（环境工程专业论文）农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究.pdf

农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 摘要 随着经济的发展 农业废物的排放也在急剧增加 作为农业废物资源化利 用技术之一的堆肥化处理技术进入了科学化的新阶段 为了改善该技术存在的 如历时时间长 肥效低等诸多不足 提高堆肥效率 提升产品质量 使之能大 规模推广应用 国内外研究者开展了大量研究工作 其中 限速有机物的降解 一直被认为是快速堆肥的关键 农业废物堆肥化中的限速有机物主要是指木质 纤维素 这类有机物结构坚硬 分解困难 与腐殖质产生有密切联系 尤其是 木质素 最难攻击且难以分离 其降解被认为是快速堆肥的关键 本文系统阐述了农业废物堆肥化中木质纤维素的降解及其微生物特性 运 用传统方法筛选出高效优势的木质素降解细菌 并研究了细菌对木质纤维素的 降解特性和初步的降解机理 从农林废物堆肥中分离得到一株细菌经鉴定为枯草芽孢杆菌 将该细菌用 于木质素类化合物利用 固态培养条件下考察其对木质纤维素的降解能力及产 酶特性 另外对发酵前后的稻草结构进行了红外光谱分析 结果表明 枯草芽 孢杆菌具有木质素降解能力 兼具低分子量木质素酚型 非酚型类物质的降解 能力 其对木质素降解是木质素过氧化物酶 锰过氧化物酶 漆酶 纤维素酶 和半纤维素酶共同作用的结果 在本实验条件下 培养3 0d 使木质素降解率达 9 4 7 同时对纤维素 半纤维素也有较高程度的降解 降解率分别为3 8 8 4 1 8 4 红外光谱分析结果表明 稻草木质素结构被破坏 枯草芽孢杆菌对木 质素各官能团的降解作用有所不同 关键词 堆肥 木质素 细菌 固态发酵 枯草芽孢杆菌 产酶 i l 硕上学位论文 a b s t r a c t t h em i s s i o n so fa g r i c u l t u r a la n df o r e s t r yw a s t ei n c r e a s e dd r a m a t i c a 儿yw i t h e c o n o m i cd e v e l o p m e n t t h ew a s t et r e a t m e n tt e c h n o l o g yo fc o m p o s t i n ge n t e r e da n e ws t a g eo fs c i e n c ed e v e l o p m e n ta sat e c h n o l o g yo fa g r i c u l t u r a la n d f o r e s t r yw a s t e u t i l i z a t i o n i no r d e rt o i n l p r o v et h ed i s a d v a n t a g eo fc o m p o s t i n g i n c r e a s et h e c o m p o s te f n c i e n c y a n dm a k ei tc a nb eu s e di nl a r g es c a l e m a n yr e s e a r c h e r sa th o m e a n da b r o a dc a r r i e do u tal o to fr e s e a r c h e s t h eb i o d e g r a d a t i o no fl i m i t ss p e e d o r g a n i cc o m p o u n di s c o n s i d e r e da st h ek e yo fc o m p o s t i n g i na g r i c u l t u r a la n d f o r e s t r yc o m p o s t i n g t h el i g n o c e l l u l o s ei st h em a jo ro r g a n i cc o m p o u n dt h a tl i m i t i n g c o m p o s t i n gs p e e d t h i so r g a n i cc o m p o u n dh a sh a r ds t m c t u r e a n di s s e p a r a t e d d i f j f i c u l t l y e