DMD的基因诊断(1).ppt

1 1bp 1Kb 2Mb6Mb100Mb 亚带 带 区 臂整条 整组染色体 基因疾病 基因组疾病 染色体疾病 基因病诊断高技术平台 基因组疾病诊断高技术平台 染色体病诊断高技术平台 以PCR加DNA测序为基础 共由10余项技术组成 以SNParray加Bac克隆原位杂交 FISH 技术为基础 共由10余项技术组成 以染色体G显带技术加染色体原位杂交技术 FISH 为基础 共由20余项技术组成 2 脊髓性肌肉萎缩症 3 脊髓性肌肉萎缩症 SMA由于脊髓前角细胞运动神经元变性导致近端肌肉萎缩和无力发病率1 10000遗传方式 常染色体隐性遗传 4 临床特征 婴儿期学龄前及青春期发病表现为四肢的近端肌肉对称性进行性无力及萎缩肌张力降低 腱反射减退或消失呼吸衰竭肌电图 神经元性损害肌酶学检测 多为正常 5 临床类型 6 发病机制 7 SMN基因 定位 5q11 2 11 3 结构 长20kb 8个外显子 突变 98 7 为外显子7和 或8的缺失2 3 为点突变与缺失相结合的杂合子 8 9 10 PCR 酶切法检测SMN基因 原理 SMN2的7 8号外显子分别存在一个DraI和DdeI酶切位点 而SMN1没有其PCR产物进行酶切后可以检测SMN1是否有7 8号外显子的缺失 11 PCR反应体系 12 7号外显子PCR反应条件 13 8号外显子PCR反应条件 14 PCR产物酶切体系及条件 15 16 17 测序 对SMN基因EXON7 8进行直接测序可确证PCR 酶切法的检测结果可避免PCR 酶切法酶切不全造成的假阴性结果 18 19 20 MLPA 21 22 23 非综合征型耳聋 24 耳聋简介 听力丧失是最常见的感觉障碍 发病率 1 500新生儿非综合征型耳聋 nonsyndromichearingloss NSHL 指不伴有耳外组织异常或病变的耳聋 遗传方式 常隐 常显 X连锁 线粒体遗传 25 耳聋相关基因 已经定位120多个NSHL基因位点 克隆确认了41个核基因 线粒体基因2个 最常见的致病基因 GJB2 SLC26A4 mtDNAA1555G 26 27 1998年夏家辉院士等成功地克隆了人类遗传性耳聋 GJB3 疾病基因 中国本土克隆的第一个基因 NatureGeneticsvolume20december1998 P370 373 Mutationsinthegeneencodinggapjunctionprotein 3associatedwithautosomaldominanthearingimpairment 28 29 30 31 GJB2基因 定位于13q11 gDNA长5510bp 含有2个外显子 只有2号外显子参与编码 编码区长681bp 32 GJB2基因编码产物为间隙连接蛋白分子26 connexin26 CX26 CX26在细胞与细胞间形成间隙连接 在感觉毛细胞受到声音的刺激后钾离子回流到内淋巴液的过程中起着重要的作用 33 检测方法 PCR 测序 34 目前已报道的致病突变有191种 其中235delc为最常见的突变形式 占75 35 SLC26A4基因 定位于7q31 gDNA长约57kb 由21个外显子组成 编码序列长2343bp 36 SLC26A4基因编码pendrin蛋白 为膜蛋白分子 介导阴离子转运 pendrin蛋白在耳内主要表达于内淋巴导水管及内淋巴囊 球囊和椭圆囊 耳蜗内的外侧沟 参与维持内耳的离子浓度 37 检测方法 对21个外显子直接测序 38 药物性耳聋 已知的耳毒性药物有近百种氨基甙类抗生素 链霉素 卡那霉素 新霉素 庆大霉素等 最为常见 大环内酯类抗生素 红霉素等 抗癌药 长春新碱 2 硝基咪唑 顺氯氨铂 水杨酸类解热镇痛药 阿司匹林等 抗疟药 奎宁 氯奎等 袢利尿剂 速尿 利尿酸 抗肝素化制剂 保兰勃林 铊化物制剂 反应停 39 线粒体12SrRNA基因 在线粒体基因突变导致耳聋的患者中 绝大部分是由于A1555G突变引起 40 检测方法 PCR 测序 41 mtDNAA1555G突变发生在12SrRNA与氨基糖甙类抗生素 AmAn 结合区的编码区 该突变可增强AmAn与12SrRNA的结合 干扰线粒体蛋白质和ATP的合成 最终导致耳聋 有文献报道大部分的mtDNAA1555G突变患者 在没有使用AmAn的情况下也会致聋 而AmAn只是加快了这个过程 42 脆性X综合征 43 脆性X综合征 fragileXsyndrome 是最常见的X连锁的单基因性智力低下综合征 1969年美国Lubs在X连锁智力低下的家系中 发现带有一条长臂末端具随体样结构的X染色体 1977年澳大利亚Sutherland将这种随体样结构定位于Xq27 并命名为脆性部位 fragilesite 脆性X综合征因此得名 发病率仅次于21 三体综合征群体发病率 男性全突变率1 3600 4000 女性全突变率1 4000 6000 44 45 FXS临床特征 智力障碍男性患者大多数都表现为中度至重度智力障 这与甲基化嵌合体及前突变 全突变嵌合体有关约有30 50 的女性全突变携带者患病 大多数表现为难以觉察的或轻度的智力障碍 女性全突变携带者是否患病及患者智力障碍的差异是由于X染色体差异性失活所致 46 特殊面容颜面瘦长 前额突出 耳朵大 下颌大 嘴大唇厚 上门齿长腭弓高头围大大多数男性患者在青春期发育后出现大睾丸 47 语言障碍许多患者都具有与智力水平相应的语言障碍 较差的听力和记忆力 有的患者在受到刺激时 不仅词语少 吐词不清 而且没有正确的语言表达形式 有的还有轻度的发音缺陷 典型口吃 行为异常可分为截然不同的两类 一类表现为胆怯 忧虑 性情孤僻 表现礼貌 且有一定技能 另一类则表情欢快 好动 情绪烦躁 手势能力增强 甚至行为暴躁 48 结缔组织异常皮肤松软 张力减弱 关节松弛过度伸展 扁平足 关节脱位 二尖瓣脱垂等神经内分泌功能障碍症状出生过重 巨头 身材过长等过度生长表现前突变男性携带者可有迟发性的进行性小脑性共济失调和意向震颤 前突变女性携带者可出现过早的绝经和卵巢功能衰退 49 FMR1基因 定位Xq27 3 全长约38kb 17个外显子5 端有一个 CGG n三核苷酸串联重复序列 在其上游大约250bp处有一个CpG岛 50 致病机理 51 检测方法 PCR扩增FMR1基因 CGG n重复序列RT PCR扩增FMR1基因的cDNA序列Southernblotting 52 CGG n FMR1 1FMR1 2 5 3 PCR扩增FMR1基因 CGG n重复序列 53 AAAAA TTTTT mRNA cDNA 逆转录 FMR1 正向引物 反向引物 RT PCR扩增FMR1基因的cDNA序列 54 CGG nPCR RT PCR SRY基因 先证者为全突变患FXS者 胎儿为男性正常胎儿 55 SouthernBlotting原理 将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后 通过琼脂糖凝胶电泳进行分离 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上 固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行