（微生物学专业论文）芽孢杆菌pcr鉴定方法的建立和应用.pdf

摘要 准确快速鉴定产品中的微生物种类是保障微生物肥料安全和有效的前提。传统的鉴定方法存 在一些不足的地方。费时费力，有时又准确度不高，分子鉴定方法是解决微生物肥料质量检测中 菌种判定难、效率低的有效途径，但目前应用仍较少。本文根据种特异性基因序列设计引物，利 用聚合酶链式反应( p c r ) 建立一套简单、快速鉴定7 种常见芽孢杆菌的方法，从而为微生物肥 料产品的质量和安全性检验提供技术支持。 1 通过基因序列的同源性分析，筛选出具有种( 群) 特异性的基因作为p c r 的靶序列。利 用软件设计了枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、解淀粉芽孢杆菌( 丑a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 、地农芽 孢杆菌( 置l i c h e n i f o r m i s ) 、短小芽孢杆菌( 且p u m i l u s ) 、巨大芽孢杆菌( 且m e g a t e r i u m ) 、蜡样群 芽孢杆菌( 且c e r e u sg r o u p ) 、胶胨样群芽孢杆菌( 且m u c i l a g i n o s u sg r o u p ) 的引物，通过互联网比 较分析得到7 对具有种群特异性的引物。设计筛选的引物分别是：根据r p o a 基因设计了引物 e s t d 讲l i sb s l 7 2 b s r 3 2 8 ，依据g y r a 基因设计了引物b a m y l o l i q u e f a c i e n sl 1 0 0 r 8 3 6 和且 f w h e n i f o r m i sl 1 6 8 r s l 4 ，在s p o o a 基因的基础上设计的引物b m e g a t e r i u r ab m l 2 5 7 b m r 7 0 0 和引 物b c e r e u s g r o u p l 2 1 4 6 2 5 ，根据1 6 sr r n a 基因设计了引物b m u c i l a g i n o s u s g r o u p i a l 5 r 1 0 0 8 和 引物b p u m i l u sl 3 5 4 r 6 7 4 。 2 采用设计的种特异引物，通过优化p c r 反应的退火温度、引物浓度、m g + 浓度等关键因 子，分别建立了不同种( 群) 的特异p c r 反应体系。经过3 个属1 5 个种的模式菌株和( 或) 标 准菌株( 共4 1 株) 的实验验证，每个反应体系在种( 群) 内均能扩增出目标条带，而与其他种群 中无交叉反应( 仅短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌引物与部分菌株有阳性反应) ，显示了良好的特异 性。在灵敏度测试中，每个反应体系至少能检测到1 0 0p g 浓度的基因组d n a ，而枯草芽孢杆菌 和胶胨样群芽孢杆菌的敏感性达到了l o p g ，较高的灵敏度满足p c r 鉴定和检测菌种的要求，微 生物含量较低的样品中也能扩增出目标条带。p c r 技术鉴定不仅可以准确鉴定不同种( 群) 的菌 株，而且还能重新界定菌株的归属，在本文中将参考菌株c g m c c l 1 5 、1 1 0 8 、1 3 5 4 从枯草芽孢 杆菌中归类至解淀粉芽孢杆菌。 3 在单重p c r 基础上分别建立了枯草群复合p c r 反应体系( 含四对引物) 和巨大艚样群 复合p e r 体系( 含两对引物) ，其中枯草群复合p c r 反应可同时鉴定或鉴别枯草芽孢杆菌、解淀 粉芽孢杆菌、地农芽孢杆菌和短小芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌的复合p c r 反应可 同时鉴定或鉴别巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌。经过3 个属1 5 个种的模式菌株和( 或) 标准菌 株特异性验证，复合p c r 反应具有良好的特异性和敏感性，与单重p c r 特异性一致，只是灵敏 度有所下降( 约一个数量级) ，在1 0 0 - 1 0 0 0p g 范围内，在大量、快速鉴定和鉴别枯草群和巨大， 蜡样群芽孢杆菌中具有重要意义。 4 对产品中2 3 株枯草群菌株、l o 株巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌、1 0 株疑似胶胨样群芽 孢杆菌的基因组d n a 进行的p c r 扩增结果和典型生化实验结果显示：所有枯草群菌株均有扩增 产物，依据产物大小判断的菌株分类地位与生化实验结果一致，巨大和蜡样群菌株亦是如此；疑 似胶胨样群菌株中有扩增产物的菌株表现典型的培养特征和菌体特征，而非胶胨样群菌株则无扩 增产物，在菌落或菌体方面与其存在显著差异。因此特异p c r 技术用于鉴定生产菌种准确可靠， 具有良好的应用价值。 5 通过产品特征的分析和研究，建立了产品洗涤、菌体悬浮、珠式破碎、酚氯仿异丙醇抽 提的微生物肥料产品d n a 提取方法，解决了微生物肥料中腐植质含量高难去除和芽孢难破壁的 d n a 提取难题。