山柰素与熊果苷对黑素细胞的酪氨酸酶活性、.doc

山柰素与熊果苷作用正常黑素细胞分子机制的对比研究商进1，辛燕2，冯红霞2，王震宇1(1.包头医学院第一附属医院皮肤科；2. 内蒙古包钢医院-内蒙古医学院第三临床医学院)摘要 目的：比较山柰素与熊果苷对人正常黑素细胞增殖、黑素合成及其酪氨酸酶活性的影响，为探索色素沉着性皮肤病的发病机制以及筛选新的治疗药物提供理论依据。方法：以不同浓度(10-100mol/l)山柰素与熊果苷干预培养的人正常黑色素细胞，检测两者对黑素细胞的黑素含量、细胞增殖及其酪氨酸酶活性的影响。 结果：对于黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的抑制作用，山柰素在各个浓度均优于熊果苷，并有显著性差异(P0.05)，山柰素在对细胞增殖抑制率无明显影响，而熊果苷在各浓度对细胞增殖抑制作用显著，且随其浓度增加，抑制率逐渐增强。结论：山柰素对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的抑制作用强于熊果苷，并对黑素细胞的增殖及形态无明显的负面影响，是一种有良好应用前景的酪氨酸酶抑制剂。关键词： 人正常黑素细胞 山柰素 熊果苷Kaempferol and Arbutin on tyrosinase activity , melanin synthesis and proliferation of melanocytesShangjin,Xinyan,Fenghongxia,Wangzhenyu(1.Department of Dermatology, Third Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, China；2.Department of Dermatology, Third Affiliated Hospital of Inner Mongolian Medical College, Baotou 014010, China )ABSTRACT Objective To get the molecular mechanism involved in kaemferol-induced tyrosinase activity of human normal cultured melanocytes. Method Human normal melanocytes have been cultivated successfully, then study the effects of various concentration of kaempferol and Arbutin upon proliferation, melanin synthesis and tyrosinase activity in melanocytes. Result Tyrosinase activity and melanin content of melanocyte are obviously inhibited by kaempferol of 10-100mol/l concentrations. Conclusions Kaempferol on inhibition of tyrosinase activity and melanin content of melanocyte than arbutin. Key word: Human Normal Melanocyte, Kaempferol, Arbutin作者单位：014010 包头 内蒙古包钢医院-内蒙古医学院第三临床医学院 通讯作者：辛燕，email:黄褐斑是一种临床常见的色素沉着性皮肤病,多见于东方中、青年女性，不仅影响容貌，还给患者带来诸多心理、生活方面的烦恼和痛苦，因其发病机理尚未完全阐明，目前的治疗仍是困扰皮肤科医生的难题之一1 ，熊果苷是国际上公认的黑素合成抑制剂和应用很广的美白剂2，山柰素（KPF）是对黑素细胞(MC)的酪氨酸酶(TYR)活性有明显的抑制作用，而且在高浓度时细胞长势良好3。我们用熊果苷与山奈素进行对比研究，目的是研究山奈素的作用是否优于熊果苷。同时观察二者对MC增殖及黑素合成、TYR活性的影响之不同。1.