流式细胞分析技术在淋巴瘤诊断中的应用.pdf

专家论坛 作者单位 Department of Pathology I mmunology and Laboratory Medicine University of Florida College ofMedicine 4800 S W 35th Drive Gainesville Florida 32608 U S A 杨凡 Email yfrank hotmail com 首 都医科大学附属北京友谊医院病理科 周小鸽 流式细胞分析技术在淋巴瘤诊断中的应用 杨凡 周小鸽 流式细胞分析技术 flow cytometry FCM 是淋巴瘤诊断 的一个重要工具 现代医学的迅猛发展使诊断学在整个临 床医学中所占的比重逐渐增大 用于诊断的新学科 新技术 也日益增多 如何将各种彼此独立的诊断资料加以综合分析 从中得到对于临床治疗有用的信息是对现代医学的重大挑 战 在淋巴及造血系统疾病的诊治中 常规血液学 包括涂 片 病理学 包括淋巴组织和骨髓的穿刺 活检 免疫分型 包括FCM和免疫组织化学 I HC 细胞遗传学和分子生 物学等等构成诊断的基础 如能将其中的各部分有效的加 以整合便可以最大限度地互补 最大限度地避免不必要的重 叠 将正确的诊断信息及时提供给临床 病理医生处于整 个诊断网络的中心 对于这一领域诊断信息的整合有着义不 容辞的责任 笔者根据自己的工作经验 就FCM在淋巴瘤 诊断中的应用作如下介绍 一 使用FCM的临床指征 FCM可以发挥最大优势的领域是细针穿刺 FNA 以及 各种体液 血液和骨髓的检查 FNA加FCM对于淋巴瘤的 诊断有效率可达75 90 1 就是说绝大多数患者经过 FNA检查后可以不必活检 要注意的是FNA FCM阴性并 不等于良性 根据具体情况进一步活检仍然有必要 对于 已经决定做活检的患者 FCM可以辅助淋巴瘤 白血病的诊 断 分类以及微量病变的检测 226 一个全面的诊断除了结 合病理组织学分析外还要结合病史 分析实验室报告和根据 具体情况选择作基因和分子生物学检查 FCM与常规病理 检查 I HC 聚合酶链反应 PCR 等相比有三个比较突出的 优点 1 快 几小时内可以出报告 其他方法通常需要一 到数天 2 高通量 一次可以检查上万个细胞 PCR的测 量是以整个样品为单位 FCM的测量是以样品中的每一个 细胞为单位 3 多参数分析 I HC一般只能做一个染色 在 技术上双重或多重染色有很多困难 FCM普遍可以做三重 到四重染色加上两个光学指标一般可以做5 6个参数的分 析 上世纪70年代后期FCM刚开始用于淋巴瘤诊断时主 要是作细胞DNA分析 FCM与细胞免疫学的结合是FCM 发展的一个里程碑 目前FCM最主要是做细胞表面抗原分 析 有时也需要做细胞内抗原分析 细胞DNA分析在现代 FCM分析中仍然占有一席之地 根据这些特点 用户便可 以因地制宜决定使用FCM的临床指征 1 FCM用于淋巴结或组织活检的指征 淋巴结 黏膜 皮肤和其他部位有临床疑似或病理组织形态提示淋巴瘤 2 FCM用于外周血和骨髓的指征 外周血淋巴细胞增 多 骨髓淋巴细胞和 或 浆细胞增多 未知异常细胞 血细 胞减少或有淋巴结和脾肿大 淋巴瘤的临床分期 监测治疗 反应和微小病变的检测 3 FCM用于体液的指征 淋巴细胞和 或 浆细胞增多 未知异常细胞 有已知或疑似淋巴系统肿瘤 二 B细胞淋巴瘤的分析 B细胞淋巴瘤的主要特征有免疫球蛋白轻链限制 又称 克隆性或单克隆性 即仅有两种轻链 中的一种存在 正常抗原的丧失和异常抗原的出现 B细胞淋巴瘤是来源 于单个B细胞株的克隆性增生 绝大多数B细胞淋巴瘤是 成熟B细胞的克隆性增生 由于在这一分化阶段B细胞已 