使用该方法获得的样品d n a 为无色或浅棕色，大小约9 k b ，经过p e r 扩增，液 体样品的p c r 灵敏性达到1 0 - i 0 5c f u m l ，固体草炭样品灵敏度达到1 0 7c f u 0 2 9 。虽然该方法 d n a 损失较多，敏感性稍差，但是成本低，效率高，可直接用于p c r ，为p c r 方法直接检测产 品提供了前提条件。 6 利用以上d n a 提取技术获得1 6 个微生物肥料产品的d n a ，经过特异p c r 扩增，除了两 个产品中一种目标微生物含量太低( 低于检测限) 无扩增产物外，其他产品均有目标菌的扩增产 物，根据扩增条带的大小对产品的鉴定与传统分离培养及生化鉴定结果一致，而且p c r 反应的特 异性没有受到产品中其他微生物的干扰。实验结果表明本文建立的种( 群) 特异p c r 技术和d n a 提取方法可用于微生物肥料产品的直接检测，在提高微生物肥料的检测水平和检测效率方面有着 巨大的应用潜力。 通过大量参考菌株和生产菌株以及微生物肥料产品的试验表明：基于序列分析和种( 群) 特 异引物的基础上建立的单重p c r 和复合p c r 方法，在鉴定和鉴别7 个种( 群) 的芽孢杆菌菌株 上具有快速、准确、敏感的优点，该方法不仅能够用于纯菌株的鉴定和鉴别，在含有复杂微生物 群体和基质的微生物肥料产品中也具有良好的应用前景。 关键词：特异p c r ，菌种鉴定，检测，芽孢杆菌，微生物肥料 a b s t r a c t t h ee n d o s p o r e - f o r m i n gb a c t e r i aa u s u a l l yu s e di nt h em i c r o b i a lf e r t i l i z e r s 酬a n da c c i ：t r a t e i d e n t i f i c a t i o no ft h e s eb a c t e r i aw o u l db eu s e f u lt oi m p r o v et i m er e q u i r e df o rt h eo g $ 1 n e l l to fq u a l i t y a n ds a f a yo fm fp r o d u c m t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st od e v e l o pp r i m f o rt h er a p i da n da c c m a m i d e n t i f i c a t i o no fb a c i l l u ss p e = c i w h i c hh a v eh i g hs i m i l a r i t yi nm o r p h o l o g i c a la n dp h e n o t y p i c c h a r a c t e r i s t i c sa n db u i l daa e r i a lo f p c rm e t h o d st od e t e c tt h ep r o d u c t so f 伍d i r e c t l y b y a n a l y s i s o f t h e u n i q u e n u e l e o t i d es e q u e n c e o f t h e b a c i l l u ss p c c i r p o a ，g y r a ，s r o o aa n d1 6 s r r n ag e n e s ，s e v a i lp a i r so fs p e c i e s - s p e c i f i co rg r o u p 喵p e c i t i cp f i m e nw g 目t gd e v e l o p e df o rb a c i l l u s s u b t i l i s ，b a m y l o l i q u e f a c i e n s ，b 1 i c h e n i f o r m i s ，b p u m i l u s , b m u c i l a g i n o s u sg r o u p ( b m u c i l a g i n o s u s a n db e d a p h i c u s ) ，b c e r e g r o u p ( o c e r e u s ，b m y c o i d e sa n db t h u r i n g i e n s i s ) t h ep r i m e rb s u b t i l i s b s i j 2 ，b s r 3 2 8w a sd e r i v e df r o mt h er p o ag e n e , t h ep r i m e rb a m y l o l i q u e f a c i e n sl 1 0 0 r 8 3 6a n d 且 l i c h e n r m i sl 1 6 8 r s l 4f r o mt h eg y r ag e n e , b m e g a t e f f u mb m l 2 5 7 b m r 7 0 0a n db c e r e t $ g r o u p l 2 1 4 6 2 5f r o mt h es p o o ag e r m , a n db m u c i l a g i n o s u sg r o u pi a l 5 r 1 0 0 8a n db p u m i l u s1 3 s 4 f r 4 f r o r at h e1 6 sr r n a g e n e t h em o n o p l e x - p c rm e t h o d sw e r ee s t a b l i s h e dw i t ha d j u s t i n gt h ef a c t o r s ( i et h ec o n c e n t r a t i o n o f p r i m e r sa n dm 矿，t h et e m p e r a t u r ea n dt i m eo f d e n a t u r a t i o n ，a n n e a l i n ga n de l o n g a t i o n ) o nt h eb a s eo f s p e e i e s 唧e e i f i eo rg r o u p - s p e c i f i cp r i m e l x t h ep c ra s s a yw a ss p e c i f i cb yt e s t i n gw i l hd n af r o ma l l3 3 s t r a i n 8a n d1 5s p e c i e so f b a c i l l u s ，p a e n i b a c i l l u s ，b r e v i b a c i l l u s ，既c e p ts e v e r a ls p e c i 髓h a da m p l i f i c a t i o n w i t ht h ep r i m e l 苫磺8 p u m l u sa n db m e g a t e r u m t h ep c r 弘o 娥d e r i v e df r o mt h et y p es w a i l l so f b a c i l l u ss p w e f es e q u e n c e d , a n dt h es e q l l e l l c ea n a l y s i sr e v l e dt h a tl h e i rc o r r e s p o n d i n gp l j m e rt a r g e t s w e h i g hi d e n t i t y p c rf r a g m e n t sw 、，i s i b l eo na g a r o s eg e l sa tl e a s t1 0 0p gw i l ht e m p l a t e sd n a o f t h e 翻a 恤s p e c i e s ，e v e l lt h ee e m i t i v i t yo f b s u b t i l i sa n d 且m u c i l a g i n o s u sr e a c h e d1 0p g m e w h i l e , t h r e er e f e r e n c e $ 1 1 _ a i l l sw e r et r a n s f e r r e db s u b a l i st ob a m y l o 妇u e f a c i e n s bt h es p e c i f i cp c i l b o t hm u l t i p l e x - p e rm e t h o d sw e b u i l to nt h eb a s eo fs p e c i f i cm o n o p l e x - p c i lw i t h3 3s l f a i l a n d1 5s i c i e so f t h r e eg e n u s e so f b a c i l l u s ，p a e n i b a c i l l u sa n db r e v i b a c i l l u s ，t h ep c ra s s a yw a ss p e c i f i c m o n o p l e x - p c i lt h eb s u b t i l i sg r o u pm u l t i p l e x p c rc o u l ds i m u l t a n e o u s l y 如t 融b s u b t i l i s , b a m y l o l i q u e f a c i e n s b 1 i e h e n i f o r m i sa n db p u m i l u st h r o u g ht h es i z eo ff r a g m e n t s b m e g a t e r i u m b c e r e wg r o u pm u l t i p l e x p c rm e t h o d sc o u l di d e n t i f yt h es t r e d mo tb m e g a t e r i u ma n db c e f e h t $ 粤c p 