（生物化学与分子生物学专业论文）决定ago2在pbody定位的关键氨基酸.pdf

摘要 摘要 r n a 干扰 r n ai n t e r f e r e n c e r n a i 是指在进化过程中高度保守的 由双 链 d o u b l e s t r a n d e dr n a d s r n a 诱发的同源m r n a 高效特异性降解的现象 a g o a r g o n a u t e 蛋白家族是含有p i w i 和p a z 基本结构域的一类成员数目较多的蛋白 家族 近年来研究发现a g o 蛋白家族的很多成员在r n a 干扰现象中有重要的作 用 在果蝇和人体细胞中 a 9 0 2 a r g o n a u t e2 为r n a 干扰机器r s i c r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x 的核一i i 部分 在r n a 干扰中发挥关键的作用 p b o d y c y t o p l a s m i cp r o c e s s i n gb o d y 最初在酵母中发现 在它细胞中与r n a 降解有关 目前已经发现很多和r n a 转录调控 r n a 降解以及相关的蛋白在 p b o d y 内聚集 现在 已有充分证据证明r n a i 体系和p b o d y 的形成有关联 例如r n a 干扰机器r s i c 上的核心蛋白a 9 0 2 也在p b o d y 内聚集 a 9 0 2 与m r n a 的结合会影响p b o d y 在细胞的存在状态等等 因为a 9 0 2 及p b o d y 和r n a i 现象紧密联系 所以研究a 9 0 2 在p b o d y 内的定位对于了解p b o d y 和r n a i 的 关系有重要的意义 本论文通过构建一系列的a 9 0 2 突变子使用荧光免疫染色方法来寻找影响 a 9 0 2 定位于p b o d y 的关键氨基酸 我们随机得到一个有六个氨基酸发生突变的 a 9 0 2 突变予 为a 9 0 2 g 3 2 w f1 2 8 l r 1 9 6 q p 4 5 8 s t 7 4 1 a 7 5 2 g 它完全不在 p b o d y 内定位 这六个氨基酸单点突变子都不能使a 9 0 2 完全定位于p b o d y 之 外 相对于其他的五个氨基酸我们发现a 9 0 2 上第7 5 2 位的s e r 对于a 9 0 2 在 p b o d y 的定位尤为重要 当a 9 0 2 第7 5 2 位s e t 突变为g l y 时 a 9 0 2 在p b o d y 的定位率大大降低 但是单独的第7 5 2 位s e t 的突变还不足以使a 9 0 2 完全不定 位于p b o d y 之外 实验发现它还需要第3 2 位g l y 1 2 8 位p h e 4 5 8 位p r o 突变 的协助 a 9 0 2 四点突变子a 9 0 2 g 3 2 w f1 2 8 l p 4 5 8 s 7 5 2 g 完全不在p b o d y 中 定位 说明四个氨基酸突变的协同作用决定了a 9 0 2 不在p b o d y 内聚集 关键词 a 9 0 2 p b o d y 荧光免疫染色 a b s t r a c t a b s t r a c t r n a i r n ai n t e r f e r e n c e r e f e r s t ot h ep h e n o m e n o no fs p e c i f i cm r n a d e g r a d a t i o ni n d u c e db yh i g h l yc o n s e r v a t i v eh o m o l o g o u sd s r n a d o u b l e s t r a n d e d r n a a g o a r g o n a u t e p r o t e i nf a m i l yi n c l u d e sm a n ym e m b e r s o ft h ep r o t e i n sw h i c h c o n t a i nt h ep a zd o m a i na n dp i w id o m a i n i nr e c e n ty e a r s i tw a sf o u n dt h a tm a n y m e m b e r so fa g op r o t e i nf a m i l yp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nr n a i a 9 0 2 a r g o n a u t e 2 a sa g op r o t e i nf a m i l ym e m b e r s w a sf o u n da tf i r s ti nt h ef l y i nt h ec e l l so ft h ef l y a n dh u m a n a 9 0 2i st h ec o r ep r o t e i no fr n a im a c h i n er s i c r n a i n d u c e d s i l e n c i n gc o m p l e x