s p e c i a l l y t h el i g n i n i t i sc o n s i d e r e dt h ek e yo ff a s tc o n l p o s t i t s d e g r a d a t i o ni se s s e n t i a lf o rt h eo p e r a t i o no fc o m p o s t i n g i nt h ep a p e r l i g n o c e l l u l o s e sb i o d e g r a d a t i o na n di t sm i c r o b i a lc h a r a c t e r i s t i c s d u r i n gc o m p o s t i n go fa g r i c u l t u r a lw a s t e sw e r ee x p o u n d e d t h r o u g ht h et r a d i t i o n a l m e t h o d w es i e v et h eb a c t e r i a st h a th a v eg o o da b i l i t yo fl i g n o c e l l u l o s e sd e g r a d a t i o n w es t u d i e dt h ec h a r a c t e r i s t i ca n dt h em e c h a n i s mo fl i g n o c e l l u l o s e sd e g r a d a t i o nb y b a c t e r i a si ns o l i df b r m e n t a t i o n as t r a i no fm i c r o o 玛a n i s mw a si s o l a t e df r o mt h ea g r i c u l t u r a lw a s t ec o m p o s t i n g a n dw a si d e n t i 6 e da sb a c i l l u ss u b t i l i s t h i ss t r a i nw a sf o u n dt ob e c 印 l b l eo f u t i l i z i n gs e v e r a ll i g n i nm o d e lc o n l p o u n d s i n d i c a t i n gt h a tb s u b t i l i sh a dt h ea b i l i t y t od e c o m p o s et h eh y c r o x y b e n z e n ea n dn o n h y d r o x y b e n z e n el i g n i nc o m p o u n d so fl o w m o l e c u l a rw e i g h t b s u b t i l i sc o u l da l s 0 d e g r a d en a t u r a lr i c e s t r a wl i g n i nw i t ht h e r a t eo f9 4 7 a f t e r3 0d a y ss o l i d s t a t ef e 肌e n t a t i o n a tt h es a m et i m e t h ec e l l u l o s e a n dh e m i c e l l u l o s e sw e r ed e g r a d e dg r e a t l y w i t ht h ed e g r a d a t i o nr a t e so ft h ec e 儿u l o s e a n dh e m i c e l l u l o s e sb e i n g3 8 8 a n d4 1 8 4 r e s p e c t i v e l ya r e r3 0d a y s i n c u b a t i o n t h ea n a l y s e so fe n z y m ep r o d u c t i o nn l n h e rp r o v e dt h a tb s u b t i l i sh a dl i g n i n o l y t i c a b i l i t y f i v ek i n d so fe i