荧光定量PCR检测项目.ppt

荧光定量PCR检测项目 HBV DNA定量乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐药HCV RNA定量病毒性脑炎 实时荧光定量PCR方法 TaqMan法 方法 TaqMan法TaqMan 水解型杂交探针 5 端标记有荧光报告基团 Reporter R 如FAM VIC等3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 探针完整 R所发射的荧光能量被Q基团吸收 无荧光 R与Q分开 发荧光Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探针 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer TaqMan Probe R Q Taqman实时PCR的反应过程 Displacement 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer R Q Hydrolysis 5 3 5 5 3 5 Q R PolymerizationCompleted 5 3 5 5 3 5 R Q 每扩增一条DNA分子 释放一个荧光信号 可以在循环过程中任一点检测荧光 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理实时原理 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理定量原理 如何对起始模板定量 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 介绍三个概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 扩增曲线 荧光阈值 荧光信号阈值 threshold 前15个循环信号作为荧光本底信号 baseline 即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置 原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 并且保证回归系数大于0 99真正的信号 荧光信号超过域值 Ct值 Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Ct值的重现性 Ct值的特点 相同模板进行96次扩增 终点处产物量不恒定 Ct值则极具重现性 定量原理 理想的PCR反应 X X0 2n非理想的PCR反应 X X0 1 Ex nn 扩增反应的循环次数X 第n次循环后的产物量X0 初始模板量Ex 扩增效率 定量原理 在扩增产物达到阈值线时 XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量 在阈值线设定以后 它是一个常数 我们设为M方程式 1 两边同时取对数得 logM logX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 logX0 log 1 Ex Ct logM 3 Log浓度与循环数呈线性关系 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 标准曲线 模板DNA量越多 荧光达到域值的循环数越少 即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 根据样品Ct值 就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的C t 值通过标准曲线由未知样品的C t 值推算出其初始量 绝对定量 标本采集和运送 血液标本 用2ml真空采集管或1 5ml高压灭菌离心管采集血液标本 血标本采集后在2小时内送达实验室 HCV采用EDTA抗凝的血浆 离心 检验单与标本一道 后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1 5ml的离心管中 脑脊液 由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检 用于临床标本采集的容器如试管或离心管 均应使用前高压灭菌和密封标本采集后 应尽可能快的送至实验室 如运送时间需2小时以上 必须用冰盒送至实验室 标本中如加入了适当的稳定剂 如用于RNA测定加入4mol L异硫氰酸胍盐 GITC 的血清 浆 标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等 则可在室温下运送或邮寄 注 RNA采用EDTA抗凝的全血标本 抗凝后6小时内分离血浆 如使用血清标本则尽快 2小时内 分离血清 严禁使用肝素抗凝 定量检测的临床意义 治疗前进行病毒定量检测 指导选择抗病毒药物 避免盲目用药 治疗后定量PCR直接准确地测定体内病毒数量 有助于疗效的判断 怀孕前进行定量PCR测定 有助于选择有利的怀孕时机 HBV基因分型 HBV基因型是根据HBV病毒核酸异源性 8 进行分型分为A B C D E F G H等8种亚洲主要为B型以及C型感染HBV后的临床经过与不同基因型有关 HBV基因型的临床意义 HBV标志物清除与B基因型相比 C基因型有更高的HBeAg阳性率 分别为16 与53 基因型的自发性HBeAg清除要比C基因型早10年 并且在HBeAg清除后 肝脏生物化学指标持续正常 病毒致病性HBsAg阳性者中 C基因型比B基因型的肝功能异常更为常见 C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重 乙型肝炎的病程及转归亚洲无症状HBV携带中 与B基因型比较 C基因型在肝硬化及50岁以上的肝细胞癌患者中比例较高 而B基因型与50岁以下 特别是35岁以下的肝细胞癌患者有关 药物敏感性给予干扰素治疗时 B基因型的完全应答率达到C基因型的3倍HBeAg阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时 发现B基因型患者的HBeAg HBeAb转阴率达到C基因型的两倍 HBV不同基因型比较 B型C型流行性低高HBeAg阳性率低高HBeAg自然清除时间短长HBVDNA载量低高致病性轻重HCC发生率低 低年龄组高 高 高年龄组高 干扰素治疗完全应答率高低抗病毒治疗效果好差肝癌手术治疗预后好差癌栓栓塞治疗效果好差 注意事项 在病毒定量 103时 检测基因分型更有意义可能出现分型结果出现阴性 排除本身病毒量低的原因外 患者HBV基因型可能为非B C型 HBV 拉米夫定 拉米夫定 Lamivudine Heptodin 有效 核苷类高效抗乙肝病毒药物 可迅速降低HBV DNA的滴度 改善肝脏组织的病变 还可能阻止纤维化的进程 终止肝硬化的发展 耐药 长期服用 会引起HBV基因突变 造成HBV对药物敏感性大大降低 从而血清中HBV复制恢复活跃 滴度升高 耐药机理 HBV聚合酶中Y 酪氨酸 M 蛋氨酸 D 天门冬氨酸 D 天门冬氨酸 变异毒株的生物特性 对拉米夫定抗病毒效应的敏感性降低至1 300 DNA减少仅1 7 临床症状 血清ALT水平暂时上升 HBV DNA的浓度上升 并有轻度乏力 恶心等肝脏炎症损伤加剧等症状 I 异亮氨酸 V 缬氨酸 拉米夫定耐药性 发生率 治疗慢性乙型肝炎6个月后出现耐药性 在亚洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定1年 对拉米夫定敏感性降低的病毒变异发生率达14 甚至可达39 定义 在持续治疗中血清HBVDNA再现耐药差异 检测灵敏度基础病毒水平是否多次 多种抗病毒治疗 拉米夫定耐药的临床意义 耐药后的临床情况 发生耐药变异后1 4个月内虽都有病毒再现 病人的情况也有可能大不相同 无症状变异病毒携带部分病人可能只是病毒再现 血清转氨酶持续正常 所以继续服药仍能抑制HBV野生毒株 携带变异毒株因其生活力低 因此并不会发病 野生毒株转换有一部分病人停用拉米夫定3 4个月后 变异