a n dp l a y st h ek e yr o l ei nt h er n a i p b o d y c y t o p l a s m i cp r o c e s s i n gb o d y w a sf o u n da tf i r s ti ny e a s ta n da s s o c i a t e d w i t ht h em r n ad e c a y m a n yp r o t e i n s w h i c hf u n c t i o ni nt h et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n r n ad e g r a d a t i o na n dt r a n s l a t i o n a lr e p r e s s i o n w e r e c o l o c a l i z e di n p b o d i e s n o w t h es u f f i c i e n te v i d e n c e ss h o wt h a tr n a is y s t e ma n dt h ep b o d y f o r m a t i o nw a sli n k e d f o re x a m p l e a 9 0 2w a sg a t h e r e dw i t h i nt h ep b o d i e s t h e c o m b i n a t i o no fa 9 0 2w i t hm r n aw i l la f f e c tt h ep r e s e n c eo fp b o d yi nc e l l s a n ds o o n b e c a u s ea 9 0 2a n dp b o d yw e r ec l o s e l yl i n k e dw i t ht h er n a i s t u d yo na 9 0 2 l o c a l i z a t i o ni np b o d yh a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rt h eu n d e r s t a n d i n gt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np b o d ya n dr n a i a n da l s ot h em e c h a n i s mo fr n a i w eo b t a i n e db yc h a n c ea na 9 0 2m u t a n t a 9 0 2 一g 3 2 w f12 8 l r l9 6 q p 4 5 8 s t 7 4 i a s 7 5 2 g w h i c hc o n t a i n ss i xa m i n oa c i dm u t a t i o na n dw a sc o m p l e t e l yo u to f t h ep b o d i e s i nt h i st h e s i s w ew i l la d d r e s st h ek e ya m i n oa c i d sw h i c hi m p a c to nt h e l o c a l i z a t i o no fa 9 0 2i np b o d i e st h r o u g hc o n s t r u c t i o no fas e r i e so fm u t a n t so fa 9 0 2 a n du t i l i z a t i o no fc e l l u l a ri m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g t h er e s u l ts h o w st h a ts i n g l e p o i n tm u t a n t s e x c e p t 7 5 2 g a n dm u l t i p l es i t em u t a n t s n o tc o n t a i n i n g 7 5 2 g d o n o ta f l e e tt h e l o c a l i z a t i o no fa 9 0 2i np b o d i e s c o m p a r e dt ot h eo t h e rf i v ea m i n o a c i d s t h e7 5 2s e ro fa 9 0 2i sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t o n l yt h e 7 5 2 gm u t a t i o nr e d u c e d s i g n i f i c a n t l yt h el o c a l i z a t i o no fa 9 0 2i np b o d i e s b u tt h e 7 5 2 gm u t a t i o na l o n ei sn o t e n o u g ht om a k ea 9 0 2c o m p l e t e l y