材料与方法1.1 材 料IBMX，佛波酯(TPA)，霍乱毒素(CT)，二甲基亚砜(DMSO)，左旋多巴(L-Dopa)，噻唑蓝(MTT)，KPF，熊果苷(Arbutin)均购自美国Sigma公司。DMEM/ HamF12培养基(1:1)购自美国Gibco公司。L-谷氨酰胺(L-Glu)，胰蛋白酶(trypsin)(1：250)，EDTA，TritonX-100溶液均购自美国Amresco公司。胎牛血清(特级)购自杭州四季青公司。青霉素、链霉素购自山东鲁南制药公司1.2 实验方法：1.2.1 细胞培养：参照辛燕3等的方法，采用DMEMHamF-12培养基（1:1）,添加10 % 新生牛血清,6. 8 mM L - 谷氨酰胺,50ngPmL TPA ,210ngPmL CT ,0. 1 mM IBMX ,青霉素100IUPmL及链霉素0. 1 mgPmL。标本均来源于内蒙古医学院三附院-内蒙古包钢医院泌尿外科知情同意地包皮环切术者包皮，年龄13-20岁。0.25 %的胰酶溶液,置4 冰箱中消化1620h。制成单细胞悬液培养。传代时在培养基中加入100gPmL 的基因素,作用3 d ,便可将成纤维细胞清除。取传2、3 代细胞,融合80 %以上时的MC用于实验,用含0.02 %EDTA 的0.25 %胰酶溶液消化细胞,MC 以8103 细胞/孔的密度接种到96 孔培养板中,每孔培养基200L 。1.2.2药物处理及实验分组：山柰素、熊果苷DMSO新鲜配制，其浓度均为0.1mol/l,避光保存在-20冰箱2周内使用，临用时用新鲜培养基调至终浓度。 实验设定山柰素与熊果苷的终浓度分别为1、5、10、25、50、75、100mol/l。实验分组：山柰素、熊果苷组，空白对照组（细胞无药组）。1.2.3 TYR活性测定4：冰PBS液洗涤2次，每孔加入1%的TritonX-100溶液50l，迅速置于-80。C冰箱冻存30min。在室温融化，加入10mmol/l的L-Dopa溶液50l，置37。C水浴中反应2h； 于490nm波长处比色，经空白孔调零，测各孔吸光度值，用L-Dopa的自动氧化校正。测试药物每一浓度设置3个复孔，取平均值。以不加测试药物体外培养的MC和只加2.5DMSO的细胞孔作为空白对照。TYR活性用每个加药处理组A490占空白对照组A490值的百分率表示。1.2.4黑素含量的测定5：黑素含量采用Virador等的方法测定。收集约107细胞，加入1mol的NaOH； 放于80。C水浴反应30min，再加入去离子水，使NaOH浓度调节为0.2mol；吸打均匀后，移入96孔板，每个浓度3个复孔；空白对照组共设3个复孔。选择490nm波长在酶标仪上测光吸收值，以空白孔调零；黑素含量用每个加药处理组A490占空白对照组A490值的百分率表示。1.2.5黑素细胞增殖的测定：采用MTT法6，在终止培养前4h每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，37。C继续孵育4h；弃上清液，每孔加入150l DMSO，振荡10min；选择490nm波长在酶标仪上测光吸收值，以空白孔调零。测试药物每一浓度设置3个复孔，取平均值。以不加测试药物体外培养的MC和只加2.5DMSO的细胞孔作为空白对照；黑素增殖抑制率活性用(1-每个加药处理组A490)/空白对照组A490*100%表示。1.2.6 统计学分析：统计分析过程使用SPSS13.0统计软件，所采集的实验数据均以平均数标准差表示。山柰素组与熊果苷、空白对照组间的均数比较采用多元方差分析。P0.05被认为有统计学意义。2.结果：2.1 KPF与熊果苷对TYR活性的影响：KPF对TYR活性有抑制作用，呈明显的量效和时效关系，随着KPF浓度的升高，对TYR的活性抑制率逐渐增强，随着作用时间的延长，相同浓度的KPF对TYR活性的抑制作用也加强。熊果苷对TYR并无明显影响，也无量效-时效的关系，在各浓度与KPF组比较均有显著性差异(P0.05)，特别是在72h，100moL时这种差异最为显著(P0.01)。(表1)。