具备表达细胞膜表面免疫球蛋白的能力 而且所有瘤细胞都 来源于一个共同的B细胞株 瘤细胞表面球蛋白轻链的表达 就被限制在其中的一种 或者 此为克隆性或单克隆 性 与此相反 在良性B细胞增生时 增生的B细胞来源于 不同的B细胞株 其表面免疫球蛋白轻链的表达有 也有 这样一来 只要1个B细胞群有轻链表达限制就要考虑 为B细胞淋巴瘤的可能 由于这个原因 有无免疫球蛋白轻 链表达限制是FCM在B细胞瘤分析中最重要的指标之一 值得注意的是 浆细胞肿瘤 前B细胞 precursorB2 cell 肿瘤 不表达细胞表面免疫球蛋白 在高度恶性淋巴瘤中 细胞表 面免疫球蛋白的表达也会减少甚至不表达 另外 NK细胞 活化的T细胞 单核 巨噬细胞 还有粒细胞会非特异性地与 血浆中的免疫球蛋白结合 吸附或通过Fc受体 造成表达 表面免疫球蛋白的假象 如果同时有单克隆血浆免疫球蛋 白增高 更会造成克隆性B细胞群的误判 好在这种非特异 性结合可以通过适当加温后清洗去除 克隆性B细胞群还 会有细胞大小 7 和其他抗原表达的异常 通过寻找这些异 常特征再结合轻链限制 FCM可以确认微量瘤细胞群使其 灵敏度接近 有时甚至超过常规PCR扩增法测定免疫球蛋 白基因克隆性 FCM测克隆性B细胞群的方法是在1个或2个试管中 同时加入广谱B细胞抗体 CD19 CD20 和抗 抗 抗体 如条件允许 还可加入针对性B细胞淋巴瘤抗体 CD10 CD5等 以增加灵敏度 以B细胞设门 CD19或CD20 SSC 正散射 用于测量细胞大小 或FSC 侧散射 用于测量细 胞粒度 这样可以把检验轻链表达限定在B细胞群从而 791 中华病理学杂志2006年4月第35卷第4期 Chin J Pathol April 2006 Vol 35 No 4 排除来自非B细胞的干扰 这种干扰主要是由于单核 巨噬 细胞 NK细胞 活化的T细胞细胞膜上的Fc受体与单抗试 剂本身或者样品中免疫球蛋白的非特异性结合 值得一提 的是 目前市面上可以买到的抗轻链抗体并不能涵盖所有的 轻链抗原决定簇 文献中对单克隆抗体与多克隆抗体之间 在检测克隆性B细胞有效率方面的一些分歧可能就在于此 为了增加诊断的可靠性 应当有两对不同的抗轻链抗体 在正常组织中 和 轻链的表达在全B CD19或 CD20 和轻链 或 的二维数据图上呈两相分布 反映了 正常淋巴细胞是 细胞和 细胞的混合 在克隆性B细胞 群中 单一轻链的表达导致单相 unimodal 阳性或阴性分 布 这些细胞只有一种轻链 或 阳性 另一条阴性 正 常或良性淋巴结组织中几乎所有的成熟B细胞都有表面轻 链表达 其 对 的比值大约是2 3 40 60 有表面 轻链表达或轻链比大大偏离正常值都可以是支持成熟B细 胞克隆性增生的证据 图 1 尽管文献上有正常 对比 小于3 对比 小于2的说法 明智的人都不会盲目的运用 这个标准 对于成熟B细胞 CD45和CD20强阳性 都有表 面轻链表达这一点也会有例外 这些最容易造成误诊的陷 阱都与滤泡B细胞有关 滤泡B细胞是最成熟的B细胞之 一 CD45和CD20的表达都很强 但它们表面轻链表达则很 弱 常常造成单相分布的假象 或不表达 前者会被误诊为 单克隆B细胞群 后者会被误诊为高度恶性淋巴瘤 这些病 例检测IgH基因重排多为阴性 8 9 也可阳性 10 但长期随 访都没有发现淋巴瘤 图1 B细胞淋巴瘤的FCM诊断的表面抗原分析 滤泡性淋巴瘤 1 个腋下淋巴结的穿刺标本 淋巴结样品细胞用两个抗体组合标记 第 一组合为CD202 异硫氢酸荧光素 FITC CD102 藻红蛋白 PE CD452 叶绿素蛋白 PerCP CD192 别藻蓝蛋白 APC 第二组合为抗 2FITC 抗 2PE CD452PerCP