（植物学专业论文）中国菱属植物种质的dna分子鉴别及铈对镉毒害的缓解研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑t 声明 l 璧持以 求实 创新 的科学精神从事研究工作 8 4 2 6 7 5 2 奉论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果 3 奉论文中除引文外 所有实验 数据和有关材料均是真实的 t 车论文中除引文和致谢的内容外 不包含其他人或其它机构已经发表 曩曩写过的研究成果 5 其他同志对本研究所傲的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意 作者签名 日期 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留 使用学位论文的规定 学校有权保 留学位论文并向田家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版 有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅 有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版 保密的学位论文在解密后适用本规定 一名 聋 灞瑜 作者签名 乏 灞互l 衔 日期 吐 f 中文摘要 中国菱属植物种质的d n a 分子鉴别及 铈对镉毒害的缓解研究 摘要 菱属 t r a p al 植物是我国原产的水生植物 早在新石器时代的河姆渡遗址就 曾掘出过菱实 距今约有7 0 0 0 多年的栽培历史 菱果实鲜嫩可口 茎 叶 果实还可 以入药 据 本草纲目 记载 菱具有 安中补脏 养神强志 耳聪目明 轻身耐 老 等功效 本文运用r d n ai t s 区序列对中国菱属的不同类群进行了鉴别 并对菱 属植物间的亲缘关系进行了探讨 为进一步评价菱的种质和系统进化提供d n a 分子证 据 以重金属镉为污染源 稀土元素铈为缓解因子 对镉胁迫下菱毒害反应以及铈的 缓解作用进行了研究 试图为菱应用于水体污染治理提供依据 通过改良总d n a 提取的c t a b 法及优化i t s 区序列p c r 扩增的反应条件 本文共 测定了中国菱属1 1 个种类的r d n ai t s 区序列 并率先向g e n b a n k 递交了该序列 实 验表明 鸟菱 二角菱 四角菱以及南湖菱等为栽培品种 品种之间的差异很小 1 2 野菱 耳菱 冠菱 格菱 细果野菱等为野生类居群 与栽培类菱鉴别的 碱基位点有3 个 分别在1 7 2 0 1 和6 0 6 号碱基位上 各类群间的特异性鉴别位共有 1 7 处 菱i t s 区序列数据库的建立对其各类群的鉴定有着重要意义 通过分析菱的 i t s 区序列 菱属植物可能起源于同一种野生类群 中国菱属植物的多样性均为种内 差别 此外 基于叶绿体基因组的r b c l 序列 菱科与千屈菜科的亲缘关系更近些 与柳叶菜科的亲缘关系则稍远 菱是水体净化中浮水植物的优良物种 在环境污染治理中能发挥重要作用 用单 稀土元素铈处理菱发现 在低浓度o 5 m g lc e 处理范围内 菱长势良好 s o d p o d 保护酶活性被激起 体内抗胁迫能力比较强 而当浓度超过5 m g l 后 c e 对菱的作 用就类似重金属的毒害作用 菱的生长也被抑制 铈对菱的作用存在低促高抑的剂量 效应 此外 用5 m g lc e 处理受镉胁迫的菱时 发现一定浓度的铈可以缓解菱的镉 毒害 c e 能有效的激起体内的保护酶系统参与活性氧等自由基的清除 降低膜脂过 氧化水平 减轻镉毒害对膜的损伤 使植株的抗胁迫能力增强 电镜的组化定位可以 在菱叶细胞的泡状体中发现沉淀的镉颗粒 且大部分镉分布在膜内侧 少部分以游离 形式存在 菱叶细胞的铺解毒过程是通过泡状体的区域化隔离作用达到的 关键词t 菱属 d 眦分子鉴别 系统发育 重金属污染 稀土缓解 英文摘要 r e s e a r c ho nm o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o no f t r a p a li nc h i n a a n dm e c h a n i s mo fa n t i t o x i c a t i o no fc a d m i u mb yc e r i u m a b s t r a c t t r a p a l w h o s ef r a i tw a se x c a v a t e do nt h eh e m us i t ee a r l yi nn e o l i t ee r aw h o s e c u l t i v a t i n gh i s t o r yc o v e r e d a tl e a s t7 0 0 0y e a r s i so n eo f i m p o r t a n td o m e s t i ca q u a t i c p l a n t s b e s i d e si t s d e l i c i o u sf r u i t n e a r l ya t lp a r t so ft r a p al i n c l u d i n