l z y m e s 1 i g n i np e r o x i d a s e m a n g a n s e sp e r o x i d a s e l a c c a s e c e l l u l a s ea n dh e m i c e l l u l a s ew e r eb e l i e v e dt ob et h em o s ti m p o r t a n tc a t a l y z e si n b i o d e g r a d i n gp r o c e s s a n dt h e ya l w a y sw o r k e ds y n e r g i s t i c a l l y i na d d i t i o n t h e s t m c t u r eo ft h eu n t r e a t e ds t r a wa n dt r e a t e ds t r a ww e r ea n a l y z e dt h r o u g hi n f r a r e d s p e c t r o s c o p y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h es t r u c t u r eo fs t r a ww a sg r e a t l ya l t e r e db y b s u b t i l i sa n dt h ee f f e c to fb s u b t i l i so nd i f r e r e n tf u n c t i o n a ig r o u p so fl i g n i nw a s d i s s i m i l a r t 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 k e yw o r d s c o m p o s t i n g l i g n i n b a c t e r i a s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n b 口c i h h ss n b 嘲i 踮e m m e i v 硕士学位论文 插图索引 堆肥的好氧发酵过程 2 纤维素和木质素碳循环 9 苯丙烷单元基本结构 1o 木质素的六种基本结构 1 1 l i p 和m n p 的活性中心结构 1 7 木质素主要代谢途径 2 0 枯草芽孢杆菌产l i p m n p 及l a c 曲线 3 9 枯草芽孢杆菌产纤维素c m c 酶活及半纤维素木聚糖酶活曲线 3 9 枯草芽孢杆菌降解纤维素 半纤维素 木质素相对含量变化曲线 4 0 经枯草芽孢杆菌降解前后稻草的红外光谱图 4 2 v i i 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 1 1 1 1 1 1 1 j 1 j c j c r 图图图图图图图图图图 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 表1 1 表1 2 表1 3 表2 1 表3 1 表3 2 附表索引 好氧堆肥和厌氧堆肥的比较 3 l i p 的主要产生菌 1 6 m n p 的主要产生菌 1 7 筛选所得细菌对木质素类碳源利用情况 2 9 枯草芽孢杆菌在不同碳源上生长情况比较 3 8 经枯草芽孢杆菌固态发酵后木质纤维素各组分绝对含量变化 4 1 v i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均 已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担 作者签名 谚亏叉 日期 c 笤年幽f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借 阅 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 l 保密口 在年解密后适用本授权书 2 不保密团 请在以上相应方框内打 作者签名 力豸也 日期 p 矿年r 月r 日 名 幻初习吼p 屏朋j 咱 硕上学位论文 1 1堆肥概述 第1 章绪论 在人类的生产过程中 农林业生产是基础环节 在这一系列过程中产生了 大量的农林废弃物 这些农业固体废物主要包括农作物秸秆 蔗渣 稻壳 废 弃木材和竹材等 如果简单的将这些农林废弃物焚烧 