（微生物学专业论文）格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌生物固氮作用的研究.pdf

中文摘要 用k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 的 搬 匿基因 a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s ey u 6 2 的n i h r 基因的 启动子序列和d r a t g 基因探针分别与m a g n e t o s p i r i l l u m 属的mm a g n e t o t a c t i c u m 和m g r y p h i s w a l d e n s e总d i n a 杂交 结果为阳性 验证了b a 纠l i n s k i 等用砌 如p 扣f 盯踟 r u b r u m 的n i f h d k 为探针与 zm a g n e t o t a c t i c u m 和 zg r y p h i s w a l d e n s e 的d n a 杂交的结 果 同时也证明在这两个菌中存在d r a t g 基因 参照已知数种固氮菌的n i f i l 和d r a g 基因序列 设计了扩增mg r y p h i s w a l d e n s e 的 删曰和加g 中间区域内保守性较强的序列的寡核苷酸引物 分别对mg r y p h i s w a l d e n s e 的总d n a 进行p c r 扩增 扩增出了所需要的目的片段 对所扩增的大小约为3 0 0 b p 的 n g n 段的测序表明 该片段与其它固氮菌的砌确相关区域有较高的同源性 与m m a g n e t o t a c t i c u m 尼r u b r u m 和r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 比较接近 用足r u b r u m 的n i f h d k 和d r a t g 基因在n c b i 数据库中进行mm a g n e t o t a c t i c u m 基因 组的同源性搜索 发现mm a g n e t o t a c t i c u m 的 孵 卿加z g 基因定位于c o n f i 9 3 8 2 3 q b 利用d n a m a n 软件系统分析了该菌的n i f l t d k 和d r a t g 基因 同源性比较表明其与尼 r u b r u m 更为接近 通过碳源种类 浓度及其它营养成分对mg r y p h i s w a l d e n s e 生长的影响试验 确定 了培养该菌的最佳培养基 在5l 自控发酵罐中 建立了固氮条件下肘g r y p h i s w a l d e n s e 的深层培养技术 在以乳酸钠为碳源的限氮培养基中 通入含0 4 o 8 0 2 的氮气 p h 和温度分别控制在7 2 和3 0 c 经三次补料培养2 1 小时 细胞密度0 1 3 6 0 0 达1 3 最高 固氮活性为2 1 7n m o l c 2 h d h o d 6 0 0 n i n 利用8 0l 自控发酵罐进行扩大培养 获得了相似 结果 铵和氧对固氮活性有明显的调节作用 结合用d r a t g 基因为探针的杂交试验 进一步明确了该菌具有固氮酶翻译后的活性调节系统 从mg 抽p d 中分离并纯化了有活性的钼铁蛋白 其与k p n e u m o n i a e 的铁 蛋白的重组活性为3 4 1 3n m o l c 2 h d m g m i n 从酶学水平上证明了该菌的生物固氮 但 这一数值约为五l m e w n o n i a e 自身两组分组合的活性的l 3 说明它们的固氮酶系统存在 有差异 关键词 m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s e 固氨酶 固氮活性调节 深层培养 n i h d k d r a t g a b s t r a c t g e n o m i cd n af r o mmg r y p h i s w a l d e n s ea n d m m a g n e t o t a c t i c u m s h o w e d p o s i t i v e h e t e r o l o g o u sh y b r i d i z a t i o nw i t hn i f h d kg e n ep r o b ef r o mk l e b s i e l l ap n e u m o n i a e d r a t gg e n e p r o b ea n dn f ng e n ep r o m o t e rp r o b ef r o ma z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s ey u 6 2 t h e s ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sc o n f i r m e dt h es o u t h e r nb o l tr e s u l to b t a i n e db y b a z y