gs t e m l e a r a n df r u i tc o u l db eu s e df o ro 蚯c i n a tf u n c t i o n r e c o r d e db y c o m p e n d i u mo f m a t e r i a m e d i c a t r a p al h a si t sr e m e d yf u n c t i o no ns e c u r i n gi n n a r d s r e p o s i n g h e a r i n g a n ds e e i n gw e l l l i g h t e n i n gb o d ya n do l d d e f e n d e d h e r e w ew i l la s s e s si d i o p l a s m a n ds y s t e m a t i ce v o l u t i o no ft r a p ab ya n a t y z i n gi t sr d n ai t ss e q u e n c e sa n d i n v e s t i g a t ei t s m e c h a n i s mo fa n t i t o x i c a t i o no fh e a v ym e t a lb yu s i n gr a r ee a r t h e l e m e n t c e r i u mw i t ht h ea i mo f o f f e r i n g a c a d e m i cf o u n d a t i o nf o r f a t h e r i n g e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o no f t r a p a l i t s s e q u e n c e i sag o o dm o l e c u l a rm a r k e ro fa u t h e n t i c a t i n gt h ed i f i e r e n t v a r i e t i e si nt r a p al i t ss e q u e n c e so f1 l s p e c i e si nc h i n aw e r ed e t e r m i n e db y m o d i f l e dm e t h o do fc z a bf o rd n a e x t m c t i n ga n dp c r f o ri t sa m p i f y i n g a n d r e s u l t ss h o w e d i n t r a s p e c i f i cs u b s t i t u t i o nd i v e r s i t yv a r i e dw e ea m o n gc u l t i v a r so f t a c o r n i sn a k a n o tb i s p i n o s ab o x b zb i c o r n i so s b e c k 1 e s st h a n1 2 t h r e e a u t h e n t i c a b l eg e n e t i cs i t e sb e t w e e nw i l da n dc u l t i v a r sw e r el o c a t e da t1 7 2 0 1a n d 6 0 6 t h eo f f g i no ft r a p al m i g h tb ed e r i v e df r o mo n ew i l ds p e c i e sb ya n a l y z i n g i t ss e q u e n c e s w h i c hw o u l db ea n o t h e re v i d e n c ef o rt h ec o n t r o v e r s i a t 也e m ef o r a c a d e m y t h ev a r i e t ya m o n gt r a p ali n c h i r l ai s i n t r a s p e c i f i c c o m p a r e dw i t h o n a g r a r i c e a e t m p a c e a eh a sm o r 七c l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pw i t hl y t h r a c e a eb a s e d o nr b c ls e q u e n c e s t r a p a 三 i sa l s oaf l u ee n v i r o u m e n t a lf r i e n d l ys a n c t i f i e r c e r i h i t ii sh a n d l e dt o t r a p aw i t ht h ef o l l o w i n gr e s u l t s l o wc o n c e n 打a f i o no fc e 3 f o 5 m e t e lc o u l de x c