哂 c e r e u s , b m y c o i d e $ a n d & t h u r i n g i e n s i s ) t h es e n s i t i v i t i e so fm u l t i p l e xp c r a _ e1 0 0 1 0 0 0p 鲁 ( d n a ) u t i l i z a t i o no f t h ep c r , 2 3i s o l a t e so f b s u b a l i sg r o u pa n d1 0i s o l a t e so f b m e g a t e r i u m | b c a e l n g r o u pa n d1 0i s o l a t 目o fb m u c i l a g i n o s u sg r o u pw e i d e n t i f i c a t e df r o mt h eo t h e rm e m b e r so ft h e c l o s e l yr e l a t e ds p 呶t h em o r p h o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t e s t sc o n f i r m e dt h er e s u l t so f t h ep c r a s s a y m i c r o o r g a n i ac e l l sw e l es e p a r a t e , lf r o mm fs a m p l e sa n dd i 口u p t c db yu s i n gt h eb e a dm i l l h o m o g e n i z a t i o n d n ai s o l a t e df r o md i s r u p t e dc e l lw a s9 k bs i z ea n da d a p t d l f o rp c i lt h es e n s i t i v i t i e s w e r ea b o u t1 0 4 1 0 5c f u m li nt h el i q u i dm fs a m p l e sa n dt h eo n l y1 0 7c f u 0 2 9i ns o l i dp e a ts a m p l e m d u et ol o w e rr e c o v e r ya n di n t e r f e r e ro f h u m i cm a t t e r t h ef e i t sw h i c h1 6m fs a m p l ew b = r ed e t e c t e db y p c rm e t h o d sw e a c c o r d i n gt ot h er o u t i n ec u l t u r ea n db i o c h e m i c a lt e s t i n gm e t h o d s t h ep c rm e t h o d se s t a b l i s h e db yt h i ss t u d yh a v em a n i f e s ta d v a n t a g e so v e rc o n v e n t i o n a lc u l t u r e m e t h o d si ni t sf 印i d n ba n ds e n s i b i l i t yf o r t h ed e t e c t i o l la n di d e n t i f i c a t i o no f b a c i l l u s8 p e c i e 8f r o mm f i tp r o v i d e sam o r er e l i a b l ea p p r o a c hf o rt h ea s s e s s m e n to f q u a l i t ya n ds a f e t yo f m f p r o d u c t s k e yw o r d s ：s v e c m cp c l li d e n t i f i c a t i o na n dd e t e c t i o n , b a c i l l u s8 p e c i e 8 ，m i c r o b i a lf e r f i h z m i v 英文缩写 a m p b p d n a m n 甲 e b e d l a g u t c 口1 b m p n p c r s d s t b e t r i s 英文缩略表 英文全称 a m p i c i l l i n b a s ep a i r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o u n c l e o t i d et r i p h o s p h a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e r t r a c e t i ca c i d c m a n i d i n et h i o c y a n a t e i s o p r o p y