天才能形成肉眼可见的较致密菌落，灰白色或瓷白色、表面粗糙而不规则的菌落。经人工多次移种后，可形成光滑型，白色、柔软、易于钩取的菌落。在葡萄糖肉汤中3736天后，在培养基底部形成灰白色球形小颗粒沉淀。在硫乙醇酸钠肉汤中3736天后，在培养基下层白色或灰白色雪花样生长，管底生长不多，肉汤清晰。衣氏放线菌在牛心脑浸液琼脂上，371824小时形成蛛网状菌落。继续培养714天，形成臼齿形或面包屑样菌落，白色或灰白色，不溶血，无气中菌丝。菌落常粘连于琼脂上，不易挑起和乳化。3.生化反应：能分解多种糖类产酸，除粘性放线菌外触酶试验均为阴性，不产生吲哚，不分解尿素。（二）致病性放线菌大多存在于正常人口腔、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道，属于正常菌群。只在机体抵抗力减弱或受伤时引起的内源性感染，导致软组织的化脓性炎症。若无继发感染则大多呈慢性无痛性过程，常出现多发瘘管，排出的脓性物质中含有硫磺颗粒，此即为放线菌病。放线菌可引起面颈部、胸部、腹部和中枢神经系统等感染。最常见为面颈部感染。本菌可从呼吸道进入肺，开始在肺部形成病灶，症状和体征似肺结核。损害大多广泛连续蔓延，并能穿破胸膜和胸壁，在体表形成多个瘘管，排出脓液。原发性皮肤放线菌病常由外伤或昆虫叮咬引起。放线菌还与龋齿和牙周炎有关。（三）微生物学检验1.标本采集：主要采集脓液和痰液或活检组织。首先检查标本中有无“硫磺颗粒”，可用灭菌注射器抽取未破脓肿的脓汁作检查。2.直接镜检：将“硫磺颗粒”置玻片上，以盖玻片轻压后镜检。在低倍镜下如见有典型的放射状排列的棒状或长丝状菌体，边缘有透明发亮的棒状菌鞘，即可确定诊断。也可用革兰染色、镜检，颗粒的中心部菌丝体染色为阳性，分枝状菌丝排列不规则，四周放射状的肥大菌鞘可呈阴性。抗酸染色阴性。3.分离培养：将标本接种在液体培养基中在5%C02的厌氧环境中3736天，观察生长特点。接种牛心脑浸液琼脂上，观察菌落特征。4.生化反应：触酶试验，明胶液化，硝酸盐还原，多种糖类分解试验，厌氧环境3737天观察结果。二、诺卡菌属诺卡菌是广泛分布于土壤中的一群需氧性放线菌，多数为腐物寄生性的非病原菌。其中有56种诺卡菌可引起人或动物的急性或慢性诺卡菌病。主要为星形诺卡菌和巴西诺卡菌。（一）生物学特性1.形态与染色：本菌形态基本与放线菌相似，但菌丝末端不膨大。革兰染色阳性，抗酸染色呈弱抗酸性。在培养早期菌裂解为较多的球状或杆状，分枝状菌丝较少。在病人脓、痰、脑脊液中本菌为纤细的分支状菌丝。2.培养特性：为专性需氧菌，营养要求不高，在普通培养基或沙氏培养基上室温或37培养均可生长，但繁殖速度慢，一般需57天可见到菌落。菌落表面干燥、有皱褶或呈颗粒状，不同种类可产生不同色素。星形诺卡菌可形成黄色或深橙色菌落，表面无白色菌丝。巴西诺卡菌的菌落，表面有白色菌丝。在液体培养基中由于需氧可在表面长成菌膜，下部培养基澄清。（二）致病性主要为外源性感染。星形诺卡菌主要通过呼吸道引起人的原发性、化脓性肺部感染，产生类似肺结核的症状。也可经肺部病灶转移到皮下组织，产生脓肿及多发性瘘管，或扩散到其他脏器，如引起脑脓肿、腹膜炎等。在病变组织或脓汁可见黄、红、黑等色素颗粒。而巴西诺卡菌可因外伤侵入皮下组织，引起慢性化脓性肉芽肿组织，表现为脓肿及多发性瘘管，好发于足、腿部，故又称为足分枝菌病。此病也可能由星形诺卡菌、马杜拉放线菌及某些真菌引起。诺卡菌感染常可发生在一些其他进行性疾病或免疫障碍性疾病的晚期，尤其是库欣综合征、糖尿病或长期应用皮质类激素、免疫抑制剂和广谱抗生素的患者。 （三）微生物学检验1.标本采集：可采集痰液、支气管冲洗液、组织渗出液、脓液和脑脊液标本。标本采集后，应仔细查找有无黄、红或黑色颗粒，其直径一般小于1mm。本菌在脑脊液、胸腔穿刺液及痰中多不形成颗粒。2.直接镜检：如标本中有色素颗粒，取其用玻片压碎涂片，用革兰染色和抗酸染色检查。镜检有革兰阳性（有时染色性不定）纤细的菌丝体和长杆菌。抗酸染色具弱抗酸性，在盐酸酒精中较长时间可完全脱色。可初步确定为诺卡菌。3.分离培养：将标本接种于沙保弱琼脂、脑心浸液琼脂等培养基，置2537需氧环境，培养24天后观察菌落特征。如有黄、橙或红色等色素的湿润菌落，挑取菌落按上述生化鉴别特征进行鉴别。第三十一章螺旋体及检验本章考点：1.概述（1）形态结构（2）分类与命名2.疏螺旋体属（伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体、奋森螺旋体）（1）生物学特性（2）致病性（3）微生物学检验3.钩端螺旋体（1）生物学特性（2）致病性（3）微生物学检验4.密螺旋体属分类5.梅毒螺旋体（1）生物学特性（2）致病性（3）微生物学检验6.其他密螺旋体简介螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状，运动活泼的原核细胞型微生物。其基本结构与细菌相似，有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感。螺旋体所致疾病主要有性传播疾病和自然疫源性疾病。概述（一）形态与结构螺旋体革兰染色阴性，但着色较困难。（二）分类与命名螺旋体目，螺旋体科有8个属，其中致病性螺旋体主要有3个属。见表5-31-1表5-31-1致病性螺旋体分类与命名属种疾病传播方式或媒介疏螺旋体属（包柔螺旋体属）伯氏疏螺旋体回归热疏螺旋体赫姆疏螺旋体奋森疏螺旋体莱姆病流行性回归热地方性回归热多种口腔感染硬蜱体虱软蜱条件致病钩端螺旋体属问号钩端螺旋体双曲钩端螺旋体钩端螺旋体病接触疫水密螺旋体属梅毒螺旋体雅司螺旋体地方性螺旋体品他螺旋体梅毒雅司病地方性梅毒品他病性传播皮肤损伤黏膜损伤皮肤损伤一、疏螺旋体属又称包柔螺旋体属。螺旋稀疏，有310个螺旋，不规则呈波纹状，运动活泼。对人致病的主要有伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体和奋森螺旋体。（一）伯氏疏螺旋体1.生物学特性：螺旋稀疏，运动活泼。革兰染色阴性，但着色较困难。Giemsa染色呈紫红色，Wright染色呈棕红色。营养要求高，培养基需含有长链饱和与不饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和牛血清蛋白等。微需氧，5%10%C02促进生长。适宜温度35，生长慢，在液体培养基中一般需培养23周可观察到生长情况。主要抗原包括鞭毛蛋白、外膜蛋白等。2.致病性：伯氏疏螺旋体是引起莱姆病的病原体。莱姆病是一种自然疫源性传染病。储存宿主主要是野生或驯养的哺乳动物。主要传播媒介是硬蜱，叮咬部位出现移形性红斑。未经治疗者发展至晚期主要表现为慢性关节炎、慢性神经系统或皮肤异常。3.微生物学检验：早期取皮损组织、淋巴结抽出液、血液、关节滑膜液、脑脊液和尿液等。主要依靠血清学和分子生物学试验来诊断莱姆病。（1）直接镜检：暗视野显微镜观察标本中螺旋体的形态和运动。还可进行Giemsa染色、Wright染色。（2）分离培养：标本接种改良的Kelly（BSK）培养基，3335孵育。