l i n s k ie ta la n di n d i c a t e dt h ep r e s e n c e o f n i t r o g e n a s es t r u c t u r a lg e n e a n dd r a t g g e n ei nmg r y p h i s w a l d e n s ea n dmm a g n e t o t a c t i c u m a c c o r d i n gt ot h e c o n s e r v a t i v es e q u e n c e so fs e v e r a ln 柑a n dd r a gg e n e sf r o md i f f e r e n t n i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a t w op a i r so fd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d u s i n g t h et o t a ld n ao f m g r y p h 豇w a l d e n s en st e m p l a t e a b o u t3 0 0 b p 月归f r a g m e n ta n d5 0 0 b pd r a g f r a g m e n tw e r ea m p l i f i e dr e s p e c t i v e l yb yp c i lt h em 刚to fs e q u e n c i n go ft h en 口对f r a g m e n t i n d i c a t e dt h a tt h es e q u e n c eo ft h i sf r a g m e n th a dh i g l li d e n t i t yw i t hp u b l i s h e ds e q u e n c eo f h p f r o mo t h e rn i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a t h en no fm g r y p h i s w a l d e n s ew a s c l o s e rt 0t h a to fm m a g n e t o t a c t i c u ma n d 兄r u b r u m t h a nt h a to f o t h e r n i t r o g e n f i x i n gb a c t e r i a h o m o l o g ys e a r c h e su s i n gt h eb l a s t n e t w o r ks e r v i c eo fn c b i t h en a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o m d e m o n s t r a t e dt h a tt h et w og e n ec l u s t e r so f n i f h d ka n dd r a go f m m a g n e t o t a c t i c u mw e r e l o c a t e da tc o n t i g3 8 2 3o fi t sg e n o m i e s e q u e n c e t h eg e n eo f n t f h d k a n d d r a t gw e r ea n a l y z e db yu s i n gd n a m a ns o f t w a r e 1 d e n t i t yo fa l i g n m e n ti n d i c a t e dt h a tt h e n i f h d kf r o mmm a g n e t o t a e t i c u mw a sc l o s e rt ot h a tf r o m 足r u b r u mt h a nt h a tf r o mo t h e r n i t r o g e n f i x i n g b a c t e r i a t h em e d i u mf o rg r o w t ha n d n i t r o g e nf i x a t i o no f m g r y p h i s w a l d e n s ew a so p t i m i z e db a s e do n t h ee x p e r i m e n t so f t h ee f f e c to f c a r b o ns o u r g ea n do t h e rn u t r i e n t so nt h eg r o w t ho f t h i so r g a n i s m as u b m e 曙e dc u l t u r e t e c h n i q u e f o rmg r y p h i s w a l d e n s eu n d e r n i t r o g e n f i x i n g c o n d i t i o n m i c r o a e r n b i