表1：KPF +IBMX与熊果苷+IBMX及IBMX在72h对TYR的影响浓度(moL) 药 物 分 组 均数标准差(%) F P10 山柰素 65.001.082 熊果苷 66.000.964 1.777 0.04825 山柰素 73.330.462 熊果苷 85.000.655 2.862 0.04350 山柰素 66.000.360 熊果苷 95.331.006 8.269 0.00875 山柰素 60.000.608 熊果苷 93.330.568 11.948 0.003100 山柰素 53.670.450 熊果苷 89.330.378 16.480 0.001 （注：代表P0.05，代表P0.01）2.3 KPF与熊果苷对黑素合成的影响：KPF对黑素含量有抑制作用，呈明显的量效-时效关系，随着KPF浓度的升高，对黑素含量的抑制逐渐增强，随着作用时间的延长，相同浓度的KPF对黑素含量的抑制作用也加强。熊果苷组对黑素含量也有抑制作用，也呈现量效和时效关系，但熊果苷对黑素含量的抑制强度明显低于山柰素实验组，经统计学分析后p0.05，且这种差异在两组100moL时作用48h最为明显p0.01（图1）。图1：KPF与熊果苷在48h对黑素含量的影响2.4 KPF与熊果苷对MC增殖的影响： KPF对MC的增殖抑制率无明显影响。在不同时间、不同浓度的KPF对MC的增殖抑制均较小，细胞长势良好，且略有促增殖作用，在作用48h 1、5、10moL时这种促增殖作用呈上长趋势，以后逐渐减弱。与熊果苷组比较，熊果苷对MC增殖的抑制作用非常明显，并呈现量效-时效关系，随着浓度增加抑制作用逐渐增强，在100moL时抑制作用最强，经统计学方差分析KPF组与熊果苷组在各浓度均有显著性差异（图2）。 图2：山柰素与熊果苷作用48h对MC增殖的影响3.讨论：山柰素是许多植物的活性成分之一，具有抗菌，抗炎及抑酶作用（抑制眼醛糖还原酶活性），并可提高小鼠的抗瘤性（抗皮肤癌），还可抗溃疡及抑制HIV蛋白酶的活性7。Kubo等8研究结果表明低浓度的KPF就可对蘑菇TYR的活性有明显的抑制作用。我们3先期的结果也表明KPF对TYR的活性有抑制作用,但它对MC的增殖有促进作用,而随着其浓度增高及作用时间的延长,MC的树突由多极向两极转化的趋势明显。熊果苷( arbutin) ,又名熊果甙，能有效地使乳酸脱氢酶（LDH）升高,MC黑素合成减少 ,并加速黑素的分解与排泄,从而减少皮肤色素沉积,祛除色斑和雀斑,是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料。但对TYR活性抑制不明显，细胞增殖抑制率显著增强,所以说熊果苷具有明显的细胞毒性9通过研究我们发现， KPF对MC的TYR活性有抑制作用，并且以浓度-时间的依赖方式下调TYR活性，在72h、100moL时对TYR活性的抑制作用最强；而熊果苷对于TYR的活性并无明显影响，并在各个浓度与KPF组比较有显著性差异(P0.05)，在100moL时两组的差异最强(p0.01)。KPF可抑制MC的黑素合成，呈现明显的量效-时效关系，随着KPF浓度的增加、作用时间的延长对黑素合成的抑制逐渐增强；熊果苷对MC的黑素合成也有抑制作用，也以浓度-时间的依赖方式下调黑素合成，但通过统计学分析，熊果苷的抑制程度远远的弱于KPF，在各个浓度均有差异(P0.05)，特别是在作用48h、100moL时最为明显(p0.01)。KPF对MC的增殖没有明显抑制，且略有促增殖的作用。而熊果苷则对MC增殖的抑制作用非常明显，并呈现量效-时效关系，随着浓度的增加抑制作用逐渐增强，在100moL时抑制作用最强，经统计学方差分析KPF组与熊果苷组在每个浓度均有显著性差异(P0.01)，而且实验中发现KPF在较高的浓度如500mol时,细胞长势仍然良好，当熊果苷干预组在50moL时就有大量MC细胞核固缩，并可见到细胞碎片。由此我们认为KPF与熊果苷相比，对MC的毒性小，负面影响少。而且KPF表现的促增殖作用与其抑制TYR活性的结果并不矛盾,有人研究表明，细胞增殖不一定与黑素含量成正比,而与MC树突的变化关系更为密切,两极MC的黑素合成量比多极MC低的多10，而黑素合成与TYR的活性呈正相关11.通过研究我们未发现KPF对于体外培养MC的细胞毒性作用，但对TYR活性有抑制作用，并可显著减少细胞的黑素合成量，与熊果苷相比，对细胞的增殖和形态无负面影响，对TYR活性及黑素含量的抑制作用强于熊果苷，是一种安全、比较理想的皮肤脱色剂。参考文献：1 Goh CL, Dlova CN. 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