CD202APC 用4色FCM分析 左上图用CD45 FSC设门可见CD45强表达的成熟淋巴细胞中有大 绿色 小 红色 两个亚群 右上图显示所有的大细胞和部分小细胞为CD20 CD10 的滤泡型表达 左下图和右下图分别显示单相阴性分布 CD20 和单相阳性分布 CD20 结论 单克隆滤泡性 B细胞增生以 大B细胞为主 与最后诊断3级四倍体滤泡性淋巴瘤相符 对于B细胞很少的样品或者单克隆B细胞混在大量多 克隆B细胞之间的样品 FCM分析需要采用新的策略 首 先从细胞大小 反映在FSC的高低 或者其他抗原分布状 态入手 找到正常细胞与异常细胞的不同点 再根据这些不 同点设门测轻链表达 尽管仔细衡量 的比例对诊断会 有帮助 但绝大多数淋巴瘤都不用这样做 因为其轻链表达 的限制 即 比 几乎是一目了然 在这里 尽可能地采 集到足够多的细胞数是发现克隆性B细胞群的关键 肿瘤B细胞往往有正常抗原的不正常表达 CD20或 CD22增高或降低 它们还可以形成1个大小均一的细胞 亚群 反映在1个有FSC的二维数据图上为分布相对集中 的边缘相对清晰的数据点集团 其FSC或高 大B细胞淋 巴瘤 或低 小B细胞淋巴瘤 通过FSC和SSC与B细胞 抗原表达强度的观察来分辨克隆性B细胞群的过程又被称 作 克隆性检测 它大大增加了检测克隆性B细胞的阳性 率 灵敏度 CD19 CD20和CD22的异常表达可出现在很 多淋巴瘤 肿瘤B细胞通常比正常淋巴细胞大 这就可以 用FSC 与细胞大小成正比 来确认肿瘤B细胞 B淋巴瘤 细胞往往有异常抗原表达 针对CD5阳性或CD10阳性的 B细胞检测轻链表达可以大大提高诊断的确诊率 三 细胞DNA含量 细胞DNA含量测定可以用细胞核或者完整细胞 淋巴 瘤往往包含相当大的非肿瘤细胞成分 如果不加区别 大量 正常细胞和少数瘤细胞混杂在一起 会产生整倍体或低细胞 生长期的假象 用整细胞的好处在于可以同时测量细胞的 其他特征性参数 可供细胞鉴别的参数有FSC SSC 抗原表 达特征 非整倍体峰等等 这样一来 细胞DNA的分析就可 以在不同的细胞群中分别进行 用样品的其余材料 印片 涂片 cytospin等 判断肿瘤细胞的有无及估计肿瘤细胞的多 少对正确解答DNA分析结果也是必不可少的 DNA指数 D I 和倍体 根据约定 非整倍体是指在DNA 含量测定中出现了一个与整 二 倍体峰不同的峰 峰的高 低与所代表的细胞数成正比 非整倍体 G1 峰与整 二 倍 体 G1 峰的相对位置 即两峰的平均荧光值之比决定D I 根据D I可以知道该非整倍体为近整 二 倍体 D I 1 高 整 二 倍体 D I 1 低整 二 倍体 D I 1 或近四倍体 D I 2 用多重染色法同时测DNA含量和抗原表型可以 确认很小的非整倍体亚群 这对非整倍体亚群在样品总细 胞数中所占比例很少时非常有用 细胞周期分段分析 这种分析是根据细胞DNA含量的 差异将细胞划入不同的细胞周期分段中 即G1 S G2 M 再根据各分段中的细胞数算出其所占细胞总数的百分比 在淋巴瘤以及很多肿瘤组织中 正确计算细胞周期分段往往 做不到 这是因DNA含量测定没有与其他细胞参数的测定 结合起来 为了克服这一缺陷 以往曾经大量应用碘化丙啶 PI 染DNA加异硫氢酸荧光素 FITC 标记的抗体染细胞 抗原 效果不太理想 最近采用的DRAQ5染DNA方法是细 胞周期分段分析的重大突破 DRAQ5的荧光谱在670nm 891 中华病理学杂志2006年4月第35卷第4期 Chin J Pathol April 2006 Vol 35 No 4 图2 B细胞淋巴瘤的FCM诊断的DNA分析 四倍体大B细胞淋巴瘤 用CD202FITC CD192PE加DRAQ5三种荧光标记淋巴结样品细胞 