l b - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e m o s tp r o b a b l en u m b e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 1 h s a c e t a t e - e d t ab u f f e r h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h i n e v i 中文名称 氨苄青霉素 碱基对 脱氧核糖核酸 三磷酸脱氧核糖核酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异硫氰酸胍 异丙基- b d 一硫代半乳糖苷 最大或然数 聚合酶链式反应 十二烷基硫酸钠 t r i s 醋酸e d t a 缓冲液 三( 羟甲基) 氨基甲烷 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：、曹风j 绸 时问：印年口月，牛日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：学风明 时间：) 。0 7 年。占月铲日 导师签名： 中国农业科学院硕七学位论文第一章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 随着农业的可持续发展和社会主义新农村建设力度的加大，微生物肥料在培肥地力、提高化 肥利用率、修复土壤、促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面的作用受 到更多的重视。近三十年我国微生物肥料行业发展迅速，产品种类不断增加，而产品的核心r 特 定的微生物己达1 0 0 多种。种类繁多的菌种拓展了微生物肥料的应用范围，提高了作用效果，同 时也给微生物肥料生产企业的质量检验和微生物肥料产品的质量监督和检验带来了新的考验。例 如，多个企业使用相同的菌种，而同一菌种的不同菌株即使在同一种培养基上也可能表现出不同 的菌落形态；或一个企业使用多个菌种唐株，这些菌株有可能菌体相同而菌落形态完全不同。这 些菌株中有作用效果较好的菌种，也有存在生物安全隐患的菌种，必须对所有菌种进行的准确识 别和判断，否则容易引起产品质量误判，甚至造成病原菌的大规模扩散。 芽孢杆菌在自然界中广泛存在，许多芽孢杆菌有溶磷和( 或) 解钾的能力，同时菌体中的芽 孢对不良环境具有一定的抗逆性，易于生产、储存和运输，已经成为许多企业首选的生产菌种。 在生产中广泛使用的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、地衣芽孢杆菌( 且f f c 加删白m 括) 、解淀粉 芽孢杆菌( 且a m y l o t i q u e f 撕) 、短小芽孢杆菌( 且p u m i l u s ) 等，从系统发育上看属于同一个进 化分支，这四种芽孢菌的菌落形态复杂多样，菌体大小相近，在实际样品检测过程中很难进行准 确判定；而在b i o l o g 快速鉴定系统中几种菌相似值经常很高，采用b i o l o g 检测定群容易定种 难；应用1 6 sr r n a 序列分析的方法也不能根本解决枯草芽孢杆菌与地农芽孢杆菌和解淀粉芽孢 杆菌之间的菌种识别问题，因为三个菌种的1 6 sr d n a 相似性达到9 8 3 ( a s h e t a l ，1 9 9 1 ) 。生产 中常用到的菌种除了芽孢杆菌属的菌株外，还常见类芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属的菌，如同氮类 芽孢杆菌( p a e n i b a c i u u sa z o t o f i r a n 8 ) 、多粘类芽孢杆菌( pp o l y m y x a ) 和侧孢短芽孢杆菌 ( b r e v i b i b a c i l l u sl a t e m s p o r u s ) 等，这些菌种在菌落或菌体与芽孢杆菌虽然在菌体的不同阶段( 即 芽孢囊阶段) 与芽孢杆菌属的菌株有区别，但在其他阶段则难以区分，将这些菌株作为实验材料 探索快速、准确方法有利于p c r 方法的推广和应用。 巨大芽孢杆菌( 且m e g a t e r i u m ) 和蜡样芽孢杆菌( 且c e r e m s ) 作为常用的溶磷细菌，具有较强 的溶磷能力，在生产中应用多。效果也比较明显。蜡样芽孢杆菌以其菌体繁殖速度快、成孢迅速 的优势深受企业青睐。根据n y1 1 0 9 - 2 0 0 6 微生物肥料生物安全通用技术准则的规定，在生产 中不能使用具有溶血反应的菌株，蜡样群芽孢杆菌( 包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌( 且 t h u r i n g i e n s i s ) 、蕈状芽孢杆菌( em y c o i d e s ) 和炭疽芽孢杆菌f ea n t h r a c i s ) ) 菌株都有溶血反应， 已禁止使用。巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌在菌体和菌落形态上非常相似，菌种的鉴定不准确 易引起安全问题。 