i t e s o da n dp o d w h i c he n h a n c e dt h ea b i l i t ya g a i n s tm e n a c e a n db o o s tt h eg r o w t ho f t r a p a 珊l e nh i g hc o n c e n t r a t i o no f c e w a st r e a t e d t h eg r o w t ho ft r a p alw a s r e s t r a i n e da sh e a v ym e t a ld i d a d d i n g5 m g lc e c o u l dr e l i e v et h et o x i c a t i o no f c a d m i u mt o t r a p a 1 1 他p h o t o s y n t h e t i cs y s t e m s p r o t e c t i v ee n z y m es y s t e m sw e r e s u b s e q u e n t l yg e n e r a t e dt op r o t e c tm e m b r a n es y s t e ma n de l i m i n a t ef r e ei n d i c a t1 i k e 0 2 h 2 0 2 d e p o s i to fh e a v ym 武j t lw a sf o u n di n v a c u o l a rb o d i e s b ym e a n so f e l e c t r o nm i c r o s c o p i ch i s t o c h e m i s t r yw i t hm o s tg r a i n sa t t a c h e dt i g h t l yb yi n n e rs i d e o fm e m b r a n ea n dp a r t i a l l ys c a t t e r e di nt h ec y t o p l a s t i ti n d i c a t e dt h a tt h ep r o c e d u r e f o rt r a p at od e t o x i c a t ec a d m i u mi st op h a g o c y t i z et h ei o ni n t ot h ev a c u o l a rb o d i c s k e yw o r d s t r a p al m o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o n p h y l o g e n e t i cd e v e l o p m e n t h e a v y m e t a l p o l l u t i o n r e l i e fo f r a r ee a r t he l e m e n t 5 第一章文献综述 第一章文献综述 第一节菱属植物的系统进化学 药学研究进展 1 1 菱属植物的系统与进化学研究 菱属 y r a p al 植物为一类单属科植物 为一年生浮水或半挺水草本 1 主要分布于欧亚及非洲热带 亚热带和温带地区 北美和澳大利亚有弓1 种栽 培 但以我国品种最多 分布也最广泛 主要集中于东部和中部地区 新石 器时代的河姆渡遗址就曾掘出过菱实 距今约有7 0 0 0 多年历史 据生物学家 推断 早在l 万多年前 菱就生活在我国南方的湖泊中了 由于菱属植物形 态变异幅度较大 划分种类所依据的主要性状不稳定 至今还没有人做过世 界性的系统学研究 世界上到底有多少种菱以及它们的系统学发育关系还是 一个有争议的话题 世界水生植物 记载的菱属有 l 多型种或3 0 种 可 见菱属植物的系统进化还在探索之中 历史上各学者对菱科的分类归属曾有不同的看法 林奈于1 7 5 3 年建立菱 属 7 r a p a 后来研究者g b e n t h a m 和j 0 h o o k e r 把菱属归于柳叶 菜科 o n a g r a r i c e a e 这主要是由于他们看到菱属与水龙属 t u s s i a e a 在某些特征上相似 但他们明确指出菱属在柳叶菜科中的独特性 随着解剖 学 胚胎学 孢粉学 形态及化学等方面证据的积累 把菱属从柳叶菜科分 出另立一科的建议逐步为全世界的植物学家们所接受 由于菱属植物子房2 室 每室1 胚珠 果为坚果状之差异 所以之后不少学者把它独立归为一科 科名t r a p a c e a e 一直沿用至今 关于菱科檀物的演化 m i k i 认为菱科植物 最早是由千屈菜科 l y t h r a c e a e 逐步演化而来的 从形态学特征上 它们 是有一定亲缘关系的 但从地史年代 习性 形态特征 菱科植物应较千屈 菜科进化 而柳叶菜科花四基数 子房下位 胚胎多数 陆生等特征不同于 菱科 而在某些方面有较菱科进化 1 各国学者应用形态学 解剖学 孢粉学 细胞学等传统分类学方法对菱 属植物做了大量的研究工作 但对菱属的分类有不同的看法 t u t i n 等将欧洲 1 3 种菱归并成1 种 k a k 认为全世界约有3 0 种 而c o o k 则认为全世界菱属 