（3）抗体检测：检测病人血清中的IgM和IgG抗体及其动态变化，可采用间接免疫荧光法、ELISA、免疫印迹技术。（4）直接检测标本中的核酸：PCR技术。（5）动物实验。（二）回归热螺旋体回归热是一种由节肢动物传播的、有周期性反复发作的急性传染病。引起该病的疏螺旋体有两种：回归热螺旋体，以虱为传播媒介，引起流行性回归热；赫姆疏螺旋体，以蜱为传播媒介，引起地方性回归热。该病目前在我国已较少见。回归热螺旋体最大的特点是极易发生抗原变异，所以临床上可见反复发热和菌血症，反复发作和缓解可达3-10次之多，故名回归热。微生物学检查可在发热时取一滴外周血制成厚血片，用暗视野显微镜或Giemsa染色后镜检，可见形似卷曲毛发的螺旋体。（三）奋森螺旋体革兰染色阴性，专性厌氧，常与梭杆菌寄生于人类口腔牙龈部。一般不致病，只有当人体抵抗力显著降低时，这两种菌大量繁殖，协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、溃疡性口腔炎等。微生物检查可用棉拭子从病灶取材，涂片革兰染色，可见革兰阴性螺旋体与革兰阴性梭状杆菌共存。还可用暗视野显微镜观察形态和运动。二、钩端螺旋体属（一）生物学特性1.形态与染色：钩体呈细长丝状圆柱形，螺旋盘绕细密而规则，数目较多，在暗视野显微镜下，似细小珍珠排列成的细链，一端或两端弯曲成钩状。菌体长短不等，长约620m，直径为0.10.2m。运动活泼，沿长轴作旋转、扭转及菌体伸缩匍匐状运动，因而常使菌体呈C、S、8等字形。钩体为革兰阴性，但一般染色法不易着色，常用镀银染色法及荧光抗体染色法。Fontana镀银染色法染成深褐色，背景为淡棕色。2.培养特性：营养要求较高，在含有兔血清（如柯氏培养基）和含白蛋白、脂肪酸的培养基中生长良好。最适温度2830，最适pH为7.27.4，低于6.5、高于8.4生长不良。需氧，通常在液体培养基表面1cm内的部位生长最佳。钩体在人工培养基中生长缓慢，28培养2周后形成透明、不规则，直径约2mm的扁平菌落。在液体培养基中28培养1周左右，呈半透明云雾状混浊。3.抵抗力：钩体对理化因素的抵抗力弱于细菌，但较其他致病性螺旋体强。钩体耐冷不耐热和干燥，加温5610分钟或601分钟即死亡。对化学消毒剂极敏感，75%乙醇、0.1%盐酸、硫酸1015分钟内、0.5%来苏儿、1%石炭酸、1：2000升汞1030分钟内，其迅速死亡。对青霉素、金霉素及庆大霉素极敏感，但对磺胺类药物耐药。（二）致病性钩体病是一种典型的人畜共患性疾病及自然疫源性疾病。鼠类和猪是最常见的储存宿主。钩体在感染动物的肾中长期存在，持续随尿排出，污染水源和土壤。人类主要感染途径是接触了疫水。病原体进入人体，在局部迅速繁殖，经淋巴系统或直接进入血循环引起菌血症。对人致病的有多种型别，临床常见的有黄疸出血型、流感伤寒型、肺出血型、脑膜脑炎型、肾功能衰竭型、胃肠炎型等。（三）微生物学检查钩体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。发病1周内血液的阳性率高，1周后尿和脑脊液等的阳性率高。1.直接镜检：暗视野显微镜观察标本中螺旋体的形态和运动。也可用Fontana镀银染色法及荧光抗体染色法。2.分离培养：标本接种Korthof培养基，28孵育。3.抗体检测：可采用间接免疫荧光法、ELISA等技术。一般在病初和发病的34周采取双份血清，监测抗体滴度的动态变化。有脑膜刺激症的可抽取脑脊液检测抗体。4.直接检测标本中的核酸：PCR技术。5.动物实验。三、密螺旋体属螺旋细密，有814个规则的螺旋，两端尖。