胶胨样群芽孢杆菌能分解硅酸盐类物质，是微生物肥料生产中最常使用而且效果很好的菌种。 胶胨样群芽孢杆菌包括胶胨样芽孢杆菌( em u c i l a g i n o s u s ) 和土壤芽孢杆菌( 且e d a p h i c u s ) ，这两 个种在无氮培养基上形成透明的玻璃珠状的大菌落。菌体为一至数层多糖粘液包裹。土壤中形成 透明菌落或产生荚膜的菌种很多，其中一些为禁止使用的菌种，如肺炎克雷伯氏菌( k l e b s i e u a 中国农业科学院硕十学位论文 第一章绪论 p n e u m o n i a e ) 、产酸克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a o x y t o c a ) 还有一些需要做急性毒性试验( l d s o ) 的菌 种，如环状类芽孢杆菌( 只c i n a a m ) ，而这些细菌与胶胨样群菌株在菌落形态或菌体形态上不容易 区分，所以准确区别和鉴定胶胨样群芽孢杆菌是保证该类产品安全的前提。 传统的微生物鉴定方法主要采用形态观察和生理生化实验，需要花费大量的时间和精力，在 样品的快速检测中受到了很大程度的限制。分子鉴定菌种是近年来人们新发展的方法，这种方法 不受环境影响、微生物数量、形态、发育阶段以及生存状态的影响，通过简单的聚合酶链式反应， 以目标微生物的遗传物质d n a 为模板、扩增目标序列，通过分析扩增产物大小、碱基组成、核 酸排列顺序等判断微生物的种类，甚至可以测定目标微生物的数量。分子生物学方法不需要昂贵 的仪器设备和种类繁多的化学试剂，仅需对样品或菌种进行简单处理( 利于d n a 提取) 即能获 得理想结果。分子鉴定技术兼具有快速、准确、敏感和经济的优点，在微生物肥料产品的菌种鉴 定方面有巨大应用价值。 分子生物学方法在在基因诊断、流行病学调查和食品安全等方面已经广泛应用，但是在土壤 微生物方面的应用还较少。本文针对以上提到的三个类群的菌种应用分子生物学方法进行分析和 研究，试图建立一种快速有效的分子鉴定方法，以解决在微生物肥料样品检测过程中常出现的因 菌落形态、菌体，生理生化特性相近而无法进行准确识别菌种的难题，为鉴定微生物肥料产品中 常用菌种提供理论依据，为产品的质量和安全监督提供快速、准确和可靠的方法。 1 2 国内外分子生物学检测细菌的研究进展 人们日常接触的微生物种类复杂多样，其中不乏一些容易引起人类各种疾病的病原菌，如沙 门氏菌、出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：i 1 7 、鼠伤寒沙门氏菌、h 7 、金黄色葡萄球菌等。随着微生物肥 料产品中使用菌种的不断增加，有可能将对人、动物或植物不安全的菌种引入生产中，进而引发 环境和安全问题，一旦由于把关不严，将机会性病原或病原微生物作为生产用菌种其后果将会十 分严重。国内过去曾有将铜绿假单胞菌( 绿脓杆菌) 作为生产用菌种，以致发生传染、导致重大 事故的教训。国内外对使用菌种的安全性非常重视，不同的国家有不同的要求，“安全、有效”是 基本原则。因此，确认每一个菌种的分类地位就显得非常重要。只有在了解微生物特性的基础上， 才有利于微生物菌种功效的发挥和利用，尽可能减少人为的向生产、生活中引入病原菌，这也是 生产单位、科研部门以及管理部门的责任和义务。 微生物分类和鉴定的方法多种多样，如传统分类法，数值分类法和脂肪酸甲酯分析技术c f a t t y a c i dm e t h y le s t e r s ，f a m e ) 、自动化检测、基于遗传物质的核酸序列分析技术等。经典的传统分类 法和数值分类法，虽然耗时和繁琐，但因不需要昂贵的仪器和设备，仍然是使用最多最广泛的方法。 脂肪酸甲酯分析技术主要根据细胞壁脂肪酸的气相色谱图，经过计算机处理并与已知菌株的色谱图 进行比较，实现对细菌的快速鉴定。自动化检测系统通常利用微生物的生理生化特性、化学结构成 分，设计成高通量、标准化的快速检测技术，如法国梅里埃公司的b i o - m e t r i e u x 细菌鉴定系统和美 国b i o l ( ，g 细菌鉴定系统是最常用的仪器，但这些仪器设备较为昂贵，鉴定成本较高，一般实验 室较难配备；并且对有些细菌只能鉴定到属，到种水平比较困难。分子生物学在近年来发展很快， p c r 仪已经是研究微生物分类和应用等领域的实验室的必需设备，基于遗传物质的核酸序列分析 技术已经成为微生物分类和鉴定的重要手段。几种常用分子生物鉴定方法的特点见表1 1 2 中国农业科学院硕十学位论文第一章绪论 表1 1 几种常见分子生物鉴定方法的比较，对比分析 t a b l e l 1c o m p w i s o n o fs e v e 棚m e t h o d sa b o u t b a l ：t e n a i d e n t i f i c a t i o n i n m o l e c u l a r b i o l o g y 1 2 1核酸序列分析在微生物分类和鉴定中的作用 r r n a 是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，它含量大( 约占细菌总r n a 量的舳) 。r r n a 在细菌中高度保守。