RP-HPLC柱前在线衍生法测定羊胎盘枸杞胶囊中16种氨基酸的含量.doc

RP-HPLC柱前在线衍生法测定羊胎盘枸杞胶囊中16种氨基酸的含量RP-HPLC柱前在线衍生法测定羊胎盘枸杞胶囊中16种氨基酸的含量 游景水（汤臣倍健股份有限公司，珠海 519040）摘要 目的：建立一种采用反相高效液相色谱法测定羊胎盘枸杞胶囊中16种氨基酸的含量。方法：样品中的蛋白质在6mol/L盐酸溶液中水解为氨基酸，其中一级氨基酸用邻苯二甲醛（OPA）、二级氨基酸用9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）进行柱前在线衍生；用Agilent Hypersil AA-ODS柱（200mm2.1mm,5m）分离；用流动相(0.16%醋酸钠)进行梯度洗脱；经荧光检测器（FLD）检测(激发波长：340nm，发射波长：450nm；15min时，激发波长：266nm，发射波长：305nm)。结果：16种氨基酸在5pmol/ul250pmol/ul浓度范围内呈现良好的线性关系（r:0.999591.00000)（n=5)，平均加标回收率（n=9）为91.6%104.1%，相对标准偏差(RSD)为0.9%3.7%,最低检测限为0.4pmol1.2pmol。结论：该方法灵敏度高，具有良好的精密度与准确度，可以有效地控制产品质量。关键词 羊胎盘枸杞胶囊；柱前在线衍生；氨基酸；反相高效液相色谱法；邻苯二甲醛（OPA）；9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）；Online pre-column derivazation determination of sixteen kinds of amino acids in the capsule of sheep placenta and medlar by RP-HPLCYOU Jing - shui(By-Health Co.Ltd,Zhuhai 519040,China)Abstract Objective:To establish a method for determination of sixteen kinds of amino acids in the capsule of sheep placenta and medlar by RP-HPLC。Methods:Proteins in the samples were hydrolyzed into amino acids in 6mol/L hydrochloric acid solution， o-phthalaldehyde(OPA) and 9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC) were used as online pre-column derivative reagents for the primary amino acids and secondary amino acids respectively,and the chromatographic experiments were performed on Agilent Hypersil AA-ODS column（200mm2.1mm,5m).The 0.16% sodium acetate solution was used as mobile phase.Signals were detected by fluorescence detection (FLD)(excitation wavelength: 340nm,emission wavelength:450nm),exciation wavelength changed to 266nm and emission wavelength changed to 305nm at the 15th minute.Results:The concentration of Sixteen kinds of Amino Acids demonstrated good linearity in the range of 5 pmol/ul250 pmol/ul,（r:0.999591.00000),(n=5).The recoveries were 91.6%104.1% (n=9).The RSD were 0.9%3.7%.The limits of detection were 0.4pmol1.2pmol.Conclusion:This method has advantages of high sensitivity and precision and accuracy.Its suitable for the determination of sixteen kinds of amino acids in the capsule of sheep placenta and medlar.Keywords:Capsule of sheep placenta and medlar；Online pre-column derivazation；Amino acid；RP-HPLC； O-phthaldialdehyde (OPA)；9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC)。氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。对于含蛋白样品(保健食品、饲料和动物组织等)，先对样品进行酸水解或碱水解处理，得到游离氨基酸溶液，再进行测定。食品中氨基酸的测定（GB/T 5009.124-2003）是使用氨基酸自动分析仪进行测定,但该方法的缺点是分析柱易被污染、灵敏度较低（最低检出限为（10pmol)且分析时间长。本方法使用OPA、FMOC为衍生剂，对样品溶液进行柱前在线衍生，使用荧光检测器（FLD）检测，大大提高了检测灵敏度。1 仪器与试药1.1 主要仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（带荧光检测器），色谱工作站：Chem32；KQ-500E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；XW-80A型旋转混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）；BPZ-6090Lc型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。