植物是一多形种或约3 0 种 国内学者丁炳扬把国产菱属的3 7 个居群划分成 细果野菱和野菱两个种 栽培类型不能做为种一级处理 最新版的 中国植 物志 则把我国的菱归为1 5 个种和1 1 个变种 可见 对菱种间和种内的分 类研究一直没有一个统一的界定 1 2 菱属植物的生药学研究 第一章文献综述 菱的果实性凉味甘 除可以食用外 其果肉 果壳等还具有药效功能 从古至今 菱角在医疗保健方面应用甚广 据 本草纲目 载 菱具有药用 价值 可 安中补脏 养神强志 耳聪耳明 轻身耐老 中国民间药 和 中药大辞典 上均介绍菱实的醇提物有抗肿瘤作用 菱药用有清暑解热 除烦止渴 健脾益气的功效 果壳能止泻痢 止便血 还可提取鞣料 菱叶 用于少儿走马疳 小儿头疮 并能增强儿童视力 茎及菱蒂药用 可治胃溃 疡 多发性疣赘 日本民间药方是每日用生菱2 0 至3 0 个 加水用微火煮成 浓褐色汤 分2 至3 次饮用 可治胃癌和子宫癌 国外学者对菱的药理药效曾进行过研究 y o s h i a k i 从菱食中分离提取了 三种类型的二苯并一n 一毗喃酮 并发现3 号位上有羟基基团的抗氧化能力较 强 日本学者k o s u g et 曾研究了二角菱菱实 t r a p ab f s p f n o s ar o x b 活性 成分m 并分析了有效成分对海拉细胞的毒性及其抗肿瘤作用 1 菱的果实含 有一种叫a h 十三的抗癌物质 专家们试验证实 a h 十三对小鼠腹水 型癌细胞的变性和组织增生有明显的抑制作用 日本东京医科大学还指出 菱角 尤以四菱角 的热水浸出物 对小鼠肉瘤的抑制率高达6 0 由于菱角抗 癌效果显著 医学家们便用它制作了许多食疗品用于癌症的辅助治疗 如 鲜菱汁 菱蜜茶 菱粉粥 在国内 赵泽贞用抗突变和致突变同步快速实验法对2 2 种可食性中药进 行筛选 发现菱实的化学成分对丝裂霉素c 有间接抗突变性作用w 牛凤兰发 现二角菱 fb f s p i n o s a o x b 菱壳的水提物对胃癌细胞具有抑制作用 并 对东北菱 f r a p am a n s h u r i c a 仃e i 中的氨基酸和无机元素含量进行了分 析 发现东北菱中含有8 种人体必须氨基酸 h e l y s t r o l e u t h r v a l m e t c y s p h e t y r 人体必须微量元素f e z n m n c a p 含量较高 其 中f e c u z n 的含量比参类 人参类 西洋参 人参三七 的含量高 此 外 他们还从菱中提取出了黄酮类化合物n 进一步证明了菱作为一种具有保 健作用的功能食品非常有开发价值n 随着菱药理 药效研究的不断进展 菱的道地性也必然会受到人们的关 注 不同居群 不同品种的菱之间存在怎样的联系以及它们药理特性的区别 都是今后值得学者们研究的领域 我们希望通过寻找一种合适的d n a 分子标 记 来建立一套国内菱属植物的分子鉴别系统 第二节菱的重金属污染毒害研究 由于菱是重要的水生经济作物 它的果实可以直接被食用 因此 水体 质量的好坏不光会影响菱的正常生长 而且还间接地关系着人们的健康 r a i u p e n d r an 等测定了金属元素p b c r 等在菱中的分布 发现重金属主要存在 第一章文献综述 菱叶中 而菱果实的重金属含量可以通过蒸煮而减少或去除 1 关于重金属对 菱的毒害作用 学者们己做了比较全面的研究 植物在生长发育过程中受重 金属毒害会导致叶绿素含量下降 光合作用和呼吸作用减弱 膜的完整性被 破坏 膜脂氧化产生的丙二醛 m d a 含量 活性氧 r o s 产生速率增加 膜透性及h o 也随浓度的增加而增加 在重金属毒害下 保护酶系统 超氧 化物歧化酶 s o d 过氧化物酶 p o d 和过氧化氢酶 c a t 发挥着重要作 用以清除体内的活性氧和自由基u 前人研究了cd 2 毒害引起菱的细胞结构变 化情况和叶片形态上的受害特征 1 当大于一定浓度的c d 大于1 0 m o l l 作用于菱叶后 时细胞核的核质消失 但核膜保持完整 叶绿体基粒 数目减少 基粒片层解体 叶绿体双层膜断裂 通过 而当浓度过高时 5 0 i i m o l l 和1 0 0 i tm o l lc d 2 细胞则变形 溶解 组织松散 解体 栅栏组织 和海绵组织均遭到破坏 此外 学者们还研究了汞 镉对菱毒害的生理影响 研究表明cd 2 处理最初诱导s o d s u p e r o x i d ed i s mu t a s e p o d p e r ox i d a s e 活性升高 但随浓度加大时间延长酶活性急剧下降 c 矿处理菱幼苗的3 5 d 均引起s o d 活性升高 到第9 d s o d 活性下降 1 5um o l l 和2 0um o l l c d 处理的则测不到活性 p o d 活性的变化与s o d 的相似 c d 处理的开始时 p o d 活性升高 但降低也很快 而5um o l l 和1 0um o l lh g 处理的p o d 持续上 升 其它梯度相对缓慢下降 c d 的毒性比h 9 2 要大 还有人用不同紫外光 u v 照射菱 发现不同于浮萍和水花生 菱c a t c a t a1 a s e 的活性被抑制 认为 菱的耐污性比较弱nn 日本一学者通过5 种水生植物一凤眼莲 菱 芦苇 印i r o d e l ap o l 脚j 