ea n dn l i m i t e d w a s s e tu pi na5lf e r m e n t e r w h e nt h ep ha n dt e m p e r a t u r ew e r e c o n t r o l l e da t7 2a n d3 0 r e s p e c t i v e l y a n dt h eo x y g e nc o n c e n t r a t i o nw a sc o n t r o l l e db y s p a r g i n gw i t hn 2c o n t a i n i n go 4 0 8 o f0 2 t h ef i n a lo p t i c a ld e n s i t y o d 6 0 0r i m a n da c t i v i t yo f n i t r o g e nf i x a t i o no f c e l l sw o r e1 3a n d 2 1 7n m o lc 2 h d l v o d mr e s p e c t i v e l yw i t h i n2 1h o u r sb y t h r e et i m e so ff e e d si nn a l a c t a t em e d i u m s i m i l a rr e s u l tw a so b t a i n e di n8 0lf e r m e n t o r t h e a c t i v i t yo fn i t r o g e nf i x a t i o no fc e l l sw a si n h i b i t e do b v i o u s l yb yo x y g e na n da m m o n i u m i t 2 i n d i c a t e dt h a tt h ep o s t t r a n s l a t i o n a lr e g u l a t i o no f n i t r o g e n a s ee x i s t e di nmg r y p h i s w a l d e n s e m o f e p r o t e i nw a s i s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mm g r y p h i s w a l d e n s e c o m p l e m e n t a r ya c t i v i t yo f m o f ep r o t e i no fm g r y p h i s w a l d e n s ew i t hf ep r o t e i no f 芷p n e u m o n i a em 5 a lw a s3 4 1 3n m o l c 2 h 4 m g m i n t h i sr e s u l tw a so n l yo n e t h i r do f t h ea c t i v i t yo fn i t r o g e n a s eo f 置p n e u m o n i a e m 5 a li t s e l f i tm i g h tb et h a tt h en i t r o g e n a s eo f m g r y p h i s w a l d e n s ew a sd i f f e r e n tf r o mt h a to f k p n e u m o n i a e m 5 a 1 k e yw o r d s m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s e n i t r o g e n a s e r e g u l a t i o no f a c t i v i t yo f n i t r o g e n f i x a t i o n s u b m e r g e dc u l t u r e n i f t t d k d r a t g 3 论文研究背景综述 一 趋磁细菌的研究进展及应用前景 6 0 年代末 生物学领域出现了一个新的分支及边缘学科一生物磁学 李国栋著 1 9 8 3 其研究内容包括外界磁场对生物的影响 生物材料的磁性 结构和功能的关系 生物在其 生命活动过程中产生的磁场以及生物磁工程学 由于物质的磁性是普遍存在的 地球本身 是一个巨大的磁场 生活在地球上的任何生物无不例外地受其影响 同时又对其表现出一 定的反应 不同生物甚至是同一生物的不同组织 不同器官产生的磁性效应又与其本身的 磁性特性 抗磁性 顺磁性 强磁性等 密切相关 有些生物由于体内含铁 镍等强磁性物 质 对磁场更为敏感 甚至表现出趋性运动 m a g n e t o t a x i s 及定向行为 人们最早在1 9 6 2 年就发现海生软体动物甲贝体内含有一种对磁场极为敏感的磁铁矿 f o 0 4 颗粒 k r i s c h v i n l j l e ta 1 1 9 7 8 而后又相继在蜜蜂的腹部 g o u l d j l 鲋a l 1 9 7 8 家鸽的头部 k r i s c h v i n k j l e t a l 1 9 7 8 w a l e o t t c a 1 