d e t a c h e df r o mt h ep b o d y i ta l s on e e d st h e a s s i s t a n c eo f 3 2 g l y 1 2 8 p h e 4 5 8 p r o m u t a t i o n g 3 2 w f12 8 l p 4 5 8 s 7 5 2 g d o n t l o c a l i z ei n p b o d y t h i s a m i n oa c i d sc o n t r o lt h el o c a l i z a t i o no f a 9 0 2i nt h ep b o d y a 9 0 2 m u t a n t s h o w st h a tt h e s e k e yw o r d s a r g o n a u t e2 p b o d y c e l l u l a ri m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n g i i 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导f 独立完成的研冗成果 本人 在论文写作中参考其他个人或集体己经发表的研究成果 均在文中以适当 方式明确标明 并符合法律规范和 厦门大学研究生学术活动规范 试行 另外 该学位论文为 铆喙施 课题 组 的研究成果 获得 轩象弓q 课题 组 经费或实验室的资助 在 聊家以 实验室完成 请在以上括号内填写课题或课题组 负责人或实验室名称 未有此项声明内容的 可以不作特别声明 彳 声明人 签名 伽丢 尸明八k 佥召夕 h 似队 训 8 年 月嘲 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据 中华人民共和国学位条例暂行实施办法 等 规定保留和使用此学位论文 并向主管部门或其指定机构送交学位论文 包 括纸质版和电子版 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查 阅 借阅 本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士 硕士学位论文共 建单位数据库进行检索 将学位论文的标题和摘要汇编出版 采用影印 缩印或者其它方式合理复制学位论文 本学位论文属于 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文 于 年 月日解密 解密后适用上述授权 f 2 不保密 适用上述授权 请在以上相应括号内打 或填上相应内容 保密学位论文应是 已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文 未经厦门大学保密委员会审 定的学位论文均为公开学位论文 此声明栏不填写的 默认为公开学位论 文 均适用上述授权 声明人 签名 年月日 前言 前言 1 1a r g o n a u t e 蛋白家族 1 1 1a r g o n a u t e 蛋白家族简介 1 9 9 6 年 k a r e n 在研究拟南芥 a r a b i d o p s i st h a l i a n a 时发现一个新的蛋白 a r g o n a u t el 其突变会导致叶子表型变化 随后又发现a r g o n a u t e l 从属于一类新 的蛋白家族嘲o n a u t e 蛋白家族 l 人们已经发现a r g o n a u t e 蛋白家族成员在很 多真核生物中都存在 a r g o n a u t e 蛋白家族由一系列非常保守的蛋白组成 它的 成员大小一般为i o o k d 左右 不同的蛋白之间可能存在一些差异 a r g o n a u t e 蛋 白家族有两个基本的结构域 位于蛋白c 末端的为p i w i 结构域 有3 0 0 个非常保 守的氨基酸构成 p i w i 的确切功能尚不知晓 但研究发现 它具有r n a s e h 的核 酸外切酶活性 2 o 另外一个被称为p a z 的结构域 是人们在研究a r g o n a u t e 与d i e c e r 之间关系的时候发现的 p a z 也存在于d i c e r 中 它是一段由1 3 0 个左右的氨基酸 构成的保守序列 有推测p a z 可能和蛋白与蛋白相互作用有关 但是到目前为止 还没有得到确切证实 根据与拟南芥a g o l 或果蝇p i w i 蛋白的相似性 c a r m e u 等 3 1 将a 玛 眦u t e 蛋白家 族可分为a g o 和p i w i 两大类 后来y i g i t 4 1 对人 拟南芥 ce l e g a n s c b r i g g s a e 果蝇等a r g o n a u t e 进行比较 提出了第三个亚家族 又称第三组a r g o n a u t e 目前己证明许多a g o 亚家族成员与r n a 干扰相关 1 9 9 9 年 t a b a r ah 和 s a r k i s s i a nm 在线虫中发现了r d e 1 在r n a i 中具有重要的作用 它的突变子导致细 胞中的r n a i 作用不能进行 r d e 1 是a g o 蛋白亚家族的成员 5 随后人们陆续从 