有“细菌化石”之称，是细菌系统分类中一个最常用和最有用的分子钟。从1 6 s r r n a 基因序列分析发现，它的1 5 4 0 个核苷酸是由保守区域和变化区域交替排列而成，1 6 sr r n a 序列可分为9 - - 1 0 个可变区，不同细菌甚至同种细菌的不同菌株之间都存在不同程度的差异 ( l e b l o n db ，1 9 9 6 ) 。利用软件分析各种微生物间碱基序列的差异，通常将1 6 sr d n a 序列的相似 性大于9 7 视为同一个种( g i o v a n n o n ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 。直接利用遗传物质为微生物分类，摒弃了以 前因培养条件、培养方式等原因造成的菌株表观的差异，也为那些不可培养的细菌提供了鉴定依 据。1 6 8r r n a 基因序列测定法创造了一个全新分类理念和思维方式，已经成为细菌种属鉴定和分 类的标准方法( l e b l o n db ，1 9 9 6 ；j s c nma ，1 9 9 3 ) 。在公开发布的核酸数据库中已经有2 1 6 3 9 个 1 6 sr d n a ( b a c t e r i a ) 的序列( 截止2 0 0 7 年0 2 月1 4 日) ，为大量使用该方法提供了前提和保障。 目前，使用这个方法已经为很多菌株细菌确定了分类地位，理清许多分类系统混乱的现象，更正 了一些菌株的分类错误( 焦振泉，1 9 9 8 ) 。 1 6 sr d n a 序列测定在各个领域得到了广泛应用，但在鉴定一些种时也显得无能为力，因为 1 5 0 0 b p 的碱基在细菌整个基因组1 0 6 _ 1 0 7 碱基当中的比例毕竟还是相当小的，有时不能代表整个 细菌基冈组的变化( m a r i av e l z i ，2 0 0 5 )ks b l a c k w o o d ，2 0 0 4 ) 。ks b l a c k w o o dc ta l ( 2 0 0 4 ) 用 通用引物扩增了1 6 sr d n a 部分序列，测序后发现，b a c i l l u s 属中菌株的相似性水平在 7 0 0 - - 1 0 0 ，其中最c e r e l g f 分支和新发表的两个种置p s y c h r o t o l e r a t 和且p s y c h r o 出r a n s 序列 一致性为1 0 0 。且s u b t i l i s 群中且a t r o p h a e u s 和且v a l l i s m o r t i s ，最s u b t i l i ss u b s p s p i z i z e n i i 和且 m a j a v e n s i s ，序列只存在一个碱基的差异，相似性在9 9 8 ，远远不能满足新种的要求。 2 3 sr d n a 约为2 3 k b 。与1 6 sr d n a 基因特点类似，进化上相对保守，全长序列有2 1 个保守 序列，其间分布着很多高度变异区。保守区和部分变异区内存在大量“马赛克”变异序列，高度保 守区相对较少。由于序列相对较长储存的信息量大，现在渐为人们采用。很多研究人员根据保守 区和变异区设计引物来分辨微生物，有人研究比较了2 1 属4 6 种病原微生物的2 3 sr d n a 序列， 3 中国农业科学院硕+ 学位论文 第一章绪论 其构建的系统发育树分析结果与1 6 sr d n a 的分析结果是一致的( 洪帮兴，2 0 0 4 ；a n t h o n y ，2 0 0 0 ) 。 当人们发现许多1 6 sr r n a 基因序列差异不明显时，开始关注其他基因序列在分类上的使用 价值。由此一些基因序列也逐渐用于微生物的分类，如g ) ，r a 基因，g y r b 基因，础田基因、r p o d 基因，1 6 s - 2 3 sr r n a 基因区间( i g s ) ，v r r a 等，这些基因有着与1 6 sr d n a 基因相似的特点，即 存在较为保守的区段但序列的变异性更大( y a m a n t os ，1 9 9 8 ：y u a n q i 。2 0 0 1 ；d a n i e l e d a f f o n c h i o ， 1 9 9 8 ：j c n s e nma ，1 9 9 3 ；c l a u d i as c h a b e r e i t e r - g u r m e r ，2 0 0 1 w i l h e l ms c h o n h u b e r ，2 0 0 1 ) 。 细菌d n a 促旋酶由g y r a 和g y r b 两个亚单位组成，酶的活性结构是由2 个a 亚基和2 个b 亚基组成的四聚体，即( b a ) 2 。g y r b 约有1 4 0 0 个碱基，碱基替换频率较高，1 6 sr d n a 的平均碱 基替换率是每5 0 0 0 万年1 ，而g y r b 是每1 0 0 万年0 1 7 - 0 1 8 ，g y r b 基因的变异速度也较其 他蛋白质速度快，其序列分析可应用于种水平的鉴定( k a k i n u m af ，2 0 0 3 侯晓丽，2 0 0 5 ) 。