雀稗的水体净化能力比较 发现秋冬季节 1 0 1 2 月 的菱比其他四种植物的净化能力要差n 不同的植物对重金属的耐受机理不同 概括下来包括以下几个方面 2 3 l 排斥作用 即重金属在植物体内的运输受到阻碍 被植物吸收后又被排除体 外 2 区域化作用 即重金属在植物的特定部位积累 从而与细胞中其它组 分隔离 达到解毒的效果 比如 庭芥属的a s e r p y l f f f o l f u m 当用n i 处理 时 7 2 的n i 分布在液泡中 弋而b r a s s i c aj u n c e a 中 大量镉贮存在叶 片表皮毛中 还有一些重金属可以结合到植物细胞壁上 3 重金属与植物 体内部物质的络合作用 包括重金属与无机物的络合 形成硫化物 另外还 可以通过有机物的螯合使重金属在液泡中聚集 目前很少对菱的区域化解毒 机理的研究还很少 用外源稀土元素来提高植物对不良环境的抗性 防止植物逆境胁迫所产 生的不良反应 近年来受到越来越多科学家的重视 并已有不少的报道 研 究证实 稀土元素不属于植物的营养元素 合理施用稀土促使农作物增产及 优质的原因主要是稀土属于植物生理活性物质 具有调节植物体内生理活动 第一章文献综述 的功能 能促进农作物对氮 磷 钾等养分的吸收 增加植物的叶绿体含量 提高光合作用强度 促进酶活性 特别是磷酸酶的活性 1 适当的稀土浓度 可促进种子萌发等 由于稀土残留小 是一种值得推广的重要的植物生长调 节剂 试验证明c e 可增加水稻种子萌发期间生长素 赤霉素和细胞分裂素的 含量 因此 c e 促进老化种子的发芽可能也与这些植物生长激素的增加有关 此外 c e 处理后使水稻老化种子在萌发过程中s o d c a t p o d 活性得到了明显 的提高n 降低了0 一的产生速率n 进而又减轻了膜脂的过氧化作用 维 护了膜的稳定性及完整性 使得种子发芽率和活力提高n 对于小麦幼苗重金 属镉伤害的防护 铈能阻碍c d 与细胞膜吸收位点的结合 从而抑制根系对c d 的吸收一 稀土喷施甘蔗 可以促进叶片脯氨酸的积累 电导率降低 过氧化 物酶 p o x 和中性转化酶活性提高 这些变化保证了甘蔗在干旱时细胞中的 水分 稳定膜的结构n 王雪峰在研究铈对猪胰a 一淀粉酶活性影响时 发现 c e 在低浓度下部分提高a 一淀粉酶活性和激活脱钙n 一淀粉酶 是因为c e 占 据了c a 的结合位点 保证了酶催化所必需的活性构象 而在高浓度下抑制酶 活性 则可能因酶蛋白空间构象进一步发生变化 改变了活性部位的疏水区 所致n 王金盛等研究了铈离子清除超氧物自由基的机理 探讨了铈离子清除 0 2 一的机理为 c e 02 一 2 1 1 一c e h 0 2 c e 02 一一c e 02 至于稀土 元素低浓度促进生长 而高浓度抑制生长的机制仍然需要进一步研究o 有 关植物稀土元素的作用机理值得深入研究 第三节r d n ai t s 区在药用植物分子鉴别中的应用 近年来 应用核d n a 序列在较低分类阶元上探讨被子植物的发育已成为 一大热点 这段基因组区就是1 8 s 一2 6 s 核核糖体d n a n r d n a 的内转录闻隔 i t s 区 3 通过r d n a i t s 区所构建的系统树能克服以往用c p d n a 叶绿 体基因组d n a 系统树的分辨率低 谱系筛选造成的冲突等不足之处 以及 i t s 区本身具有进化速率快 不存在母系单向遗传 因此更能反映种间差别和 物种进化 故用i t s l 和i t s 2 对植物科内 属内 种间的分子系统演化及物 种鉴别进行研究已成为各学者的关注点 3 1r d n ai t s 区潜在的系统发育信息 i t s 区包括三部分 在进化上高度保守的5 8 s 亚基以及倍受人们关注两 个间隔区 i t s l 和i t s 2 总长度为6 0 0 7 0 0 b p 其中5 8 sr d n a 的长度非 常保守 一般为1 6 3 b p 或1 6 4 b p n 菱属植物的i t s 区5 8 s 长为1 6 4 b p 而 且它的序列也很保守 有些类群中根本无交异 s a n ge a t 9 9 5 在另 第一章文献综述 一些类群中也只有卜6 个变异位点 k o l l i p a r ae ta j 1 9 9 7 h s i a o e fa 1 9 9 4 因此5 8 sr d n a 提供的系统学信息有限 在研究中的意义不大 张文 驹 1 9 9 8 a n i o u c h e b a y e r 1 9 9 7 i t s l 和i t s 2 的长度也比较保守 但是丰富的核苷酸序列的变化 可以 提供丰富的系统学信息 被子植物i t s i 的长度为1 8 7 2 9 8b p i t s 2 的长度 为1 8 7 2 5 2b p 不同的类群 i t s l 和i t s 2 的相对长度有较大的变化 一般 在科间和科内都是有变化的 而在较高分类阶元上似乎没有太大的系统学意 义 在一些类群中 a s t e r a c e a d 2 e a t v a c e a d o n a g r a c e a d 1 p o e m o m a c p a 一 肘门t e r a o e a e 等 i t s l 要长于i t s 2 少数相等 相反 在b e t u i a c e a e c u c u r b f t a c