DRAQ5 可同时被蓝激光和红激光激发放出深红光占据了两个光通道 中上图有 CD20和CD19阳性的B细胞和CD20和CD19阴性的T细胞两个细胞群 对这两个细胞群分别和一起做DNA测定可得出三个不同的结果 T2 细胞 是整二倍体 DNA含量在128左右 整个样品有两个峰 主峰在128左右 次峰在256附近 如果样品中异常细胞数不多 这个次峰有可能被当作正 常G2细胞而被忽略 但用表面抗原分析对异常B细胞的定向测定发现几 乎清一色的四倍体细胞 DNA含量在256左右 有趣的是它们的S期分段 并不高 图3 T细胞淋巴瘤的FCM诊断 表面抗原分析 这是两个类似的T细胞淋巴瘤 都是女 性儿童 临床表现均为器官移植后的腹腔肿瘤 肿瘤几乎全为CD4 T细胞组成 其中大 部分为异常CD4 T细胞 红色 少部分为正常CD4 T细胞 绿色 CD8 T细胞 蓝 色 极少 其他细胞 紫色 为少量B细胞和其他白细胞 异常T细胞在这2例中的共同特 征是CD3表达略减弱 CD2表达略增高 部分丧失CD7 例1比较明显 和HLA2DR表达 增强 其中正常CD4 T细胞提供了一个难得的内对照 与近红外区 对其他常用荧光染料干扰不大 因而可以至少 与两种不同荧光标记的抗体合用 DRAQ5可穿透细胞膜结 构 样品无须先固定或筛化 从而大大降低对细胞抗原和细 胞光学性质的破坏和影响 我们实验室已经用DRAQ5取代 PI做DNA含量测定和细胞周期分析 11 细胞表面抗原分析与DNA分析相结合可以进一步提高 FCM的诊断水平 以PI为基础的DNA分析法由于需要固 定和筛化对同时做表面抗原分析有影响 用DRAQ5 为基础的DNA分析法则可以避免这一缺陷 因为 DRAQ5无须固定或筛化 图2是用DRAQ5所做的 滤泡型淋巴瘤的DNA分析 四 浆细胞瘤和骨髓瘤的分析 浆细胞瘤的FCM诊断有两种方法 一是测细胞 内的 效果显著但做起来较繁琐 第二种方法是 测表面抗原 这是常用的1个测浆细胞的抗体组合 CD1382FITC CD562PE CD452PerCP CD192APC 正常 浆细胞为CD38 3 CD56 CD45 2 CD19 2 骨髓瘤细胞为 CD38 3 CD56 2 CD45 或 CD19 骨髓瘤患者的浆细胞中97 以上为异常浆细 胞 正常人应该没有异常浆细胞 异常免疫球蛋白 增多症有正常和异常浆细胞 其中正常浆细胞超过 3 12 五 T细胞淋巴瘤的分析 异常T细胞群的分析 T细胞淋巴瘤的FCM分 析比起B细胞来更具挑战性 T细胞淋巴瘤的诊断 指征有亚群限制性 正常表达抗原的丧失 异常抗原 的出现和表达水平的异常 CD3 TCR TCR 正常反应性T细胞由CD4阳性T细胞和CD8阳性T 细胞混合组成 其中CD4阳性T细胞较多 成熟T细胞如 果只含CD4阳性或CD8阳性T细胞 亚群限制 提示T细胞 瘤 但和轻链限制在诊断B细胞瘤中的作用相比 亚群限制 在诊断T细胞瘤中所起的作用力度还不够强 绝大多数T 细胞瘤为CD4阳性T细胞 由于T细胞瘤几乎总是和反应 性T细胞混在一起 纯粹的肿瘤T细胞群样品很难得到 T 细胞瘤往往被反应性T细胞群掩盖 某些情况下 CD8阳性 T细胞群会成为占绝对优势的T细胞亚 群从而造 成亚 群限制的 假象 例如 A I DS 骨髓移植后和病毒感染 不能表达某一广谱T细胞抗原是 十分重要的T细胞瘤诊断指标 有 75 的成熟T细胞瘤至少有一个广谱T 抗原不表达 CD7不表达是最常见的 一个 其他还有CD2 CD5和CD3 其 中2 3有多于1个抗原不表达 图 3 值得注意的是 在外周血中有一小部分 T细胞为CD3阳性 CD7阴性 正常 T细胞为CD5阴性 部分肿瘤T细胞 株可以没有异常抗原表达 