其它生物中发现a g o 蛋白亚家族的其他成员在r n a 干扰中也是必须的 它们协同 小分子r n a 在转录 转录后以及翻译水平上特异的控制基因的表达 p i w i 亚家族的成员的主要功能与发育和生殖特异性有关 如生殖细胞的保持 等 另外 它们还在干细胞的自我更新中发挥重要作用 例如 果蝇生殖细胞中 表达的d m p i w i 如果突变会导致精子发育不正常 另外小鼠的p i w i 蛋白家族成 员m m m i l i 在精母细胞中表达 它的敲除会导致精子形成的缺陷以及无精症 函7 1 另外 人的p i w i 蛋白h i w i 的高表达不仅和精母细胞瘤有关 还与胃癌等软组织 瘤有关f 3 o 最近的研究发现 p i w i 亚家族成员与一类在生殖细胞专一表达的小 r n a 相互作用 例如来源于斑马鱼的p i w i 成员z i w i 与约2 9 n t 的p f i r n a 相互作用 决定a 9 0 2 在p b o d y 定位的关键氨基酸 此作用对生殖细胞的维持以及生殖细胞转座子的沉默有重要作用 而小鼠中的精 子发生和转座子的抑制需要p i w i 亚家族成员m i w l 2 关于p i w i 亚家族成员的具 体功能还需要进一步的研究 9 1 a r g o n a u t e 的第三个亚家族为蠕虫所特有 这类a r g o n a u t e 亚家族成员主要特点 是不含有核酸酶活性 蠕虫进化了一批不含核酸酶活性的a g o 蛋白成员 在线虫 c b r i g g s a e 发现的第一种a g o 蛋i 刍c e r d e 1 就是第三类a g o 蛋白成员 此外这个亚 家族还有两个成c e p p w 1 与c e p p w 2 可能在线虫的生殖细胞中参与r n a 干扰 作用 在蠕虫中 要使r n a 干扰效应同时在生殖细胞和体细胞中丧失 则需要同 时突变六个a g o 蛋白 这六个蛋白都是第三个亚家族成员0 1 本论文主要研究a 9 0 2 在p b o d y l 勾的定位 下面就简要介绍一下a 9 0 2 及p b o a y 的研究进展 1 1 2a 9 0 2 的发现 a 9 0 2 由s c o o t m 研究小组首次从果蝇的细胞中分离得到 1 0 1 s c o o t m 研究小 组用d s r n a 刺激的果蝇的s 2 细胞 随之从中分离出r n a 干扰剪切复合体 r i s c 在对r i s c 的成分进行分析的时候 他们发现一个与r d e 1 结构和功能类 似的蛋白 5 1 鉴于此前在果蝇中已发现了a g o l s c o o t m 就将此蛋白命名为 a r g o n a u t e 2 虽然果蝇中含有a g o i a 9 0 2 p i w i 和s t i n g 四个a r g o n a u t e 蛋白 家族的成员 但是s c o o t m 的研究发现果蝇的r i s c 中只含有a 9 0 2 人的a 9 0 2 又称为e i f 2 c 2 基因全长为2 5 8 0 b p 编码8 6 0 个氨基酸 a 9 0 2 同其他的a g o 蛋白一样 都含有p a z 与p i w i 结构域 1 1 3 a g o 蛋白的结构 目前 还没有报道阐明a 9 0 2 的完整结构 但是人们已经发现a g o 蛋白家族 的其他成员的结以及a 9 0 2 的部分结构域的结构 这对于人们研究a 9 0 2 的功能 提供了很好的启示 2 前 1 1 31p向偿向 中 蛋白的结构 v j o c o c c u r i o s u s r i o s u s a g o m r i o s z s 叶 的a g o 蛋白含有基本的四个结构域 分别为n 术端 p a z 结构 域 中 叫结构域 p a z 鲒构域川 图 n 末端结构域由四个b 片层 二个n 螺 旋 曲个1 3 转角和一个绳状的结构组成 p a z 结构域是由1 3 折叠和 螺旋所组成 的中间有个裂缝的桶装结构 目前的研究透露卅p a z 结构域和r i s c 复合体中 的s i r n a 相互作用 p a z 结构域为r n a 结合部位 它的结构中心为个裂口 这个裂u 由一些保i 1 氨基酸组成 它和单链的s i r n a3 端相瓦作用 中 日 结 构域由 t t gbh 层和转角构成 p i w i 结构域在p a z 结构域的下力 晶体学 结构表明了p i w 结构 p 心和r n a s e h 的催化活性结构非常相似 图2 结构 学分析与实骑表明 p i w i 具有r n a s e h 活性 j b a 二 l j e 二j 亟 豆面 躅1 p f u r i o s u s 中a g o 的晶体结构 a p u r i o s 中的a g o 蚩自立体结构h 监色为n 末端 红色为p a z 结构域 绿色 中可结 q 域 紫色为p i w 结构域 黄色的山些 角n b p 向r i o s s 中的a g o 蛋白线性结构目 菇毋 决定a 9 0 2 在pb o d y 定位的共 氩 髓 乱 a r g o n a u t e p i w i r n a s eh r n a s eh i t 图2 a g o 的p i w l 结构域与r n a s e h 催化活性部位比较 1 1 3 2p a z r n a 复合体的结构 s