g y r a 基 因序列较长( 约2 5 k b ) ，有着与g y r b 相似的特点，也已经用于菌株的多样性分析( m i c h a e l s r o b e r t ， 1 9 9 4 ) r p o b 基因是编码r n a 聚合酶的b 亚单位，是细菌鉴定和序列多态性分析的一个标记序列， 而且r p o b 基因是一个高度保守的看家基因，在所有细菌种类中均有一个拷贝，在细胞代谢过程 中起着重要的作用( 侯小丽，2 0 0 5 ) 。r p o b 与r p o c ( 编码b7 亚单位) 一起组成r n a 聚合酶五 聚体接触反应中心，根据该基因的碱基差异，已经被用于c o x i e l l a b u m e 巩r i c k e t t s i a ，y e r s i n i a p e s t i s , b a c i l l u sa n t h r a c i s ，s t r e p t o c o c c u s ，e n t e r o c o c c u s ，g e m e l l a ，a b i o t r o p h i a ，g r a n u l i c a t e l l a 的菌属鉴 别和系统发育分析( y u a nq i ，2 0 0 1 ；m i c h e ld r a n c o u r t ，2 0 0 4 ；k ok s ，2 0 0 3 ) 。 原核生物中，r r n a 基因位点( 咖) 包括5 sr r n a 、1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 3 个基因，分散排列 在染色体上，其间插入有许多间隔序列，这些间隔序列在不同种属细菌之间显示出长度和碱基的 差异，长度的差异通常是由于其问夹杂有不同数目的t r n a 或不同的t r n a 所导致，同时这种差 异性在不同种属细菌之间也是高度保守的( d a n i e l ed a f f o n c h i o ，1 9 9 8 ) 。国外研究证明1 6 s - 2 3 sr r n a 基因间区( i g s ) 的进化率要强于1 6 sr r n a 基因l o 倍，同时具有保守性和可重复性的特点，已 经用于菌种鉴定，在菌株的分型上作用尤为明显( g u r t l e r v ，1 9 9 6 ：n a t h a l i e l b ，1 9 9 6 ) 。 v r r a 基因具有串联重复和多态性特点，已经被用于炭疽芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌分子分型的 研究，建立相关多态性数据库，用于菌株的溯源研究。1 5 株蜡样芽孢杆菌的v r r a 分子分型与传 统生化试验分型结果相同，甚至比生化分型更细( 扈庆华，2 0 0 3 ) 。因此，v r r a 基因序列更适用于 菌株的分型和种以下水平的鉴定。还有一些基因由于其突变发生的频率高，在种类鉴定、生物多 样性研究和菌株分型以及抗药性研究等方面广为采用，如r p o d 、t r n a 基因等( m a y s am ，2 0 0 1 ； y a m a m o t os ，1 9 9 8 1 。 随着核酸测序成本的降低，测序准确性的提升，核酸序列分析为细菌的鉴定提供了非常便利 而有效的方法。从网上公开发表的基因序列看，主要以1 6 sr d n a 基因为主，其它基因序列的数 据很少，一些新分离到的菌株因无与之相似的序列比较，无法了解该菌种的系统发育情况。而一 些已经发表的核酸序列菌株的具体分类地位还值得商讨，所以以此为参考对未知菌株进行系统发 育分析，其结果的准确性更加不可靠。因此，核酸序列分析技术在菌种分类和鉴定方面的使用受 到了一定的限制。 4 中国农q p 科学院硕十学位论文 第一章绪论 1 2 2d 指纹图谱分析用于细菌的分类和鉴定 d n a 序列的碱基排列顺序可以用于微生物的系统发育和分类地位的研究，基于基因组和功能 基因序列的特点建立的r a p d 、r f l p 、a f l p 1 6 s 一2 3 sr d n a i g s 等长度多态性指纹图谱分析方 法，已广泛应用于细菌的分类和鉴定中。 使用不同的引物以细菌基因组d n a 为模板进行p c r 扩增，然后对扩增产物进行酶切和电泳 ( 各种不同电泳条件、电泳介质) ，不同的属、种甚至同种的不同菌株可呈现出不同的图谱多态性， 好象人的指纹一样，通过软件分析与数据库中的指纹图谱比较，找出最接近的谱型确定细菌的分 类地位。下面介绍几种常用的指纹图谱分析方法 1 2 2 1 从m ( r a n d o ma m p l i f l e dp o i y m o r p h i od m ) 随机扩增多态性 1 9 9 0 年建立的采用核苷酸序列的随机引物进行基因组d n a 扩增，非特异性引物可以结合在 模板d n a 的多个位点，产生多个p c r 产物。采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开，将每株菌在每 条引物下扩增后产生的图谱合成为针对某一株菌的单一图谱，再通过软件进行聚类分析。细菌种、 株间基因特异性可通过获得d n a 片断大小、数量以及条带强度来确定。r a u lr i v a s 等( 2 0 0 2 ) 用 一对来自1 6 sr r n a 基因的引物进行r a p d 扩增，产生了c l