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方法比较试验 一 实验目的 1 掌握本实验的实验原理 2 掌握两种不同操作方法的操作过程 3 了解血清葡萄糖测定的临床意义 4 学会应用分光光度计对各组数据进行统计处理 二 实验原理 方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法 如参考方法或经典方法 作对比分析 同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差值 以评价候选方法的准确度 是考核候选方法是否可被采用的重要试验 用于检测候选方法的恒定误差和比例误差 如对适当的数据进行分析也可以提供误差的性质 本实验以邻甲苯胺法作为比较方法 评价GOD POD法测定血糖的总系统误差 邻甲苯胺法测定血糖原理 在热的醋酸溶液中 葡萄糖醛基与邻甲苯胺 O T 缩合成糖基胺 经脱水 生成希夫碱 Schiffbase 经分子重排生成蓝绿色化合物 在630nm波长处有一吸收峰 吸光度大小在一定范围内与血糖浓度成正比 邻甲苯胺 葡萄糖葡萄糖基胺希夫碱蓝绿色化合物 缩合 脱水 三 试验试剂器材 1 邻甲苯胺试剂2 GOD POD法试剂盒3 待测血清四种含血糖浓度不同的血清 2 2mmol L 6 7mmol L 5 2mmol L 3 7mmol L 4 葡萄糖标准液 5 55mmol L 5 其它 移液器 可见分光光度计 水浴箱等 四 操作步骤 1 每人随机选择血糖含量高低不同的病人血清标本2份 2 将每份标本分别用两种方法各测定2次 将标本按某次序排列先测一次 第2次测定时 标本顺序全部倒过来 例如 第1次序号为1 2 3 4 5 6 7 8 第2份序号为8 7 6 5 4 3 2 1 3 计算出两法各自的测定结果 具体操作如下 GOD POD法 加入物空白管S 标 U1 测 U2 测 DDW10ul 5mmol L 糖标 10ul 待测血清 10ul10ul试剂 酶酚 1 5ml1 5ml1 5ml1 5ml混匀后置370C水浴15min 于505nm处比色 空白管调零 读取吸光度值 O T法 邻甲苯胺法 加入物空白管S 标准管 U1 测 U2 测 DDW0 1ml 5mmol L糖标 0 1ml 待测血清 0 1ml0 1ml邻甲苯胺试剂3ml3ml3ml3ml混匀后放入沸水中煮沸5min 取出置冷水中冷却3min 于630nm处比色 以空白管调零 读取吸光度值 五 结果计算 测定管吸光度血清葡萄糖 5mmol L标准管吸光度 参考范围 空腹 3 89 6 11mmol L 餐后2h 7 8mmol L 数据处理 1 设对比方法测定结果为X值 候选方法测定结果为Y值 若有n个标本 则有2n对X和Y的测定结果 2 离群点检查 先计算每一标本每一方法成对结果的差值和差值的均值 以4倍的各方法差值的均值为判断限 各方法内标本的成对差值都应在限值内 说明双份测定结果符合要求 若有1点离群点 剔除 若原数据仅为40例病人标本的结果 剔除的数据应另做实验补上 有一点以上离群点 需查原因 判断是否保留数据 无法找出原因 则保留使用所有数据 不能随意剔除 若最大差异超过临床允许误差 应从仪器 试剂 方法上寻找原因 停止继续实验 3 绘制散点图 以X轴代表对比方法的测定值 Y轴代表被评价方法的测定值 图中标出斜率为1通过零点的直线 4 如果实验结果线性关系良好 继续处理 如果呈非线性趋势 则需要观察是否有部分呈线性关系 寻找修正点 使余下的部分具线性趋势 但应考虑这部分是否包括了临床上有用的范围 是否需再多做一些在此范围的标本结果 如去掉非线性部分后 范围过小 无应用价值 则停止评价 5 X Y配对值离群点检查 将每一个标本两个方法的前后两个测定值一一对应 求出第i个X与第i个Y的差值 并计算出所有标本总的平均差值 以4倍的平均差值为判断限值 所有差值都不应超出限值 若有离群点 按步骤2中的方法处理 6 统计学处理及误差分析直线回归分析 对上述n个标本 2n对 Xij Yij 数据以回归方程式y a bx表示 a为回归直线在Y轴上的截距 代表恒定误差的大小 b为回归系数 即直线的斜率 代表比例误差的大小 a和b的计算公式分别为 如果两方法表示的某分析物量具相同的计量单位时 理想状态的回归式应为y x 即b 1 a 0 b 1 a 0分别表示两方法间的测定标本时的比列误差和恒定误差 相关性分析 相关系数r 求出的相关系数还应作相关系数的t检验 相关系数 r 的t检验统计学公式是 将方法比较试验的原始数据 x和y值 求得的相关系数r及例数 n 代入t检验的统计学公式 即可求出相应的tr值 再按照n 2的方法计算出自由度 v 查t值表求得t0 05 v 及t0 01 v 相应的t值 若tr t0 05 v P 0 05 说明实测的相关系数 r 与0之间差异显著 两种测定方法的测定结果之间存在相关关系 若tr t0 01 v P 0 01说明实测相关系数 r 与0之间有非常显著的差异 两种方法的测定值之间存在着高度相关关系 7 方法比较试验的数据属于配对资料 因而可作配对资料的t检验 差值标准差 Sd 自由度 V n 1差值标准差中的d代表候选方法与参考方法测定值的差值 为差值之平均值 n为配对数 判断 若求得t值 t0 05 v 即P 0 05 表示候选方法存在显著的系统误差 六 注意事项 1 对比方法的选择十分重要 一般应选参考方法 这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法 在整个实验中 保持候选方法和比较方法都处于完全质量控制下 始终对实验结果有校准措施 2 实验时间至少做5天 时间长一些更好 标本至少选择40份病人 多一份更好 实验的可靠性和有效性随时间延长和更多的标本量而增加 尽可能使50 的实验标本内分析物含量不在参考区间内 各个标本内分析物含量分布越宽越好 3 最好使用当天采集的标本 若需保存标本 应确保它们的稳定性 只使用一种保存条件 能符合两个方法的要求 以免条件不一引出新的变异 4 方法学比较试验时 随时将实验数据点在分布图 发现异常值即复做 及时纠正 可减少离群值出现的机会 5 实验方法在做双份第二次实验时 标本顺序全部倒过来 应在4h内完成测定 七 方法学评价 对比资料的相关系 r 常用来表示两个变量间互相关系密切的程度 并不能指明有无恒定误差和比例误差 直线回归统计时 除了所有实验点和回归线间的离散度会影响r值的大小外 实验点对应的分析物含量分布宽度也会明显影响r值的大小 若实验点过于密集 尽管离散度不大 但r值偏小 因此 可用r检验X取值范围是否适当 一般要求r 0 975 或r2 0 95 认为X范围是适合的 若r 0 975 应收集更多标本再继续实验 使数据分布范围增大 依据r值大小来判断两种比较方法分析结果符合程度时应持谨慎态度 相关系数好 但斜率和截距仍然受离群值和非线性以及数据分布范围的影响 八 可接受性判断 评价实验完成以后 应写出书面报告 确定方法评价的结论 候选方法可否被接受 最后根据评价实验中的误差结果进行归纳 作出判断 根据 可允许误差的95 限度 计算各项误差与其比较 任何一项指标大于可允许误差都不能被接受 只有在假设所有实验结果是绝对正确的前提下 才能进行上述计算 为了在适当的样品数下 能以最小的代价取得实验误差测定的最大可靠