o n g 在2 0 0 3 年发现丁果蚝a 9 0 2p a z 结构域的结构 并提出p a z 结构域可 能是结合r n a 的结构域 s o n g 川带p a z 结构域的融合蛋白证实了p a z 结构域 可以和单链或取链的s i r n a 结合 不过复合体的有效的 f 臣成则需要r n a3 端 有2 个突出的碱蟮廿 k c q i o n g 等人报道了p a z 结构域与一个含有九个碱基的 r n a 5 一c g u g a c u c u 一3 结合的晶体结构模型 这个柬源丁一个自身互 补的s i r n a 的小r n a 两端都可以和p a z 结构域结合 p a z 结构直接结合r n a 的足个出o 折盎和 螺旋组成的口袋状结构 这个n 袋结构结合r n a 主要足 靠氢键和静电作辟i 束实现的 在口袋结构的内部 有人量的芳香类和疏水的氨基 酸残基包含其 其中 此氨基酸残基和此s i r n a 的3 端结合相关 如f 2 9 2 y 3 0 9 l 3 3 7 h 2 6 9 y 2 7 7 k 3 1 3 y 3 1 4 等 i 这些氨基酸城基在a g o 家族中 非常保奇 它们的点突变可咀导致p a z 结构域发生不利丁s i r n a 结合的折叠 在返口袋结构的外面环绕着些非常保守的氪基酸 尽管和r n a 结合没有直接 的联系 然而它们是维持口袋内部疏水环境所必须的 与s i r n a 3 端相比 p a z 结构域对于5 端的结合则不是很牢固 图3 前 u c s i a 6 拓 凌 鬃 i 未蕊 图3p a z b l n a 复合体的结构模型 a 复台物中的 补的舣链s i r n a 它的5 和3 并有2 个核苷酸残基的末端突 d l b 两个p a z 结f q 域分别与s i r n a 的两端结合 c 为b 所示结构的填克模型 d 将c 旋转9 0 而柠刮的h 形 住此酗中 s i r n a 的两端分别被两个p a z 结陶域所锚定 1 2 a 9 0 2 与r n a 干扰 1 2 1a 9 0 2 与s i r n a 1 9 9 5 年 g u o 等在利用反义r n a 技术研究线虫 ce l e g a n s p a r l 基剧的功能时 发现了坫囚沉默现象 i 1 9 9 8 年华盛顿 耐基研究院的f i r e 洋细阐叫了这种现象 是山于在制备 f 义 反义r n a 时混入了少量的d s r n a 起的 并称这种现为r n a i r n a i 是指在进化过程中由高度保 r 的双链r n a 诱导同源m r n a 高效特异性降 解的现象i i 现已证明r n a 龇蒙广泛存在十人多数真核生物中 并与生物体内 很多功能相关 r n a i 起始于双链的s m a l lr n a s r n a 被d i c e r 酶加工为s i r n a 然后s i r 2 4 a 结 合y 1 d i c e r r 2 d 2 复台体上 l 奠a 9 0 22 t 核心的r i s c 的形成需要这个这个复合体的 帮助阻2 在粜蝇中 r 1 s c 足x 4 大约为5 0 0 k d 它是催化r n a 降解的蛋白复合 物 龠 a 9 0 2 v i g 等蛋白 从h e l a 细胞分离出的人r i s c 复台潍 其人小为1 6 0 k d 舍订单链的s i r n a e i f 2 c 2 a 9 0 2 r i s c 具有核酸内切酶的活性 1 r i s c 作为向导将s 1 r n a 指引到与它互补的序列l 并且还执 t s i r n a 同导链特异性切 割的功能 2 j 决定a 9 0 2 在p b o d y 定位的关键氨基酸 a 9 0 2 的p a z 结构域的晶体结构学分析确立了r i s c 的向导功能 在果蝇和人 细胞的刚s c 中都发现t a 9 0 2 的存在 人们发现乐细胞中含有a 9 0 2 的复合体中也 有s i r n a 的存在 p a z 结构域的r n a 结合功能的确定决定了r i s c 的向导功能 用生化方法及p a z 核酸共结晶手段证实了p a z 和核酸的可结合性 结合与序列有 关 r a n d 成功的演示了果蝇a 9 0 2 的p i w i 结构域具有与核酸外切酶h 几乎相同的 序列和二级结构 通过与其他的核酸内切酶比较发现 在p i w i 结构域有三个镁 离子结合的氨基酸残基 a s p 9 6 5 g l u l 0 1 6 a s p l 0 3 7 这三个氨基酸残基处于 催化活性中心部位 并且用结构学和点突变的方法从p y r o c o c c u s f u r i o s u s 的a g o 也 发现两个a s p 的存在 这些数据暗示在果蝇中a 9 0 2 执行p d s c 的剪切功能f 1 1 a 9 0 2 有外切酶的功能 r a n d i 正实t a 9 0 2 是r i s c 发挥结合s i r n a 和剪切功能的蛋白f 2 2 r i v a s 用细菌表达人的a 9 0 2 h a 9 0 2 发现h a 9 0 2 识别单链s i r n a 的5 末端 并 且在在体外还可以和单链的s i r n a 结合 形成简单复合体 这个复合体能特异性 剪切m r n a 发挥r i s c 的功能 这些都证明了人的r