9 7 9 海豚 蝴蝶 藻类 t o r t e s d e e t a l 1 9 6 8 及金枪 鱼 w a l k e r m m e ta l 1 9 8 2 体内 甚至在脊椎动物 k r i s c h v i n k j l 1 9 9 7 及人脑的海马组 织中 k r i s c h v i n k j l a l 1 9 9 2 也发现了这种颗粒 此后 有一类对磁场具有趋性的细菌 越来越引起人们的注意 人们对其进行了一系列的研究 1 趋磁细菌的研究史 1 9 7 5 年美国科学家b l a k e m o r e 首次发现了趋磁细菌 b l a k e m o r e r p 1 9 7 5 他在研究 盐泽泥浆沉积物中的螺旋体 s p i r o c h a e t ap l i c o t i l i s 时 发现有些细菌迅速迁移到载玻片北 侧 开始 他以为这是由于北边窗口射进的光线引起的趋光性行为 后来发现不论光线从 何方照射到玻片上 细菌仍然迁移至玻片北侧 但当在显微镜附近放一块磁铁时其运动方 向则随之改变 随后在w o o d s h o l e 实验室中工作的k a l m i j i 加入了这一研究工作 他们用一 架装有磁场强度约等于地磁场强度 1 g a u s s 的亥姆霍兹线圈的显微镜进一步证实了这种细 菌的趋向性行为是由地磁场引起的 并称之为趋磁细菌 m a g n e t o t a c t i cb a c t e r i u m 1 9 7 8 年 m o e n c h 等利用磁铁从自然环境中分离得到这类微生物 m a g n e t o e o e c u s 1 9 7 9 年b l a k e m o r e 等在合成培养基上分离纯化了第一株趋磁细菌 并命名为趋磁水生 螺菌 q u a s p l r i l l u mm a g n e t o t a e t i e u m m a r a t e a e ta l 1 9 8 1 1 9 9 1 年s c h l e i f e r 等根据系统分 类的结果将其改名为m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c w n 1 9 8 0 年e s e a l a n t e s e m e r e n a 等报道 4 了m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 在微好氧条件下硝酸盐的代谢途径 b l a k e m o r e 等 1 9 8 0 在南半球找到了趋磁细菌 b a l k w i l l 等 1 9 8 0 报道了mm a g n e t o t a c t i c u mm s l 的超 微结构 m a r a t e a 等于1 9 8 1 年鉴定mm a g n e t o t a c t i c u mm s 一1 为一个新种a q u a s p i r i l l u m m a g n e t o t a c t i c u ms p n o v a t c c 3 1 6 3 2 d s m 3 8 5 6 r o s e n b l a t t 等 1 9 8 2 报道了测定趋磁细菌 磁矩的方法 1 9 8 3 年b a z y l i n s k i 等对m m a g n e t o t a c t i c u m m s 1 的氮源代谢情况作了系统的 报道 同时利用乙炔还原法对此菌和两株没有趋磁特性的菌株n m i a 和n m 1 b 进行了固 氮作用的研究 证实它们都具有固氮能力 m a t s u d a 等 1 9 8 3 利用晶体衍射法对m m a g n e t o t a c t i c u mm s 1 的磁性颗粒形态和结构进行了研究 f r a n k e l 等 1 9 8 3 报道了趋磁细 菌沉积f e 3 0 4 的情况 m a n n 等 1 9 8 4 利用高分辨率电子显微镜研究了m a g n e t o c o c c u s 及m m a g n e t o t a c t i c u mm s l 的磁性颗粒的形态结构 s p o r m a n n 等 1 9 8 4 报道了彳 m a g n e t o t a c t i c u m 在微好氧条件下磁性颗粒形成情况 结果表明氧分压是影响其形成的 个 重要因素 s t o l z 等 1 9 8 6 和s p a r k s 1 9 8 6 分别在加利福尼亚和英国的不同地区再次找到了 不同形态的趋磁细菌 p a o l e t t i 等 1 9 8 6 发现mm a g n e t o t a c t t c u mm s 1 在生长过程中能够产 生氧肟酸 h y d r o x a m a t e 同年p e t e r s e n 等 1 9 8 6 在南大西洋深海的淤泥中找到了细菌磁性颗 粒的化石 1 9 8 7 年日本人m a t s u n a g a 等报道了趋磁细菌磁性颗粒在固定化酶中的应用研究 结果表明它是一种优良的固定化酶载体 k a r l i n 等 1 9 8 7 报道了在低氧的海洋淤泥中磁铁能 自然形成 l o v l c y 等 1 9 8 7 报道了非趋磁性铁还原菌能在厌氧条件下合成胞外磁性物质 b a z