势必会污染环境 随着 社会经济的发展和人口的增长 农业种植的规模也越来越大 因此产生的农业 固体废物也越来越多 由于没有迅速有效无害的处理农业固体废物方法 大多 数固体废物只能通过焚烧 掩埋处理 焚烧所产生的废气严重污染了大气 同 时固体废物中含有的大量元素脱离了土壤生态循环 长此以往 土壤将越来越 贫瘠 掩埋不仅占地大 选址难 成本高 难以回收其中的有用资源 而且填埋 过程中的渗滤液 恶臭和填埋气更会对周围环境造成危害 尤其是在人口密集 地区 昂贵的地价以及当地居民对环境卫生的要求都不适合填埋场的运行 农业固体废物的堆肥化不仅能够避免上述的缺点 还能够有效地利用固体 废物中的能量 堆肥作为一种保持良好环境效应的产物 具有生物处理的可持 续性和废弃资源的循环利用等特征 已被许多国家和地区所接受 成为处理有机 固体废物的有效方法之一 l 但是这种方法占用土地大 且堆肥周期长 堆肥周 期长的原因是由于在堆体中大都是作物秸秆等 其中木质纤维素是作物秸秆的 主要组分 木质纤维素包括木质素 纤维素和半纤维素 属于堆肥化中较难降 解的有机物 木质素作为木质纤维素的主要成分之一 含量十分丰富 降解困 难 这制约了农业固体堆肥的普及和发展 但由于堆肥化的优点远远多于它的 缺点 比如经过堆肥化处理后的垃圾可以杀死绝大部分的病原菌 杂草种子 且相对成本较低 有利于元素生态循环等等 因此为了更好地利用堆肥化技术 研究在堆肥过程中各微生物协同作用的机理 促进木质素的降解 对加速堆肥 过程 缩短堆肥周期 提高堆肥质量具有重要意义 堆肥是利用微生物人为地促进生物可降解有机物向稳定的腐殖质转化的微 生物反应过程 在生物化学反应过程中 垃圾中的有机物与氧气和细菌相互作 用 析出二氧化碳 水和热 同时生成腐殖质 用作土壤改良剂或肥料 堆肥 按需氧程度一般分为厌氧堆肥与好氧堆肥两种 厌氧堆肥是依靠专性和兼性厌 氧细菌的作用降解有机物的生化过程 此法有机物的分解速度缓慢 发酵周期 长 占地面积大 而好氧堆肥是依靠专性和兼性好氧细菌的作用降解有机物的 生化过程 由于嗜温菌对有机质的降解速度快 因此目前大多数堆肥采用的是 高温好氧堆肥1 2 j 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 1 1 1 高温好氧堆肥 好氧堆肥是在有氧的条件下 借好氧微生物 主要是好氧菌 的作用来进行有 机物质的降解 堆肥的温度高 一般在o 6 5 亦称为高温堆肥 2 一 此法有 机物的分解速度快 堆肥所需天数短 臭气发生量少 因此采用较多 在堆肥 过程中 生活垃圾中的溶解性有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物 吸收 固体和胶体有机物质先附着在微生物体外 由生物所分泌的胞外酶分解 为溶解性物质 再渗入细胞 微生物通过自身的生命活动一一氧化 还原 合 成等过程 把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物 并放出生物生长活 动所需要的能量 另一部分有机物转化为生物体所必需的营养物质 合成新的 细胞物质 用于微生物的生长繁殖 产生更多的生物体 图1 1 可以简单的说明 这个过程 一个完整的堆肥过程由升温 高温 降温和腐熟四个阶段组成 每个阶段 拥有不同的细菌 放线菌 真菌和原生动物 在每个阶段 微生物利用有机废 物和阶段产物作为食物和能量的来源 这个过程一直进行到稳定的腐殖物质形 成为i 匕 细胞物质 微生物生长 腐殖物质 堆肥有机物 0 2 微生物 氧化 c 0 2 h 2 0 n h 3 p 0 4 2 s 0 4 2 能量 上 上 释放能量 排入环境 转移为热 图1 1 堆肥的好氧发酵过程 1 1 2 好氧堆肥与厌氧发酵的对比 厌氧堆肥是依靠专性和兼性厌氧细菌的作用降解有机物的生化过程 厌氧 发酵技术在国外应用广泛 在处理含水率高 有机质丰富 来源广泛的畜禽粪 便 高浓度有机废水 污泥 厨余泔脚等有机垃圾上它更为有效 该法具有成 本低 处理负荷高等优点 不但可提供沼气作清洁能源 沼液和沼渣作肥料和 饲料 还能解决农村燃料短缺问题和有机垃圾引起的环境污染 4 1 国内外许多学者曾对运用好氧堆肥还是厌氧发酵争论较大 厌氧发酵自身 能耗少 不需外部供氧 但由于厌氧微生物繁殖较慢 减缓了有机物的分解速 度 因而厌氧消化需要较长的滞留期 处理周期长达8 0 1 0 0 d 需较大体积的厌 2 硕士学位论文 氧消化器 而好氧堆肥过程中 需要外界供给大量的氧气 菌体硕大 性能活 泼的嗜温菌群体以及原生动物就能较快地分解有机物 