它们之所 以被发现是因为数量上的增加 在正 常情况下各T细胞亚群在T细胞总量 中保持稳定的比例 如果某一亚群异 常增加也提示T细胞瘤 常见的例子 有大颗粒淋巴细胞淋巴增生性疾病 其 中的T细胞为CD8阳性 CD57阳性 991 中华病理学杂志2006年4月第35卷第4期 Chin J Pathol April 2006 Vol 35 No 4 图4 T细胞淋巴瘤的FCM诊断 例1的TCR V T细胞克隆性分析 一组由24个抗体组 成的针对24组由T细胞受体的 基因可变区 TCR V 所控制表达的T细胞表面相关抗 原簇对样品细胞的标记结果 这是4色FCM分析 每组可测3个相关抗原 用掉2个荧光 FITC和PE 还有2个荧光用来做表面抗原分析 CD32PerCP CD42APC 每组3个相关抗 原的荧光配备是FITC FITC PE和PE 用CD3和CD4设门可以对以上讲到的异常CD4 T细胞 CD3弱表达 和正常CD4 T细胞 CD3强表达 以及其他细胞群分别作TCR V 的测定 左上第1图显示左上象限 代表V 3 有克隆性细胞增生 CD56阳性 CD16阳性 它们的增加可能是克隆性的 另外 还有 T细胞和其他可被 FCM识别的T细胞亚群 它们 的增加提示肿瘤T细胞株 但需进一步作T细胞克隆性测 定 六 T细胞克隆性的FCM测定 T细胞异常抗原表达是诊断T细胞淋巴瘤的重要线索 但其也可以在很多良性病变中出现 这就是T细胞淋巴瘤 难以诊断的原因之一 所以要作T细胞克隆性测定 T细 胞克隆性的FCM测定是以T细胞受体 TCR V 的基因重 组多样性为基础的 克隆性T细胞群只应表达许多种V 表型中的一种 目前已有的检测抗体可涵盖70 的V 表 型 在文献中有V 的健康人群参考值 以V 为基础的T 细胞克隆性检测辅助诊断T细胞淋巴增生性疾病已被众多 已发表的临床实验证明是可行的 13 14 举例见图4 6和表 1 3 七 微量T细胞淋巴瘤的检测 微量T细胞淋巴瘤的检测是对FCM的一大挑战 其灵 敏度比测B细胞淋巴瘤低 由于总是被正常反应性T细胞 掩盖 必需进行多参数分析 针对特定的T细胞亚群 CD 4 或CD 8 结合抗原缺失 如CD7不表达 异常抗原 如表达 CD20 和异常表达 指正常抗原表达的增高或降低 的综合 分析是面对这一挑战的必经之路 八 FCM与其他诊断方法的比较 在淋巴瘤的诊断和分类中 免疫分析 IHC 或FCM 是 对形态学分析的重要补充 这一点对大多数人来说已无异 议 部分病例需要选择性地做分子生物学分析和细胞遗传 学分析 在这些诊断方法中 有的可提供的同样的信息 但 这需要临床医生针对每个病例在众多的方法中做出选择 那么如何比较IHC和FCM 一般说来 FCM比IHC灵敏 图5 T细胞淋巴瘤的FCM诊断 例1的TCR V T细胞克隆性分 析 显示各细胞亚群的TCR V 测量结果 图中抗原分布数据见 表1 2 异常CD4 T细胞包括CD7阳性和CD7阴性2个亚群均 有克隆性增生 其中V 3是1个经常出现的T细胞株 其临床意义 尚不清楚 占各自亚群的97147 和84148 表1 作为内对照的 正常CD4 T细胞每组抗原的阳性率则最多不超过11 后经 PCR扩增法测定TCR 基因确认为单克隆性 FCM可以快速地对大量细胞同时作多参数分析 在抗原表 达强度的分析方面 FCM也明显优于IHC 这样的分析能力 可以为淋巴瘤和淋巴增生性疾病的诊断和治疗提供高质量 的分型分级及鉴别诊断证据 另外 FCM与I HC相比 还有 减少主观臆测性和出报告快的优点 IHC的主要优点为免 疫标记可以直接与形态结构联系 还可以应用于固定后的组 织 缺点是作双重或多重免疫标记的效果很差 对抗原的表 达不能做定量分析 