y l i n s k i 等于1 9 8 8 年报道了能在厌氧条件下合成胞内磁性颗粒的海洋趋磁细菌m a g n e t i c v i b d om v i g o r b y 等 1 9 8 8 报道了mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 磁性颗粒的膜是一种磷脂双 分子层的膜状结构 并就其成分作了系统分析 1 9 8 9 年s p a r k 等于英国的盐泽池塘中发现 了趋磁细菌 1 9 9 0 年f a s s b i n d e r 等发现土壤中也存在趋磁细菌 f a r i n a 等 1 9 9 0 m a n n 等 1 9 9 0 在海洋淤泥中发现了分别含f e s f e 3 s 4 或f e s 2 颗粒的趋磁细菌 l i n sd eb a r r o s 等 1 9 9 0 对趋磁特性作了简要的综述 1 9 9 1 年m a t s u n a g a 等报道了一株能在好氧条件下生长 的趋磁细菌m a g n e t o s p i r i l l u r as p a m b 1 的特性 a d a m k i e w i c z 等 1 9 9 1 报道了在低琼脂泥 培养基中富集培养趋磁细菌的过程 1 9 9 2 年s 研n g 等报道了利用1 6 s r r n a 序列分析对富 集样品中不能分离的趋磁细菌的鉴定方法 弄清了趋磁细菌在系统进化中所处的位置 m a t s u n a g a 等 1 9 9 2 报道了t n 转座子对趋磁细菌m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 引起的诱变作 用并分离到与磁性颗粒合成有关的三个基因片断 1 9 9 3 年 s a k a g u c h i 等分离纯化并证明 硫还原细菌r s 1 能够合成磁性颗粒 n a k a m u r a 等 1 9 9 3 将异硫氰酸荧光素与大肠杆菌的 单克隆抗体连接 并固定在细菌磁性颗粒的表面 建立了测定和除去大肠杆菌的方法 f a r i n a 等 1 9 9 4 报道了利用电子及原子力显微镜观察趋磁细菌磁性颗粒的方法 t h o m h i l l 等 1 9 9 4 发现杆状趋磁细菌b s 一1 体内的几千粒磁性颗粒不呈链状排列而是呈网状排列 球 形趋磁细菌b s 2 体内的磁性颗粒呈辐射状排列 h a r a s k o 等 1 9 9 4 研究了趋磁细菌的磁畴 特性 我国学者卫扬保等 1 9 9 4 报道了武昌东湖水体中趋磁细菌w d 1 的分离纯化及生理 生化特性 1 9 9 5 年 t h o m h u l 等报道了利用p c r 技术直接鉴定自然界中未培养的趋磁球 菌的方法 s c h u l e r 等 1 9 9 5 建立了利用光散射法测定mg r y p h i s w a l d e n s e 磁性的方法 李辉 文等 1 9 9 6 报道了琥珀酸脱氢酶 呼吸抑制剂 解偶联剂对趋磁细菌w d 1 生长和磁性颗 粒合成的影响 范国昌等 1 9 9 6 报道了趋磁细菌在我国的分布状况 证明在黄土高原的土 壤里也存在趋磁细菌 m a t s u n a g a 等 1 9 9 6 和j 用细菌磁性颗粒复合物建立了化学发光酶联免 疫测定的方法 s a k a g u e h i 等 1 9 9 6 建立了不用趋磁性分离趋磁细菌的新方法 1 9 9 7 年 m a t s u n a g a 从m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 中克隆了一个2 9 7 5 b p 的核酸片段 证明其由两 个开放阅读框组成 其中o r f i 确定为m q 鲥基因 推测其编码产物为与磁性颗粒合成相 关的f e 转运蛋白 b e r t a n i 等 1 9 9 7 报道了在mm a g n e t o t a c t i c u m 中存在两种类型细菌铁蛋 白的证据 章勇良等 1 9 9 7 报道了好氧趋磁细菌h m 1 的生物学特性 1 9 9 8 年 m a t s u n a g a 等报道了生物磁性颗粒的形成及应用前景 再次证明m a g a 蛋白是一种f e 转运蛋白 存 在于磁性颗粒的膜上 与磁性颗粒的合成有关 陈明杰等0 9 9 8 报道了f e i i l l 对趋磁细菌 w d 1 分泌铁螯合物活性的影响 谢昕等 1 9 9 s 对趋磁细菌w d 1 的同工酶进行了分析 结 果表明趋磁细菌w d i 在微好氧和好氧条件下 醑酶 过氧化物酶 苹果酸脱氢酶 苹果 酸酶 乳酸脱氢酶等同工酶具有明显不同的酶带和酶活性 呈现酶的多分子形态 s u z n k i 等 1 9 9 8 利用高分辨的磁力显微镜观察到经n a o h 和乙醇溶解m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 细胞后 收集到的磁性颗粒仍能按磁力线方向呈链状排列 b a h a j 等 1 9 9 8 报道了利用趋磁 细菌从污水中回收放射性钚的方法 1 9 9 9 年 s c h u l e r 发表了趋磁细菌的磁性颗粒形成的 综述 m a t s u n a g a 等0 9 9 9 g j 用p r o t e i n a 