处理周期1 0 3 0 d 厌氧 发酵能够产生高热值的气体燃料一一甲烷 是人们利用生物能的一种重要手段 但底物分解不容易彻底 不能完全杀死病原细菌 有臭味且产气率受环境温度 影响较大 而好氧堆肥中有机物的分解比较彻底 它依靠生物氧化作用的热量 把温度升到7 0 左右 在这个温度下 几乎所有的致病菌和寄生虫卵都被杀死 同时利用各种微生物降解消化大分子有机物 去除恶臭 最后得到大量优质有 机肥料 两种方法对比见表1 1 表1 1 好氧堆肥和厌氧堆肥的比较 综合比较两种方法的利弊 目前国内外的堆肥通常是采用高温好氧堆肥技 术 1 1 3 堆肥的影响因素 有机废物的堆肥是多种微生物在适宜的条件下对复杂的堆肥原料中有机物 进行生物降解的过程 它是一个复杂的动力学和生物学过程 影响堆肥生物降 解过程 特别是主发酵过程 的因素很多 归纳起来主要有以下几方面 5 1 1 3 1 有机物含量 有机物是微生物赖以生存和繁殖的重要因素 堆肥化过程需要一个合适的 有机物范围 研究表明 在高温好氧堆肥中 堆料最适合的有机物含量为 2 0 8 0 5 1 当有机物含量过低时 堆肥过程产生的热量不足以提高堆体的温 度从而无法达到堆肥的无害化 产生的堆肥成品由于肥效低而影响其使用价值 同时也不利于高温分解微生物的生长繁殖 无法提高堆体中微生物的活性 最 终将导致堆肥工艺的失败 但如果有机质含量过高 堆肥过程中对氧气的需求 很大 而实际供气量难以达到要求 则堆体有可能进入厌氧状态而产生恶臭 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 同样不能使好氧堆肥顺利进行 1 1 3 2 碳氮比 c n 微生物生长需要碳源 蛋白质合成需要氮源 碳源是微生物利用的能源 氮源是微生物的营养物质 在堆肥过程中 碳源被消耗 转化成二氧化碳和腐 殖质物质 而氮则以氨气的形式散失 或变为硝酸盐和亚硝酸盐 或是由生物 体同化吸收 故就微生物对营养的需要而言 c n 是一个重要因素 6 有机物被 微生物分解的速度随c n 而变 微生物自身的c n 约4 3 0 用作其营养的有机物 c n 最好也在此数值范围内 当c 小为l o 2 5 时 有机物被微生物分解的速度最大 据加利福尼亚大学研究报道 当原料中c n 为2 0 3 0 5 0 7 8 时 其相应的堆肥 时间为9 1 2 d 1 0 1 9 d 和2 1 d 微生物每合成1 份蛋白质大约需要2 5 3 0 份碳 对 于堆肥来说 一般认为 初始c n 在2 5 3 0 1 或3 0 3 5 l 较为适宜 如果垃圾中c n 偏离正常范围 可通过添加含氮高和含碳高的物料加以调整 1 1 3 3 供氧量 通风是影响好氧堆肥过程和堆肥产品质量的重要因素 堆肥过程中 氧气 供应充足可以加速有机质分解 缩短堆肥时间 加速堆肥初期温度的上升速率 减少恶臭气体的产生 一般堆肥堆体中的氧气浓度低于1 0 耗氧微生物的分 解消化过程就会停止 因此 堆肥时必须保证充分供氧 堆肥化所需要的通风 量主要决定于堆肥原料有机物的含量 挥发度 可降解系数等 在机械堆肥生 产系统里 要求有5 0 的样深入到堆料各部分 以满足微生物氧化分解有机物 的需要 由于有机废物的好氧堆肥是十分复杂的生化反应过程 在反应过程的 不同阶段 通风的作用也不同 堆肥初期通风是为堆体内的微生物提供生命活 动所必需的氧气 堆肥中期起供氧 散热冷却作用 堆肥需要微生物反应所产 生的高温 但对于快速堆肥来讲 又必须避免长时间的高温 而温度的调节和 控制要靠通风供氧来解决冷却散热可通过装置向外排风时带走水分来实现 进 而通过水分的蒸发控制堆体达到适宜温度 堆肥后期通风的目的在于冷却堆体 的温度和带走水分 高温好氧堆肥的通气供氧方式主要有3 种 1 利用空气的自然扩散 即由 堆层表面将氧气扩散进入堆层中 2 通过抛翻或翻倒 把空气包裹到物料固体 颗粒的间隙中 3 向堆层中强制通风 1 1 3 4 含水率 水分为微生物生长所必需 微生物需要从周围环境中不断吸收水分以维持 其生长代谢活动 微生物体内水及流动状态水是进行生化反应的介质 固体废 物中的有机营养成份也只有溶解于水中才能被微生物摄取吸收 所以水分是否 4 硕士学位论文 适量直接影响堆肥的发酵速度和腐熟程度l 含水率是好氧堆肥化的关键因素之 一 从理论上讲含水率为1 0 0 时微生物有最大生物活性 但是实际上为了保证 向堆体供氧和其它条件的限制 需要把堆体的含水率控制在一定范围内 在堆 肥过程中 5 0 6 0 的含水率最有利于微生物分解 水分超过7 0 