i s c 的剪切功能就是f l 了h a 9 0 2 来执行的瞄j 2 0 0 5 年 r a n d 和他的同事提出t a 9 0 2 切割与引导连互补 a n t i g u i d e 的s i r n a 单链激活r i s c 的机理 在果蝇中 s i r n a 双链结合a 9 0 2 从而形成r i s c 激活的 r i s c 通过碱基配对定位到同源m r n a 上 并在距离s i r n a 3 端12 个碱基的位置切 割m r n a 在这个过程中 a 9 0 2 依靠s i r n a 其中一条链去寻找互补的m r n a 链 这条链为s i r n a 的引导链 然后利用自身的核酸外切酶活性其进行切割 在果蝇 s 2 细胞提取物q b s i r n a 两条链都会与a 9 0 2 进行结合 与引导链相互补的s i r n a 链 会作r i s c 的底物被a 9 0 2 切割 切割的位点是短链5 的第九个碱基 实验表明 当这第九个碱基发生修饰的时候 与引导连互补的s i r n a 被a 9 0 2 切割的效力大大 降低 在这一过程中 r a n d 并没有发现a t p 的参与 2 4 1 1 2 2a 9 0 2 与m i r n a m i c r o r n a 在生物体中 m r n a 的稳定性由很多不同的信号与特定的序列来调节 a r e a u r i c he l e m e n t s 坐落在细胞内很多瞬时存在的m r n a3 端不翻译的区域 u n t r a n s l a t e dr e g i o n 上 2 卯 a r e m r n a 的降解主要是由细胞内与a r e 结合的 6 前言 因子实现的 在这些a r e 结合因子中 有的能促进a r e r n a 降解 如 t r i s t e t r a p r o l i n t t p t t p 一个r n a b i n d i n g 蛋白 它含有两个锌指结构域 这 两个锌指结构域被认为是t t p 结合r n a 的部位 t t p 直接结合到m r n a 的 a r e f 2 6 还有一些a r e 结合因子可以增加a r e m r n a 的稳定性 如h u r 蛋白 m i r n a 是一系列非编码的双链的r n a 片段 在很多生物中都有发现 长度 一般为2 2 b p m i r n a 的一个特点是它的前体常形成分子内茎环结构 而且含有 大量的u g 碱基对 这个前体物经过核酸酶d i c e r 的加工形成成熟的m i r n a m i r n a 初始转录产物经过核酸酶的加工形成一个7 0 b p 的发夹结构的前体 2 7 1 这 个m i r n a 前体被d i c e r 切开发夹结构之后 就成为成熟的双链m i r n a 2 8 2 9 j 进一步的研究表明 成熟双链的m i r n a 和r i s c 形成复合物 最小的r i s c 复合体仅含有含有单链m i r n a l e t 7 和e i f 2 c 2 a 9 0 2 2 9 3 1 m o u r e l a t o s 在h e l a 细胞中发现了一些大小大约为1 5 s 的核糖体复合物 这些复合物中也发现了 a 9 0 2 与m i r n a 的存在 这个新发现的核糖体复合物还包含有g e m i n 3 和g e m i n 4 m o u r e l a t o s 从这个的核糖体复合物中鉴定了大约4 0 种不同的m i r n a 3 2 1 2 0 0 5 年j i n g 在h e l a 细胞中发现并阐明了m i r n a l 6 与a 9 0 2 等其他蛋白相互 作用共同降解t n f a t u m e rn e c r o s i sf a c t o r0 m r n a 的现象 m i r n a l 6 是一个 含有2 2 个核苷酸的小r n a 其中有八个碱基 u 丸认u a u u 和t n f a m r n a 的a r e 序列互补 通过r n a i 抑制m i r n a l 6 的前体 使m i r n a l 6 的表达量 大幅下降 但是t n f a m r n a 的稳定性有很大的提高 除了影响t n f a m r n a 的稳定性以外 j i n g 还证明了m i r n a l 6 还和c o x 2 m r n a 的稳定性有关 增加 h e l a 细胞中m i r n a 的量不会改变t n f m r n a 降解的程度 但在降解的过程中 t n f a m r n a 降解的速度会增快 增强m i r n a l 6 与a r e 的互补性也会增强 m i r n a l 6 对t n f m r n a 的作用效果 a 9 0 2 d i c e r r r p 为m i r n a l 6 降解 t n f a m r n a 所必须 j i n g 根据上述实验数据提出了m i c r o r n a l 6 降解含有a r e 的t n f m r n a 现象的可能机理 a 9 0 2 并不直接与a r e 相结合 而是通过t t p 与之结合 m i r n a l 6 并不直接与t t p 结合 它在细胞中可能通过a 9 0 2 和t t p 形成复合体 t t p 