细菌磁性颗粒复合物建立了化学发光酶联免疫测定 的方法 s e e e h i 等 1 9 9 9 建立了荧光酶联免疫测定猪血浆中生长激素的方法 c h e m l a 等 1 9 9 9 利用超导量子干扰显微镜再次研究了趋磁细菌的运动 l i n s 等 1 9 9 9 发现在未培养的趋磁 细菌中富含磷颗粒 t a y l o r 等 1 9 9 9 对细菌的趋氧性和其它能量敏感行为进行了综述 2 0 0 0 年 b a z y l m s k i 等利用杂交从遗传学上证明了m a g n e t o s p i r l l l u m 各菌株的生物固氮 m a t s u n a g a 等 2 0 0 0 报道了用重组m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 生产荧光酶 磁性颗粒复合物 的方法 同年该课题组还克隆了m p s a 基因 l a t s u n a g a t e ta 2 0 0 0 并报道了利用重组 m a g n e t o s p i r i l l u r as p a m b i 生产荧光酶磁性颗粒的条件 m a t s u n a g a t e ta l 2 0 0 0 t a n a k a 等 2 0 0 0 利用抗体 p r o t e i n a 细菌磁性颗粒复合物建立了全自动化学发光酶联免疫测定胰岛 素的方法 a r a g a o 等 2 0 0 0 研究了趋磁细菌在磁场改变时的运动情况 u r b a b 2 0 0 0 研究了 6 失重对mm a g n e t o t a c t i c u m 影响 o k a m u r a 等 2 0 0 0 利用双向凝胶电泳分析了 m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 磁性颗粒膜上的特异性蛋臼 2 0 0 1 年 b e r t a n i 等报道了m m a g n e t o t a c t i c u m 基因组的物理图谱及遗传特点 y a n g 等 2 0 0 1 报道了培养基组成 铁源 氧分压对重组m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 产生磁性颗粒的影响 2 0 0 2 年 g l a s a u e r 等报道 了铁还原细菌能分解胞内铁矿物质 m c k a y 等1 9 9 6 年在火星陨石中 a l h 8 4 0 0 1 发现磁性 颗粒 s c o t t 等 1 9 9 9 t h o m a s k e p r t a 等 2 0 0 1 f r i e d m a n n 等 2 0 0 1 对a l h 8 4 0 0 1 中的磁性颗粒进行了深入研究 并认为其是火星上有生命起源的证据 2 趋磁细菌的生态分布 大量的研究资料表明趋磁细菌的分布范围极为广泛 从南半球0 3 l a k e m o r e r ee ta 1 1 9 8 0 到北半球 b a z y l i n s k i d a e ta 1 1 9 8 8 乃至赤道 f r a n k e l r b e ta 1 1 9 8 1 等不同地 理位置的不同区域的池塘 m a t s u n a g a te t 以 1 9 9 1 s p a r k n h c e la 1 1 9 8 9 河流 b l a k e m o r e r p e ta 1 1 9 8 0 湖泊 s p a r k n h c1 9 8 6 卫扬保等1 9 9 4 海洋 t 3 a z y l i n s k i d a e t a l 1 9 8 8 i t f a r i n a m 甜a 1 9 9 0 f a s s b i n d e r j w e e t a l 1 9 9 0 范国昌等 1 9 9 6 中都有趋磁细菌存在 虽然趋磁细菌在自然界广泛存在 但它们绝大多数分布在微好氧及厌氧环境中 b a z y l i n s k i 等 1 9 9 5 调查了不同深度水域中趋磁细菌的分布状况 发现大量的趋磁细菌都分 布在3 5 4 7 米深的好氧和厌氧过渡区 o x i c a n o x i ct r a n s i t i o nz o n e 分布在5 5 米以上区域 的趋磁细菌以合成f e 3 0 4 为主 分布在5 5 米以下区域的趋磁细菌以合成f e 3 s 4 为主 3 趋磁细菌的分类及系统进化 趋磁细菌是一些生物学特性各不相同的细菌的总称 从不同区域的富集样品中都能找 到不同形态的趋磁细菌 图 目前已得到纯培养的趋磁细菌有趋磁球菌 m c 趋磁弧菌 m a g n e t i cv i b r i om v l m v 2 m v 4 和趋磁螺菌 m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s em s m l m a g n e t o s p i r i l l u r as p a m b l m a g n e t o s p i r i l l u m s p m g t 一1 等 由于趋磁细菌对营养的苛刻要求及微好氧 厌氧等特性的存在 导致分离纯化趋磁细 菌十分困难 因而对趋磁细菌的分类也只是对少数已分离纯化的菌株进行分类地位的确定 