e a e s c r op h u i a r i a c e a e 和玎s c 3 c o a e 中i t s 2 长于i t s l i t s i 比i t s 2 长或短是因属 种而异 在被调查的大部分被子植物类群中 i t s l 成 对 两两比较 趋异值和i t s 2 大体上是相似的 在系统发育分析中 i t s l 和i t s 2 中具有潜在信息位点占全序列位点的 百分率之间变异的分布和根据趋异值的估计是近似的 由于i t s l 和i t s 2 两 套资料具有互补性 根据两套资料得到的系统树比根据其中任何一个间隔序 列资料得到的系统树分辨率高 因此 通常将i t s l 和i t s 2 资料结合起来对 植物进行系统发育分析 在大多数被研究过的被子植物中 i t s 的g c 总含量 变异幅度很大 3 6 一7 5 g c 含量过高或过低说明置换概率具有倾向性 这样的序列和那些置换率较平均的序列相比同塑性的可检测性有所降低 在 测序反应中会有一些困难 和大多数编码序列相比 i t s 的排序会由于插入 缺失 i n d e l 而变得复 杂 不管如何排序 插入 缺失的发生应当看作是机会而不是不利的 如何记 录插入 缺失区内的性状状态来最大限度地获取系统发育信患 学者们给出了 些实例的帮助 s w o f f o r d o l s e n1 9 9 0 b r u n se ta l 1 9 9 2 例如 由插 入 缺失造成的空位可以被处理为缺如或第五性状状态 或是将插入 缺失看 成一种有 无性状 此时空位被处理为无 最后一种选择就是不管对插入 缺 失如何处理 假设插入 缺失具有潜在的系统发育信息 3 2r d n ai t s 区序歹i 在药用植物道地性种质鉴别中的应用 传统的中药鉴定采用的主要是性状鉴定 显微鉴定及理化鉴定等方法 这些方法的鉴定标识在生物学上均为物种的遗传表现型 不仅受到遗传因素 的影响 而且与生物体的生长发育阶段 环境条件 人类活动如引种驯化 加工炮制等有着密切的关系 具有很大的变异性及可塑性 难免存在主观性 强 重复性和稳定性差等缺点 因此限制了其应用与发展 因此 鉴定药材 的道地性已日显紧迫 所谓 道地药材 即指历史悠久 产地适宜 品质优 第一章文献综述 良 疗效突出的药材 我国幅原辽阔 北起兴安岭 南至五指山 东抵东海 之滨 西达喀拉昆仑 地跨温带 亚热带 热带及高寒地区等不同气候带 地貌复杂 有平原沃土 高山丘陵 江河湖海 从而构成了各种不同的水土 气候 日照 生物分布的生态坏境 为多种药用植物的生长提供了有利的条 件 加上在漫长的生产过程中形成了比较成熟的栽培技术和采集方法 以及 药物品种经过不断地择优选择 使许多优秀名贵药材的生产 无论从品种 产量 质量上都有一定的区域性 最终形成了不少带有产地气候土壤特征的 道地药材 如吉林的人参 鹿茸 辽引的细辛 五味子 内蒙的甘草 黄 芪 河北的枣仁 山西的党参 山东的阿胶 江苏的薄荷 安徽的滁菊 福 建的泽泻 广东的砂仁 广西的蛤蚧 四川的黄连 芎劳 云南的三七 茯 苓 青海的大黄 甘肃的当归等等 形成了我国药学宝库杂红中的一颗棵璀 璨的明珠 近年来 随着分子生物学和基因工程技术日趋成熟 从遗传物质d n a 分 子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能 现有d n a 序列测 定 限制性内切酶片段长度多态技术 r f l p 随机扩增多态性d n a r a p d 任意引物p c r a p p c r 等分子遗传标记技术运用在中药材生药品种的鉴定 选择合适的d n a 区域进行序列测定是植物类生药鉴定的极其准确 可靠的手 段 关于这一方面的研究有 w e n 等对人参属1 2 种植物的i t s 区进行了序列 分析 结果表明美洲东北部2 个西洋参p a n a xq u i n q u e f l i u s 与三叶人参p t r i f o l i u s 中 西洋参与东亚人参 竹节参 三七具有更近的亲缘关系 葛 颂等用n r d n ai t s 序列探讨了裂叶沙参的系统位置并讨论了i t s 片段在沙参 属系统学研究中的价值n 丁小余等用r d n ai t s 区序列探讨了药用植物石斛 属在系统学研究中的价值 并采用位点特异性p c r 法来鉴别易被混淆的石斛 品种n 6 曾明等通过比较中药葛根及其近缘种的r d n ai t s 序列 认为粉葛 作为野葛的变种 山葛则独立成种 进一步证明i t s 是鉴别近缘种的理想分 子标记n 周联等用i t s 全序列鉴别了各地阳春砂及常见伪品 且发现与r a p d 相比 测定i t s 序列要更加灵敏 蔡金娜等对不同居群蛇床的r d n ai t s 序 列进行了分析 认为r d n ai t s 序列能有效地鉴别蛇床的主要居群 d n a 分子遗传标记能对微量或高度降截的d n a 样品进行分析 对干燥 变 形 变质的生药样品甚至动植物的化石进行有效地鉴定 因此 充分利用有 限的中医药古迹实物 采用包括品种延续 变迁及其规律和实质 是今后本 草考证的重要方向 随着分子生物学的发展 还将有新的分子标记技术不断 问世 第四节r d n ai t s 区序列在植物系统发育研究中的应用 第 章文献综述 植物系统与进化的研究随着分子生物学技术的发展而不断得到丰富的研 究资料 