其结果的解释还有很多主观判断的成 分 依赖于解释人的训练 经验和智慧 有时非特异性背景 染色过高还会造成针对细胞膜抗原的结果根本无法解释 膜抗原的表达恰恰是诊断B细胞淋巴瘤最重要的指征之一 FCM也有其局限性 1 需要新鲜没有固定过的样品 2 样品采集和样品制备的过程中可能有选择性的细胞丧 失 3 得到的形态学信息很有限 FCM对霍奇金淋巴瘤和 那些肿瘤细胞被大量非肿瘤细胞掩盖的 病例用处不大 有些病例 如大细胞淋 巴瘤 肿瘤细胞不容易被收集到或在制 备过程中选择性丧失都会影响分析的结 果 与此相反 I HC由于近年来的不断改 进 在抗原辨认 新抗体的开发 特别是 针对关键抗原的抗体的开发和在甲醛固 定的蜡块中的应用上有许多独到之处 因此 I HC与FCM的结合可以彼此取长 补短 在以下几种情形 需要进一步活 检 1 克隆性细胞少于细胞总数的 10 2 FCM阴性 3 不能做DNA分 析又必需分级 4 临床需要 分子生物学诊断在淋巴瘤和淋巴增 生性疾病中的作用也是不可替代的 对 那些有特征性染色体畸变的淋巴瘤和淋 巴增生性疾病 如t 14 18 滤泡淋巴瘤 和t 11 14 套细胞淋巴瘤 PCR在检测 002 中华病理学杂志2006年4月第35卷第4期 Chin J Pathol April 2006 Vol 35 No 4 表1 图5中异常T细胞 红色颗粒 亚群的抗原分布 V 相关抗原 颗粒数 上方下方 阳性率 上方下方 11860 380 15 219120 400 30 334620335997 4784 48 449230 190 57 5 134330 720 82 5 2540 110 10 5 301000 25 7 1151080 322 67 7 222310 470 77 818290 380 73 915140 320 35 1114300 300 76 121350 280 12 13 15710 101 77 13 616160 340 40 141520 320 05 1610390 210 98 1710240 210 61 189130 190 33 1810270 210 68 2031280 660 71 21 340220 850 56 221460 300 15 233180 060 46 合计104 7998 77 表2 图5中正常T细胞 绿 蓝色颗粒 的抗原分布 V 相关抗原颗粒数阳性率 120 92 2115 07 32411 06 410 38 5 1176 54 5 220 77 5 310 38 7 183 05 7 262 29 883 43 952 15 1120 86 1220 84 13 1145 86 13 620 84 1400 16239 75 1752 12 1810 38 1862 28 20186 84 21 3197 09 2200 23124 48 合计77 38 图6 T细胞淋巴瘤的FCM诊断 例2之TCR V T细胞克隆性分 析 与图 5 例 1 的不同之处是它缺乏直接的克隆性增生的证 据 左图正常CD4 T细胞 绿色 与异常CD4 T细胞 红色 只是 在CD3的表达上有微小的差距 但在TCR V 的利用上却截然不同 表3 异常CD4 T细胞在所有24个TCR V 相关抗原中没有1 个有大量的阳性细胞 其所有24个抗原阳性细胞的总和还不到 4 正常CD4 T细胞中阳性细胞的总和则在正常范围之内 80 35 正常样品应该在70 左右 说明在异常CD4 T细胞中有1 个阴性的克隆而它不在现有的24个TCR V 抗原之中 在出现这 种情况时应视为间接性证据支持有克隆性T细胞增生 另一种可 能是里面有1个 T细胞亚群 