1.2 试剂OPA试剂（来源：安捷伦公司，批号：BCBF1444）；FMOC试剂（来源：安捷伦公司，批号：BCBD9246）；硼酸缓冲液（来源：安捷伦公司，批号：BCBF0657）；250pmol/ul氨基酸混合标准品（来源：安捷伦公司，批号：BCBD9914）；浓盐酸（优级纯）；苯酚（分析纯）；乙腈（色谱纯）； 甲醇（色谱纯）；四氢呋喃（色谱纯）；醋酸（分析纯）；三乙胺（分析纯）；无水醋酸钠（分析纯）。 2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil AA-ODS，200mm2.1mm,5m（安捷伦）；流速：0.45ml/min 柱温：40；进样量：1l；运行时间：30min流动相A(0.16%醋酸钠)：称取无水醋酸钠1.6g，加1000ml纯化水，搅拌使溶解，加入180l三乙胺，并混合，用2%醋酸调pH值至7.200.1，加入3ml四氢呋喃，混匀，用0.45m水相滤膜抽滤，即得。流动相B(0.16%醋酸钠)：称取无水醋酸钠1.6g，加200ml纯化水，搅拌使溶解，用2%醋酸调pH值至7.200.1，将此溶液加入至400ml乙腈和400ml甲醇的混合物中，混匀，用0.45m有机相滤膜抽滤，即得。流动相梯度程序：时间（min)流速(ml/min)流动相A(%)流动相B(%)0.00.45100017.00.45406018.00.45010018.50.80010023.90.80010024.00.45010025.00.45100030.00.451000进样器程序：1、从1号瓶中吸取5.0ul硼酸缓冲液；2、 从2号瓶中吸取1.0ul OPA试剂；3、从3号瓶（无盖）中吸取0.0ul水（清洗进样针）；4、从 X号瓶中吸取1.0ul样品；5、从3号瓶（无盖）中吸取0.0ul水（清洗进样针）；6、8ul原位混合；最大速度，6次；7、从4号瓶中吸取1.0ul FMOC；8、从3号瓶（无盖）中吸取0.0ul水（清洗进样针）；9、9ul原位混合；最大速度，3次；10、 进样.检测器：荧光检测器（FLD）检测器条件：0min时，激发波长：340nm，发射波长：450nm，PTM增益：1115min时，激发波长：266nm，发射波长：305nm，PTM增益：112.2 溶液的制备 对照溶液的制备:取250pmol/ul氨基酸混合标准品适量,用0.1mol/L的盐酸分别稀释至浓度为:5pmol/ul、10pmol/ul、50pmol/ul、100pmol/ul和250pmol/ul。 样品溶液的制备:精密称取羊胎盘枸杞胶囊约0.12g，置于25ml磨口的具塞比色管内，加6mol/L盐酸15ml，加入0.2g苯酚，用旋转混合仪和超声仪使样品充分分散并溶解，充氮气，盖紧塞子，置于1101的恒温干燥箱内，水解22小时，取出冷却，过滤，用纯化水冲洗比色管，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，精密吸取1mL于10mL容量瓶中，置于真空干燥箱内，于4050减压干燥（真空干燥箱内放入五氧化二磷作为干燥剂），干燥后残留物用0.1mol/L的盐酸定容至刻度，摇匀，经0.45m的微孔滤膜过滤，即得。2.3 线性试验和检出限试验 取上述5个浓度的对照品溶液，按方法进样，以浓度（X：pmol/ul）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。将信噪比（S/N）=3所对应的质量（pmol）确定为检出限。结果表明：16种氨基酸在5pmol/ul250pmol/ul浓度范围内呈现良好的线性关系（r:0.999591.00000)（n=5)，检出限为：0.4pmol1.2pmol。16种氨基酸的线性方程、相关系数和检出限。名称线性方程【Y：峰面积，X：浓度（pmol/ul）】相关系数（r）检出限（pmol）天冬氨酸Y=18.887X+26.390.999950.5谷氨酸Y=21.853X-16.050.999940.5丝氨酸Y=25.262X-26.460.999960.6组氨酸Y=14.036X+38.920.999780.8甘氨酸Y=22.876X+39.180.999650.6苏氨酸Y=19.940X+7.021.000000.6丙氨酸Y=23.335X-14.890.999980.6精氨酸Y=24.975X+25.500.999990.5酪氨酸Y=23.880X-11.900.999960.6缬氨酸Y=24.815X+39.300.999870.5蛋氨酸Y=29.005X-5.400.999910.5苯丙氨酸Y=23.976X+36.960.999630.5异亮氨酸Y=25.942X+53.870.999590.5亮氨酸Y=27.078X+12.870.999980.5赖氨酸Y=8.972X-1.240.999971.2脯氨酸Y=48.467X+41.030.999990.42.4 精密度试验 精密称取同一批号样品6份,照样品溶液制备方法操作,在上述色谱条件下分析测定,16种氨基酸的方法精密度RSD为:0.3%2.0%。结果表明,该方法具有良好的精密度。名称平均含量（mg/g）RSD（%）名称平均含量（mg/g）RSD（%）名称平均含量（mg/g）RSD（%）天冬氨酸22.651.5丙氨酸21.251.0异亮氨酸11.921.7谷氨酸44.141.3精氨酸12.900.8亮氨酸22.940.6丝氨酸7.740.3酪氨酸8.600.5赖氨酸13.871.8组氨酸4.141.8缬氨酸15.481.5脯氨酸16.130.5甘氨酸22.601.5蛋氨酸6.921.3总氨基酸含量（mg/g）251.441.4苏氨酸9.890.4苯丙氨酸10.272.02.5 加标回收试验精密称取上述已知含量的同一批号样品9份,分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入250nmol/ul氨基酸混合标准品40ul、50ul、60ul，照样品溶液制备方法操作,在上述色谱条件下分析测定,16种氨基酸的回收率为：91.6%104.1%,其RSD为:0.9%3.4%。结果表明,该方法具有良好的准确度。名称平均回收率（%）RSD（%）名称平均回收率（%）RSD（%）名称平均回收率（%）RSD（%）天冬氨酸91.61.1%丙氨酸95.00.9%异亮氨酸98.13.4%谷氨酸94.31.8%精氨酸96.33.1%亮氨酸94.73.3%丝氨酸98.32.7%酪氨酸99.72.4%赖氨酸99.22.7%组氨酸93.12.6%缬氨酸96.83.7%脯氨酸99.22.1%甘氨酸104.13.0%蛋氨酸100.82.3%苏氨酸100.33.1%苯丙氨酸98.72.4%2.6 空白干扰试验不加样品，完全按照样品溶液制备方法做空白试验,在上述色谱条件下进样，记录色谱图。结果表明，空白溶液对16种氨基酸的测定没有干扰。图1：空白图谱图2：16种氨基酸标准图谱注：1.天冬氨酸、2