这为解决系统发育 物种形成与进化等方面的难题提供了强有力的 技术途径 在前些年的研究中 除了涉及 d n a 核5 s 1 8 s 2 6 sr d n a 线 粒体d n a 等之外 主要是叶绿体d n a c p d n a 的酶切位点和序列变异 由于c p d n a 的进化速率较慢 尤其是r b c l 基因 编码l 5 一二磷酸核酮糖羧化酶 氧化酶 大亚基 的保守性极强 碱基的置换速率很慢有报道称每百万年只有o 5 0 6 个碱基发生突变 因此常被用于较高分类阶元如科 属的系统发育分析 但对于低级分类阶元的分析 尤其是对于关系非常密切的分类群 c p d n a 就无 能为力了 在这个方面核核糖体d n ai t s 区则显示出它的优势 i t s 区序列被 用于较低阶元如植物种间和部分属间的分子系统学研究是基于以下三点的有 利特性 第一 在n r d n a 多基因家族的成员中 i t s 区在植物基因组中是高度 重复的 这样多的拷贝数有利于发现 扩增 克隆和测序 第二 从系统发 育重建的观点出发 最重要的是这一基因家族通过不等交换和基因转变经历 快速的一致进化 这种特性促成重复单位在基因组内的一致性 可促成根据 这些序列对种问关系所进行的精确重建 由此降低了系统发育研究中居群内 取样的重复性 第三 i t s 区序列短 在被子植物中 千屈菜科 柳叶菜科 这与形态学上的证据相同 从而从分子的角度又给予了有利的证实 通过菱的1 2 个居群 我们构建了邻接树 1 2 个居群的菱被聚为三大类 第 一聚类是包括东北菱 联城野菱 乌菱 二角菱 四角菱和南湖菱 第二聚类包 括格菱 细果野菱 格菱 冠菱和耳菱 这两大类聚类后再与弓角菱相聚 弓角 菱与第二类的遗传距离比较近 所测菱属植物野生居群可以形成一相对稳定的分 支 野生居群首先聚为一类 然后是栽培类 因此 把栽培类作为野生屠群的变 种比较合理 国外学者t u t ir l 就把将欧洲1 3 种菱归并一种 而国内学者丁炳扬 把国产菱属的3 7 个居群划分成细果野菱和野菱两个种 栽培类型不做种一级处 理 中国植物志 又把我国的菱归为1 5 个种和1 1 个变种 由于菱属植物依据的 形态特征多有重叠 无稳定的鉴别特征 因此至今学者们仍纷说不一 鉴于分子 标记i t s 序列在菱各居群中的变异特点及规律 我们支持t u t i n 的观点 菱属植 物有可能源于一种 而且具有种内较高的遗传稳定性 4 菱总d n a 提取法及i t s 序列扩增条件的改良 最初总d n a 的提取方法为两步法 即先将核蛋白体提取出来 然后再使d n a 从核蛋白体上释出 近些年来多采用一步法n 6 l 一在破碎细胞时加入去污剂或 去污剂与苯酚等试剂 使核蛋白体解离 然后使蛋白质变性沉淀 提取d n a 或使 d n a 沉淀进入固相而与液相中的蛋白质 多糖等杂质分离 r n a 的去除主要采用 r n a s e 消化 最后用乙醇或异丙醇沉淀d n a 总d n a 的提取方法主要有两种 c t a b 法及s d s 法 s d s 法操作简单 温和 但所得d n a 含糖类杂质较多 c t a b 法的最 大特点是能很好地消除糖类杂质 所以对于含酚类物质及糖类物质较高的植物材 料 采用c t a b 法是比较理想的 该方法的另一个特点是在提取的前期能得到高含 量的d n a 与r n a r n a 可用r n a s e 水解掉 因此 我们选择了c t a b 法提取新鲜菱 第二章菱属植物的r d n ai t s 区的序列特征及分子鉴别 叶中的总d n a 对于菱果胚或内果皮总d n a 的提取采取此法也同样取得了较满意 的效果 菱i t s 区的g c 含量较高 5 8 4 一5 9 6 给p c r 工作带来了较大困难 经 对p c r 扩增条件的不断摸索 我们找出了比较适合菱属植物i t s 序列扩增的优化 条件 提高并增加一次预交性温度 将预变性温度提高至9 7 同时降低退火温 度至5 2 这才取得比较理想的扩增效果 衰2 5 各居群盼特异性鉴新位赢 t a b l e2 5a u t h e n t i n a b l es i t e si nd i f f e r e n tp o p u l a t i o n so f7 r a p s 厶 参考文献 i 颜素珠 中国水生高等植物图说 北京科学出版社1 9 8 3 1 2 1 1 3 0 2 江苏新医学院编 中药大辞典 上海 上海科学技术出版杜 1 9 8 6 1 9 9 2 1 9 9 3 3 k o s u g et y o k o t am s u g l y a mk e fa 1 s t u d i e s o n c h i n e s em e d i c i n es u s e d f o r c a n c e n c y t o t o x i c c o ns t i t u e n t s a g a i n s th e l a c el l s i n t h e f r u i to ft r a p ab i s p i n o s ar o x by a k u g a k uz a s s h i 第二章菱属植物的r d n ai t s 区的序列特征及分子鉴别 1 9 8 6 1 0 6 2 1 8 3 1 8 5 4 z h a o z e z h e