观察转染后A2780细胞生长状态 医学毕业论文写作.pdf

观察转染后观察转染后 A2780A2780A2780A2780 细胞生长状态细胞生长状态 本文摘自 本文摘自 齐鲁护理杂志齐鲁护理杂志 网址 网址 CD59 是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇 GPI 锚固糖蛋白 具有多种 重要的免疫功能 1 首先 它作为补体系统终末阶段的调节蛋白 以同源限制的方式 与 C8 和 或 C9 结合从而抑制攻膜复合物 MAC 的生成 保护自身正常组织细胞免受补体损伤 其次 GPI锚固的 CD59 是一个重要的信号转导分子 参与了单核细胞 粒细胞 血小板 T 细胞的活化信号转导过程 尤其是作为 CD2 的配体在T细胞活化中的辅助作用倍受人们 的关注 近年来 国外报道已在多种实体肿瘤细胞中 如卵巢 前列腺等发现有 CD59 分子 的过表达 并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关 提示 CD59 分子的抗补体活性可能 与生殖系统肿瘤细胞的逃逸相关 2 CD59 分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视 及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点 CD59 分子 NMR 结构显示 抗补体活性区域主要集 中于 N37 H44 之间 推测 CD59 第 40 位保守氨基酸可能是 CD59 分子活性位点 3 本 研究拟用基因转染的方法 将野生型 CD59 基因及其突变体 40 位色氨酸缺失 转染入人 卵巢癌细胞 A2780 中 观察转染后 A2780 细胞生长状态及 40 位色氨酸缺失后 CD59 分子抗 补体活性的改变 1材料和方法 1 1 材料 1 1 1 质粒 菌株与细胞株 人突变 CD59 cDNA 重组 PIRES 载体 pires M1CD59 其含有一段约 500 bp 的 CD59 突变基因 即 CD59 第 40 位点色氨酸缺失 野生型 CD59 cDNA 重组 PIRES 载体 pires WTCD59 含有一段约 500 bp 的正常 CD59 基因 均由本室构建并保存 大肠杆菌 JM109 由本室保存 卵巢癌细胞 A2780 由齐鲁医院惠赠 1 1 2 主要试剂RPMI 1640 培养基购自 Gibco 公司 牛血清购自杭州四季青公 司 胰酶和 G418 均购自 Amresco 公司 真核表达载体 PIRES 含有 CMV 强启动子序列 购 自 TakaRa 公司 限制性内切酶 EcoR 购自 TakaRa 公司 转染试剂 Lipofectin Reagent 购 自 Invitrogen 公司 MTT 由中国医学科学院血液研究所提供 鼠抗人 CD59 单克隆抗体购 自 BD 公司 RT PCR 试剂盒与总 RNA 提取试剂 Biozol 均购自 Promega公司 1 2 实验方法 1 2 1 质粒的扩增及鉴定 将本室保存的两种重组质粒转化大肠杆菌 JM109 碱裂解法小量提取质粒 EcoR 37 过夜酶切 同时设 PIRES 空质粒作为阴性对照 酶切产物行 10 g L 琼脂糖凝胶电泳 以 DNA 标准相对分子质量为参照 筛选含重组基因的转化子 阳性克隆 ALB 扩增菌液划板备 用 1 2 2 细胞转染及稳定转染细胞系的建立 转染试剂为阳离子脂质体 Lipofectin Reagent 在转染前 1 d 用 2 5 g L 胰酶消化生长状 态良好的 A2780 细胞 取 0 5 mL 加入 24 孔细胞培养板中 37 过夜培养 24 h 细胞达到 80 90 融合 取 pires WTCD59 及 pires M1CD59 转染 A2780 细胞 并用空质粒作为 阴性对照 转染 24 h 后在含 400 800 mg L G418 的 RPMI 1640 中培养 2 周后挑取单个 克隆 连续传代 10 次 将 pires WTCD59 转染细胞命名为WTA pires M1CD59 转染细 胞命名为 M1A 1 2 3 RT PCR检测转染细胞中 CD59 mRNA 的表达 提取细胞总 RNA 以 GAPDH 为内参照 设计用于鉴定 CD59 全长基因的引物 上游 引 物 5 GGGAATCCAAGGAGGGTC 3 下 游 引 物 5 AATGGAGTCACCAGCAGA 3 针 对 40 位 突 变 位 点 设 计 下 游 引 物 5 TGCTCAAACTTACACTTGTTATACACT 3 反应条件为 反转录 48 45 min 预变 性 94 5 min 94 30 s 45 1 min 68 1 min 40 个循环 延伸 68 7 min 扩增 产物于 10 g L 琼脂糖凝胶中电泳 