对部分未纯化的趋磁细菌进行1 6 s r d n a 或1 6 s r r n a 的序列分析以确定它们的系统进化位 置 图2 在新版的伯杰氏系统细菌学手册中趋磁细苗被分别纳入m a g n e t o s p i r i l l u m 和 7 m a g n e t o b a e t e r i u m 属中 其中m a g n e t o s p i r i l l u m 属有两个种m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u m 和m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a m e n s e m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s e 为该属的模式 种 m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b 1 m g t 1 等磁螺菌菌株都被纳入该属之中 s c h u l e r 等 1 9 9 9 利用毛细管法分离得到了m s m 1 m s m 一3 m s m 4 m s m 一6 m s m 7 m s m 一8 m s m 9 等7 个趋磁螺菌菌株 并比较它们与m a g n e t o s p i r i l l u mm a g n e t o t a c t i c u m 和 m a g n e t o s p i r i l l u mg r y p h i s w a l d e n s e 的 6 s r r n a 的相似性 发现m s m 3 和m s m 4 与 a z m a g n e t o t a e t i c u m 和mg r y p h i s w a l d e n s e 的相似值低于9 7 5 因而有可能属于该属中的 新种 d e l o n g 等 1 9 9 3 x f f 趋磁细菌1 6 s r r n a 序列的小亚基单位的系统进化进行了分析 发现 合成f e 3 0 4 类型的趋磁细菌同变形菌门的甜亚门亲缘关系近 而产生f e 3 s 类型的未纯培养 趋磁细菌则与变形菌门6 亚门的硫酸盐还原细菌亲缘关系近 这表明合成f e s 0 4 型和f e 3 s 4 型的趋磁细菌是各自独立进化的 图1 不同形态的趋磁细菌 s c h u l e r d 1 9 9 9 8 图2 趋磁细菌的系统进化位置圈 s 州n 舀s a n ds c h l e i f c r kh 1 9 9 5 4 趋磁细菌的生理生化特性研究 虽然趋磁细菌的分离难度较大 但在近二十年中 由于分离技术的不断改进 仍然得 到了mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 mg r y p h i s w a l d e n s em s r i m a g n e t o s p i r i l l u ms pa m b 1 m g t 1 m s m i 3 4 6 7 8 9 m a g n e t o c o c c u s m c o l m a g n e t i c v i b r i o m v 一1 2 4 9 趋磁细菌w d 1 h m t 1 等多株趋磁细菌 研究的较为深入的为 tm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 m a g n e t o s p i r i l l u ms p a m b l 及mg r y p h i s w a l d e n s em s r 1 三个菌株 到目前为止几乎所有 的生理生化特性的研究都是以它们为对象而进行的 现就部分菌株的生理生化特性介绍如 下 4 1 矩m a g n e t o t a c t i c u mm s i 的生理生亿特性 第一株趋磁细菌是b l a k e m o r e 等于1 9 7 9 年在化学合成培养基平板中加入过氧化氢酶而 分离得到的趋磁磁螺菌 mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 在其后的几十年中有关趋磁细菌的深入 研究大多是以该菌株为材料进行的 m m a g n e t o t a c t i c w nm s 1 的菌体为螺旋状 其大小随不同的培养条件而变化 b l a k e m o r e r p e t a l 1 9 7 9 一般长4 6um 宽0 2 5 um 1 3 菌体两端各有一根鞭毛 在磁场作用下靠鞭毛迅速运动 该菌的超微结构比较清楚 细胞膜由三层组成 每个细胞 的膜内侧分布有一条约由2 0 个磁性颗粒 单磁轴方向排列的磁性颗粒链 磁性颗粒的成分 为f e 3 0 4 形状为平截六棱柱形 i v l a t s u d a t e ta 1 9 8 3 大小在2 5 n m 一5 0 n m 之间 其中6 0 的在3 9 n m 4 9 n m 之间 平均大小为4 2 r i m 每个颗粒之间相距3 n m 一1 8 n m b a l k w i l l 等 1 9 8 0 还报道了磁性颗粒由磷脂双分子层脂膜包被的现象 经g o r b y 等 1 9 8 8 深入研究表明这种 