分致病性和非致病性两大类。对人致病的密螺旋体有苍白密螺旋体和品他螺旋体两个种。苍白螺旋体又分为3个亚种：苍白亚种、地方亚种和极细亚种，它们分别引起人类梅毒、地方性梅毒和雅司病等。（一）梅毒螺旋体1.生物学特性（1）形态染色：梅毒螺旋体为密螺旋体，菌体纤细，大小为（615）m（0.10.2）m。两端尖直，有815个呈锐角弯曲而规则的螺旋，在暗视野显微镜下观察，运动活泼，方式有蜿蜒前进，沿纵轴旋转或前后移行。一般不易着色，常用Fontana镀银染色法，染成棕褐色，菌体变粗易于查见。病变标本直接检查时，可用新鲜标本不染色在暗视野显微镜下观察其形态和运动方式。（2）培养特性：梅毒螺旋体不能在人工培养基上生长繁殖。（3）抗原成分1）特异性抗原：梅毒螺旋体的表面特异性抗原具属特异性，无种特异性。2）类属抗原：可刺激机体产生沉淀素抗体或补体结合抗体。人体组织中的磷脂粘附于螺旋体表面，形成复合物；也可能是螺旋体磷脂半抗原与宿主蛋白结合，刺激机体产生抗磷脂的自身抗体，即反应素。（4）抵抗力：梅毒螺旋体抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感。离体在外环境中12小时即死亡。对常用化学消毒剂亦敏感。1%2%石炭酸数分钟就死亡。对青霉素、四环素、红霉素、庆大霉素均敏感。2.致病性梅毒是由梅毒螺旋体（苍白螺旋体苍白亚种）引起的慢性传染病，梅毒是性传播疾病中危害最严重的一种，人是其唯一宿主。梅毒可分为后天性梅毒和先天性梅毒两种，前者主要通过性接触感染，后者从母体通过胎盘传给胎儿。偶然可经输血感染。梅毒的临床病程分三期，第一期为硬性下疳，极易传播感染，也适于涂片镜检。第二期即梅毒疹期，全身皮肤黏膜出现皮疹，伴有淋巴结肿大，可累及骨、关节、眼及中枢神经系统。第一、二期称早期梅毒，传染性强，破坏性较小。部分早期梅毒可进一步发展到第三期梅毒，即晚期梅毒。病损部位螺旋体少但破坏性大。严重者可出现心血管和中枢神经系统受损，可危及生命。后天性梅毒表现为反复隐伏发病和再发的特点。先天性梅毒可引起胎儿的全身性感染，导致流产和死胎。若能出生，也会出现锯齿形牙、鞍鼻和神经性耳聋等。3.微生物学检验（1）直接镜检：一期梅毒取硬下疳渗出液，二期梅毒取梅毒疹渗出液，制成涂片用暗视野显微镜直接镜检，如见有运动活泼的密螺旋体有助于诊断。也可经镀银染色、Giemsa染色后光学显微镜检查。也可用直接荧光染色检查标本中的螺旋体。（2）血清学试验：包括非螺旋体抗原试验和螺旋体抗原试验。1）非密螺旋体抗原试验：多用牛心类脂质作为抗原，测定患者血清中的反应素（抗脂质抗体）。为非特异性试验，能与雅司病、回归热、鼠咬热、疟疾和麻风等病人的血清发生交叉反应。性病研究实验室试验（VDRL）快速血浆反应素试验（RPR）：本试验半定量对评价疗效和判断是否有再感染等是有价值的。不加热血清反应素试验（USR）2）密螺旋体抗原试验：用密螺旋体抗原，检测患者血中的特异性抗体，但不能区分密螺旋体属内的各种。荧光密螺旋体抗体吸附试验（FTA-ABS）抗梅毒螺旋体抗体的微量血凝试验（MHA-TP）ELISA免疫印迹试验WH0推荐用VDRL、RPR法进行过筛试验，出现阳性者用FTA-ABS、MHA-TP、ELISA和免疫印迹试验等作确认试验。（3）核酸检测：PCR技术。（4）分离培养：梅毒螺旋体不能在人工培养基上生长繁殖。常规诊断一般不做动物试验，必要时可做兔睾丸内接种。（二）其他密螺旋体对人致病的密螺旋体还有苍白密螺旋体地方亚种和极细亚种，以及品他螺旋体。它们分别引起地方性梅毒和雅司病和品他病。微生