并通过 UVP ImageAnalysis Software凝胶分析软件比较条 带相对亮度 1 2 4 酶免疫组化检测 CD59 蛋白表达收集对数生长期的 WTA2780 M1A2780 及未转 染 A2780 细胞 并用 40 g L 多聚甲醛固定行免疫组化染色 依次与小鼠抗人 CD59 单克隆 抗体 HRP 羊抗鼠 IgG 二抗 37 作用 45 min 最后 DAB 底物显色 梯度乙醇脱水 二 甲苯透明 封片后镜下观察 1 2 5 兔抗人 A2780 细胞抗血清的制备 应用 2 5 g L 胰酶消化状态良好的 A2780 细胞 调整细胞密度至 1 6 1011 L 以其免疫家兔 10 d 后经心脏取血 分离血清 应用细胞凝 集试验测定抗体效价为 1 5 120 分装 20 冻存备用 1 2 6 抗补体活性检测 用 MTT 法测细胞增殖率间接反应 CD59 的抗补体活性 收集细胞 分为空白对照组 WTA 组 M1A 组以及 A2780 组 WTA CD59mAb 组 M1A CD59mAb 组 A2780 CD59mAb 组共 7 组 除空白对照组以外 每组各孔分别加入兔抗 A2780 细胞抗血清 终浓度为 1 5 120 和新鲜人血清 终体积分数 0 08 各 1 L 37 孵育 1 h 每孔各加入 10 L 浓度为 5 g L 的 MTT 37 孵育 4 h 后 弃去上清 加入 10 L 的 DMSO 吹打混匀 振荡溶解 15 min 酶标仪测波长 630 nm 处吸光度 A 值 计算细胞抑制率 细胞抑制率 1 实验组平均 A 值 空白对照组平均A值 对照组平均A值 空白对照组平均A值 100 重复 3 次取平均值 1 3 统计学方法 应用 SPSS 13 0 及 PPMS 1 5 4 统计学软件进行数据处理 结果以 s 表示 组间比较采 用方差分析 P 0 05 为差异有显著性 2 结果 2 1 重组质粒的酶切鉴定 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示 EcoR 单酶切 M1 CD59 质粒及 WTCD59 质粒均切 下 500 bp 左右的 CD59 片段 证实这两种真核表达质粒扩增成功 2 2 CD59 mRNA 的表达 WTA2780 M1A2780 及未转染 A2780 细胞均有 CD59 354 bp 和内参 500 bp 表达 比较 354 bp 处条带相对亮度 WTA2780 M1A2780 分别为 1 78 0 07 和 1 75 0 05 未转 染 A2780 细胞为 1 07 0 09 WTA2780 M1A2780 与未转染 A2780 细胞相比较 差异均有 统计学意义 F 6 60 q 5 38 5 54 P 0 05 WTA2780 M1A2780 比较差异无显著性 q 0 15 P 0 05 说明转染后 CD59 的 mRNA 表达高于未转染细胞 利用 CD59 上游引物与突变下 游引物行 RT PCR M1A2780 可扩增出一段 204 bp 的 DNA 产物 说明突变的 CD59 基因 成功转入 A2780 细胞 并获转录表达 2 3 D59 蛋白表达 显微镜下可见染成棕褐色的阳性 WTA2780 M1A2780 细胞 未转染 A2780 细胞染色较 阳性染色细胞显色较浅 2 4 细胞增殖抑制率 本文空白对照组 WTA 组 M1A 组 A2780 组 WTA CD59mAb 组 M1A CD59mAb 组以及 A2780 CD59mAb 组 A 值分别为 0 037 0 001 0 764 0 050 0 712 0 019 0 665 0 087 0 437 0 035 0 479 0 028 0 496 0 022 WTA CD59mAb 组 M1A CD59mAb 组以及 A2780 CD59mAb 组的细胞增殖抑制率分别为 22 90 2 95 36 30 4 87 29 60 3 16 WTA CD59mAb 组 M1A CD59mAb 组与 A2780 CD59mAb 组相比较 差异均有显著性 F 46 60 q 4 31 11 09 P 0 05 WTA CD59mAb 组与 M1A CD59mAb 组比较 差异亦有统计学意义 q 12 43 P 0 05 3 讨论 人CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固型糖蛋白 能抑制补体C9 结合C5b 8 从而影响膜攻击复合物 MAC 的形成 5 国内外文献报道 胃癌 肠癌 肺癌 子宫内 膜癌 神经纤维瘤 卵巢癌 前列腺癌等有 CD59 的过表达 提示 CD59 与肿瘤的失控性生 长和恶性转化密切相关 6 DONIN 等 7 研究显示 在对癌细胞的治疗中 如果能联合应用 CD59 分子的抗体 将极大提高癌细胞对补体杀伤作用的敏感性 BJORGE 等 8