与a r e 的结合可能导致a r ee l e m e n t s 结构发生变化 使 m i r n a l 6 更易于和a r e 结合 同时 t t p m i r n a 复合体的产生也帮助了m i r n a 结合a r e 从而启动了降解 3 3 7 决定a 9 0 2 在p b o d y 定位的关键氨基酸 1 3p b o d y 1 3 1p b o d y 的发现 m r n a 的降解是细胞调控基因表达的一种重要方式 在酵母中m r n a 降解最 主要的途经是由它3 端p o l y a 缩短所引起 随后一些去帽化的蛋白如d c p l d e c a p p i n 9 1 或d c p 2 d e c a p p i n 9 2 去除m r n a5 端的 帽子 结构促使了 m r n a 的降解 其中 由d c p l 和d c p 2 的去帽化是降解的最关键的一步 因为 去帽化暴露了m r n a 上与m r n a 降解作用因子的结合位点 1 9 9 7 年b a s h k i r o v 报道了x r n l 一哺乳动物细胞质中一种非常重要的核酸外切酶高度集中在细胞 质中一种不连续分布的小体内 3 4 1 2 0 0 3 年 e y s t a t h i o y 在一个神经系统疾病的病 人身上检测到一个不知道功能的全新蛋白g w l 8 2 此后细胞质中含有g w l 8 2 的小体被称为g w 小体 不久人们就发现g w 小体就是x r n l 小体 2 0 0 3 年 r o yp a r k e r 等人在酵母中研究m r n a 降解中发现 引起和催化m r n a 去帽化的 蛋白d c p l 和d c p 2 等蛋白都集中在细胞质内的一种离散的小体中 在m r n a 的 去帽化之前抑制或阻止m r n a 的降解会减少细胞中此小体的数量或导致其消 失 r o yp a r k e r 随后的实验又发现了一些和m r n a 转换有关的蛋白集中在此小 体的上面 他们将此细胞内不连续分布的小体称为p r o c e s s i n gb o d y 又为p b o d y 也就是g w b o d y 它们是细胞中从5 到3 端m r n a 降解的重要发生地 5 0 1 目前 人们在已经在线虫 昆虫以及哺乳动物细胞中发现了p b o d y 多细胞动 物的细胞质很容易检测到p b o d y 的存在 在哺乳动物的细胞中 它们的直径大 概为1 0 0 到3 0 0 n t o 之间 在细胞质中呈现不连续分散的状态 1 3 2p b o d y 主要含有三种组分 随着研究的增多 人们发现p b o d y 是由m r n p 组成的含有r n a 降解和 m r n a 抑制两套机理的整合体 目前 虽然p b o d y 的具体成分尚不完全清楚 但是根据已有的发现可以将它的成分粗略的分为三类 在p b o d y 中 含有一组进化上非常保守的蛋白质 从酵母到哺乳动物都发现 了这组蛋白的存在 它们组成了m r n a 的降解系统 包括去帽化酶d c p l d c p 2 去帽化的激发蛋白p a t l e d c 3 s c d 6 l s m l p 7 的复合物 还有5 到3 的核 酸外切酶 x r n l 等 c c r 4 p o p 2 n o t 复合物也在p b o d y 内聚梨3 7 1 因为这 8 前言 些蛋白组成的系统和m r n a 降解有关 所以这些蛋白可以归为一类 免疫共沉 淀和酵母双杂交显示 这类蛋白之间普遍存在着相互作用 3 8 3 9 4 0 4 在哺乳动物的细胞中 p b o d y 还含有r i s c 的成分 a r g o n a u t e m i r n a e l f 4 e 的结合蛋白4 一e t 以及g w l 8 2 一种在m i r n a 介导的m r n a 剪切过程中与 m r n a 相结合的蛋白 4 2 4 3 1 p b o d y 内还另外一些r n a 的结合蛋白 如t t p b r f l c p e p 等 这些蛋白都与r n a i 或m i r n a 抑制相关 p b o d y 内同样存在m r n a 4 2 4 3 4 4 当将纯化的p b o d y 用r n a 酶处理的一段 时间 发现p b o d y 的结构在细胞中不复存在 4 3 j 这说明m r n a 是维持p b o d y 结构所必须要的 有推测细胞内未转录的m r n a 量的多少可能决定了p b o d y 的 大小和数量多少 当向酵母细胞中转入大量的不转录的外源m r n a 片段的之后 酵母细胞的p b o d y 的数量增多且形态变大l 4 4 j 1 3 3 p b o d y 与m r n a 降解 1 3 3 1p b o d y 是细胞中的a r g o n a u t e 2 a 9 0 2 主要聚集地 在r n a 干扰的系统中 a 9 0 2 是r i s c 的关键成员 2 0 0 5 g e o r g e 将a 9 0 2 与p b o d y 的标记蛋白g w l 8 2 d c p l d c p 2 共同转入人的细胞中 用免疫荧光 染色检测到a 9 0 2 与g w l 8 2 d c p l d c p 2 等蛋白在细胞的位置重合 这说明在 