双分子层脂膜由三层构成 将其区分为外膜 内膜和中膜 化学分析这些膜发现它们由混 有蛋白质的磷脂双分予层组成 脂类包括三个部分 中性脂类及游离脂肪酸 糖脂及硫脂 磷酸脂 它们在总脂中所占重量百分比分别为8 3 0 6 2 其中磷酸脂的主要成分是 磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺 在包被磁性颗粒的膜中发现了两种其它生物膜中不存在的 可溶性蛋白 分子量分别为1 5 5 0 0 d a 和1 6 5 0 0 d a 利用浮力密度法和热变性温度法对m m a g n e t o t a c t i c u mm s 1 和它的无趋磁性突变株 n m i a 和n m 1 b 进行g c m 0 1 含量分析 0 3 l a k e m o r e r p e t a l 1 9 7 9 结果表明两者均为 说明磁性颗粒的消失并不涉及到核 内总d n a 含量的变化 元素分析发现mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 的细胞由p k s f e 等 大量元素组成 其中p k s 等元素的含量与其它细菌没有多大差别 但铁的含量是一般 海洋细菌的1 0 0 倍左右 即使不含磁性颗粒的突变株的铁含量也是一般海洋细菌的1 0 倍 在研究不同碳源对mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 生长影响时发现 该菌仅能较好地利用琥 珀酸 延胡索酸 酒石酸 苹果酸等进行生长 而其它一些物质如葡萄糖等不是使其生长 缓慢就是抑制其生长 l a k e m o r e r 只甜烈 1 9 7 9 该菌能较好地利用硝酸盐和铵盐作n 源 生长 以反硝化的方式代谢硝酸盐 b a z y l i n s k i d a e ta l 1 9 8 3 y a m a z a k i 等 1 9 9 5 在微好 氧脱氮培养条件下分离纯化了硝酸盐还原酶 并定名为细胞色素e d l 硝酸盐还原酶 该酶 1 0 的氧化态在6 4 3 n m 和4 0 9 n m 处有最大吸收峰 还原态在6 6 3 5 5 1 5 2 2 4 1 8 r i m 处有最大 吸收峰 其由两个分子量为5 4 k d a 的亚单位组成 每个亚单位含有一个c 型和d 1 型血红 素分子 等电点为9 2 估计的血红素c 和d l 的氧化还原电势分别为 1 9 1 m v 和 1 8 0 m v 同时 该菌还能固氨生长 b a z y l i n s k i 等 1 9 8 3 的研究结果表明mm a g n e l o t a c t i c u mm s 一1 及其无趋磁性突变株n m i a n m 1 b 等都能还原乙炔成为乙烯 它们的这种还原能力略 高于a z o s p i r i l l u r al i p o f e r u m 略低于 4 z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i b a z y l i n s k i 等 2 0 0 0 利用s o u t h e r n 杂交证明m a g n e t o s p i r i l l u m 属的三个菌株确实存在固氨酶的结构基因 喹尼酸铁是维持m m a g n e t o t a e t i c u mm s 1 产生磁性颗粒的必要条件0 3 l a k e m o r e r p e la 1 1 9 7 9 用其它铁盐 代替喹尼酸铁时细胞均无趋磁性 但细胞的生长量不变 b l a k e m o r e 等 1 9 8 5 指出其形成磁 性颗粒的最适氧分压为0 5 1 k p a 好氧及完全厌氧条件下都不形成磁性颗粒 他们认为磁 性颗粒的形成必须要有分子态的氧存在 并推测痕量的分子态氧是呼吸链和生成f e 如4 的 共同竞争物 分类特征的研究表明mm a g n e t o t a c t i e u mm s 一1 不具有过氧化氢酶及氧化酶活 性 m a r a t e a d e t a l 1 9 8 1 p a o l e t t i 等 1 9 8 8 报道了mm a g n e t o t a c t i c u mm s 1 和它的没有趋磁性的突变株n m i a 的细胞抽提物都具有铁还原酶活性 n o g u c h i 等 1 9 9 9 从该菌中分离纯化了铁还原酶 该酶 松散地结合在细胞质膜的内表面 有趋磁性的细胞的结合频率高于没有趋磁性的细胞的结 合频率 该酶的分子量为3 6 k d a 以单体形式存在 n 端序列为s e r a l a s e r t h r p r o a l a p h e a r g g l y l y s l i e 1 y r a s p s e r l l e i l e t h r l l e g l y a l a t h r l e u v a l 该酶需要n a d h 和 f m n 作为电子供体和辅因子 反应最适p h 7 0 其活性被z n 2 抑制 当培养基中含有7 5 pm o l l 的z n s 0 4 时细胞所合成的磁性颗粒数量明显减少 细胞内可溶部分的铁还原酶活 性随z n 浓度升高而降低 o b r i e n 等 1 9 8 7 采用