n w e il i z h e n t h e r e p o r t o nt h e m u t a g e n i c i t y a n d a n t i m u t a g e n i c i t y s y n c h r o n o u s t e s to fal o to fe d i b l ec h i n e s eh e r b c a r c i n o g e n e s i s t e r a t o g e n e s i s a n d m u t a g e n e s i s 2 0 0 0 1 2 2 8 7 8 9 5 牛风兰 李晨旭 董威严等 菱壳水提物对胃癌细胞抑制作用的实验研究 白求恩医科 大学学报 2 0 0 1 2 7 5 4 9 5 4 9 7 6 牛凤兰 李晨旭 董威严等 四种水生植物中无机元素和维生素c 的研究 食品科学 2 0 0 l 2 2 1 2 8 7 9 7 b a l d w i n b g p h y l o g e n e t i cu t i l i t yo ft h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r so fn u c l e a rr i b o s o m a l d n ai np l a n t s a ne x a m p l ef r o mt h ec o m p o s i t a e m o l e e p h y l o g e n e t i c se v 0 1 1 9 9 2 1 1 3 1 6 8 丁小余 王峥涛 徐红等 枫斗类石斛rd n ai t s 区的全序列数据库及其序列分析鉴 别 药学学报 2 0 0 2 3 7 7 5 6 7 5 7 3 9 丁小余 徐珞珊 王峥涛等 齿瓣石斛的位点特异性p c r 鉴别 药学学报 2 0 0 2 3 7 1 i 8 9 7 9 0 1 1 0 马小军 汪小全 肖培根等 野山参与栽培参rd n a 内转录间隔区 i t s 序列比较 中 国中药杂志 2 0 0 0 2 5 4 2 0 6 2 0 9 11 b a oy i n g g es o n g i d e n t i f i c a t i o no fo r y z as p e c i e sw i t ht h ec d g e n o m eb a s e do nr f l p a n n y s i s o f n u c l e a rr i b o s o m a li t ss e q u e n c e s a c t ab o t a n i c as m k a 2 0 0 3 4 5 7 7 6 2 7 6 5 1 2 屈良鹄 陈月琴 生物分子分类检索表 原理与方法 中山大学学报 自然科学版 1 9 9 9 3 8 1 1 6 1 3 t u r i nt g f l o r ae u r o p a e a c a m b r i d g e c a m b r i d g eu n i v e r s i t yp r e s s 1 9 6 8 2 3 0 3 4 5 2 1 4 中国植物志 2 0 0 0 第5 3 卷 第二分册 7 2 6 1 5 孔庆东 李峰 话说嘉兴南湖菱 长江蔬菜 2 0 0 1 8 4 4 1 6 王关林 方宏筠主编 植物基因工程原理与技术 科学出版社 1 9 9 8 3 7 0 3 7 6 1 7 顾红雅 翟礼嘉等主编 植物基因与分子操作 北京大学出版社 1 9 9 5 1 9 9 8 1 9 2 5 3 0 第三章稀土元素铈对菱生长及污染缓解的研究 第三章稀土元素铈对菱生长及污染缓解的研究 在第二章 我们从d n a 分子的水平上探讨了中国菱属植物1 1 个品种的系 统演化关系 同时对菱的种质进行了分子标记鉴别 为栽培过程中菱品种种质 的准确选育提供了可靠的理论依据 菱不仅是我国南方重要的水生经济植物 同时它也是水体净化中浮水植物的优良物种 在环境污染治理中能发挥重要作 用 近年来 三废 的无序排放 矿产的泛滥开发 使得水体重金属污染日 益加剧 具有致癌 致突变 致畸作用 7 1 的重金属污染尤其受到众多学者的 关注 将稀土作为缓解因子应用于植物污染领域的研究已成为目前水污染研究 的一个热点 稀土微肥中的稀土元素以镧 l a 铈 c e 镨 p r 钕 n d 等为主 不同的稀土元素对植物的调节效应都有所差异 目前的研究表明 一 定浓度范围内的铈具有促进植物叶绿素形成 提高光合速率 增强植物细胞内 保护酶活性 降低自由基含量等生物学作用 有人发现铈可明显降低小麦幼 苗茎叶及根系中镉的生物富集量 但关于铈对水生植物镉毒害作用的缓解作 用 至今未见报道 本实验拟以稀土元素铈为缓解因子 以重金属镉为污染源 研究铈对镉胁迫下菱毒害反应以及缓解作用 从而为菱应用于环境污染治理提 供理论依据 材料和方法 1 植蛔材料 南湖菱 t c a p aa c m sn a k a n o 为本实验所用材料 采自于浙江嘉兴南湖 水域 于2 0 0 2 年9 月下旬栽种于南京师范大学生命科学学院花房水池 z 稀 处理浓度的筛选 用分析试和纯c e n 0 配制不同浓度的c e 0 0 0 5 0 1 0 5 l 5 1 0 2 0 m g l 来处理菱以观察单独稀土元素