哺乳动物的细胞中 a 9 0 2 主要位于p b o d y 上 后来g e o r g e 又转入s i r n a 和它 所靶向的m r n a 发现无论有无s i r n a 与靶向的m r n a 细胞中a 9 0 2 的位置 都不会改变 但是如果用r n a s e a 处理细胞的时候 p b o d y 中则看不见a 9 0 2 的 聚集 4 5 1 3 3 1p b o d y 内的多种成分影响m r n a 降解 目前 虽然对p b o d y 影响m r n a 降解的确切机理还不是很清楚 但是目前 的一些发现还是证明了p b o d y 内的成分对r n a 降解起着较大的影响 免疫共 沉淀显示 在人的h e l a 细胞中 m r n a 降解的关键蛋白a 9 0 2 a g o l 和p b o d y 内的成分g w l 8 2 d c p l 等有直接的相互作用 4 2 4 5 4 6 4 7 1 并且 a 9 0 2 的p a z 结 构域的一些突变会使a 9 0 2 不定位于p b o d y 中h 2 1 在h e l a 细胞中 当用一种 s i r n a 特异的抑制g w l 8 2 的表达时 m i r n a 和s i r n a 对其靶向的m r n a 的降 9 决定a 9 0 2 在p b o d y 定位的关键氨甚酸 解的程度有大幅的减弱 在果蝇中的s 2 细胞中 对g w l 8 2 或d c p l 基因的抑制 会减弱m i r n a 对其靶向的m r n a 的降解 4 2 4 6 删 这些数据表明 p b o d y 内的 成份g w l 8 2 在基因降解中扮演一个很重要的角色 另外 在线虫中 一个存在于 类似p b o d y 的结构并和g w l 8 2 有很大序列同源性的蛋白 a i n 1 被报道了参 与m i r n a 降解作用 5 5 这些研究表明 p b o d y 中的多种成分和m r n a 降解相 关 1 3 3 3p b o d y 的结构与形成与r n a 抑制 1 3 3 3 1p b o d y 是一个动态的结构 p b o d y 不是固定不变的结构 它的大小 所含成分以及在细胞中数目的多少 随着细胞内或细胞外的环境的变化而不断变化 在不同的条件下 m r n a 和蛋 白可以进入和被释放出p b o d y l 3 7 3 8 4 1 通过观察发现 在一个完整的细胞周期中 p b o d y 的大小和数目是在不断变化的 与细胞周期其他时段相比 s 期末和g 2 期的p b o d y 外形会更大 数目也更多 同样处于扩增状态下的细胞中的p b o d y 的数目要多于静止状态下的细胞的所含的数目 在s c r e v i s i a e 中 细胞压力可以 导致p b o d y 的形成 3 5 j 1 3 3 3 2p b o d y 内的成分的相互作用辅助p b o d y 的形成 p b o d y 内有很多和r n a 降解有关的蛋白 这些成分很多之间存在着相互作 用 例如在s c r e v i s i a e 中 d c p l 和d e p 2n i 以相互作用 4 9 l 在人的细胞中 发现 一种由d c p l d c p 2 g e 1 r c k p 5 4 和e d c 3 构成的复合物 3 9 1 t t p 和u p f l 可以和d c p l d c p 2 g e 1 以及e d c 3 免疫共沉淀 4 9 1 这些相互作用的蛋白一般 都在r n a 降解中发挥作用 这些p b o d y 内蛋白结合在不同的m r n p 上 它们 的相互作用在某种程度帮助了m r n p 聚集成为p b o d y 1 3 3 3 3r n a 降解作用可能导致了p b o d y 的聚集 关于p b o d y 的形成的具体机理还需要继续探索 但是根据目前的发现 p b o d y 的形成和r n a 降解相关 一些和m i r n a 发挥作用有关的蛋白 g w l 8 2 g e l l s m l r c k p 5 4 e l f 4 e t 表达减少会导致细胞中p b o d y 的数目减少或 l o 刖舀 消失 阻断m i r n a 降解过程中的任何一步 将会导致p b o d y 数目的减少 5 0 j 在细胞中 当用特异的s i r n a 转入的外源基因时 p b o d y 的数目会明显增多 而 此将s i r n a 作用转入与s i r n a 不相应的外源基因的细胞后 p b o d y 的形态和数 目没有明显的变化 这些数据说明 细胞内p b o d y 的形成是r n a 干扰作用的 结果 5 i l a 9 0 2 和d i c e r 2 是s i r n a m i r n a 抑制作用诱导p b o d y 的生成时必不 可少的 5 2 5 3 但是这两种蛋白在p b o d y 中不是结构上所必须的 当用嘌呤霉素 处理敲除了a 9 0 2 和d i c e r 2 基因的细胞时 也可以看到p b o d y 的形成瞰j 1 3 3 4r n a 降解影响p b o d y 的外形 r n a 降解作用由s i r n a 或m i r n a 启动 s i r n a 是由d s r n a 经过d i c e r 加工 而成双链的s i r