本例抗 阴性 右图 排除了这 种可能性 后经PCR扩增法测定TCR 基因确认为单克隆性 图中 数据见表 3 表3 图6中正常 绿色颗粒 和异常 红色颗粒 T细胞的抗原分布 V 相关抗原 颗粒数 异常正常 阳性率 异常正常 1890 020 80 242360 123 21 3133880 387 85 4162560 475 30 5 125700 076 62 5 215110 041 04 5 31180 030 67 7 1371010 118 44 7 252520 154 34 89540 034 57 911640 035 42 1161590 185 00 129130 031 19 13 128390 083 56 13 6167250 482 28 141290 030 81 1618510 054 56 17149260 432 33 185520 014 23 183390 100 73 20130520 384 23 21 333170 101 35 2234100 100 79 23159130 461 03 合计3 8880 35 微量肿瘤细胞上优于FCM能达到的水平 但是 PCR的适 用性受染色体易位断裂点两侧DNA序列限制 不是所有的 染色体畸变都能用PCR查出来 很多淋巴瘤没有已知的染 102 中华病理学杂志2006年4月第35卷第4期 Chin J Pathol April 2006 Vol 35 No 4 色体畸变 PCR也就没有用武之地 有时一个肿瘤有好几种 不同的染色体畸变或类似的畸变 但是断裂点不一样 这样 一来 PCR阴性并不能排除肿瘤 另外一个更加通用的PCR方法是用于T细胞或B细胞 的克隆性鉴定 对于鉴别良性还是恶性淋巴增生十分有用 对B细胞恶性增生 PCR方法通过定点扩增测IgH克隆性基 因重组 阳性率达到70 左右 灵敏度则稍逊于FCM 对T 细胞恶性增生目前主要靠PCR法测TCR基因克隆性重组 FCM查TCR基因克隆性重组还刚起步 所有以上提到的方法 尽管有所重叠 但各自都有独到 之处 如应用得当就可以互相取长补短 把淋巴瘤和淋巴增 生性疾病的诊断提升到一个前所未有的高度 这是单凭传 统的形态学分析无论如何达不到的 参考文献 1 DunphyCH Applicationsofflowcytometryand immunohistochemistry to diagnostic hematopathology Arch Pathol LabMed 2004 128 100421022 2 Orfao A Schmitz G Brando B et al Clinically useful information provided by the flow cytometric immunophenotyping of hematological malignancies current status and future directions Clin Chem 1999 45 170821717 3Stetler2Stevenson M Braylan RC Flowcytometric analysis of lymphomas and lymphoproliferative disorders Semin Hematol 2001 38 1112123 4 Braylan RC I mpact of flowcytometry onthediagnosis and characterization of lymphomas chronic 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