温度难以 上升 分解速度明显降低 因为水分过多 堆肥原料之间充满水将有碍于通风 从而造成厌氧状态 不利于好氧微生物生长并产生h 2 s 等恶臭气体 减慢降解 速度 延长堆腐时间 水分低于4 0 不能满足微生物生长需要 微生物的代 谢作用受到抑制 有机物难以分解 这主要是由于堆肥微生物分解有机物的活 动及生长繁殖活动受到养分的影响而缓慢或停止 因为微生物只能摄取其生存 必需的溶解性养料 在堆肥的腐熟阶段 稳定期 水分含量也应保持在一定水平 2 0 3 0 以利于细菌和放线菌的生长 加快后熟 同时也可减少施用有机肥 时产生的扬尘污染 1 1 3 5 温度 温度是堆肥过程微生物活动的反映 亦是堆肥得以顺利进行的重要因素 一个完整的堆肥过程由4 个阶段组成 即升温阶段 高温阶段 降温阶段和腐熟 稳定 阶段 初堆肥时 堆体温度一般与环境温度一致 经过中温菌l 2 d 的作用 堆温 即可达到5 0 6 5 在此温度范围内持续5 d 左右 堆肥中的寄生虫卵 病原菌和 杂草种子均被杀死 在堆肥化过程中 温度过高或过低都会影响微生物的生命活动 从而减缓 其反应速度 因为不同种类的微生物对温度具有不同的要求 一般而言 嗜温 菌最适温度为3 0 4 0 嗜热菌最适温度为4 5 6 0 温度超过6 0 即进入孢子 形成阶段 这个温度范围内孢子呈不活动状态 且孢子再发芽繁殖的可能性也 很小 因此认为 高温堆肥最好在4 5 6 0 之间进行 1 1 3 6 p h 值 在堆肥过程中 p h 值随着时间和温度的变化而变化 因而p h 值也是提示堆 肥分解过程的标志 p h 值并不影响堆肥化过程中有机质的降解 但是p h 值的大 小对微生物的生长有重要影响 适宜的p h 值可使微生物有效地发挥作用 而p h 值太高或太低都会影响堆肥的效率 8 一般微生物最适宜的p h 值是中性或弱碱 性 p h 值在3 1 2 之间都可以进行堆肥 研究发现 p h 值随时间和温度的变化而 变化 堆肥初始阶段 微生物繁殖很快 其产生的有机酸使堆物p h 值降低 低 的p h 值有时会严重抑制堆肥反应的进行 但随着堆肥过程的进行和温度的升高 有机酸逐渐挥发 同时含氮有机物质所产生的氨也会使物料的p h 值回升 最后 稳定在较高水平一般认为 堆制垃圾时p h 值在8 左右可获得最大堆肥速率 此范 5 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 围内可显著提高堆肥初期的反应速度 缩短堆肥达到高温所要求的时间 亦可 避免由于堆肥反应延缓所造成的臭味问题 1 1 4 堆肥中的微生物 研究表明 好氧高温堆肥是由群落结构演替非常迅速的多个微生物种群共 同作用而实现的动态过程 在该过程中每一个微生物种群都在相对较短时间内 适应生长繁殖的环境条件 并对某一种或某一类特定的有机质的分解起作用 同时影响周围的环境条件 其对环境温度的影响机理如下 在堆体中的微生物 当条件合适时 它们迅速地大量生长 形成了中温阶段的正反馈回路 即中温 微生物生长促进了温度升高 而温度升高也促进了中温微生物的生长 但当温 度不适合中温微生物生长时 就会形成负反馈 抑制了中温微生物的生长 中 温微生物渐渐停止生长 嗜热菌逐渐取代其主体地位 从而形成了高温阶段的 正反馈回路 依靠这种回路温度会最终稳定在一定的范围内1 9 1 尽管在堆肥过程 中会出现极端嗜热菌 但它们并不在自热过程中起作用 而有关温度和微生物 活性在自然堆料中的关系似乎也未涉及到极端的嗜热菌 微生物自身产生酶或 有机酸会对环境p h 值产生影响 微生物就是在这种适应和被适应的过程中生长 繁殖 分解有机物质 1 1 3 5 堆肥中的细菌 在好氧堆肥系统中 存在着大量的细菌 细菌在数量上通常要比体积更大 的微生物 如真菌 多得多 细菌凭借大的比表面积 可以快速将可溶性底物吸收 到细胞中 在堆肥过程中 细菌总数的变化趋势是高一低一高 堆肥初期 有 机废物中携带有大量的细菌 微生物分解有机质使堆温上升 此时 常温细菌 受到抑制 嗜温细菌活跃 当堆温升至高温阶段 只有少量的嗜热细菌可以活 动 但高温期过后 随着温度的降低 嗜温及常温细菌又开始活跃 使细菌总 数上升 嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物 a b d e n n a c e u r 等人 i o 的研究表明 在堆肥过程的初始阶段 嗜温细菌最为活跃 其数量为8 5 1 0 8 5 8 1 0 9 g 干物料 w d w 之间 随着垛温达到最大值 其种群数量达到最低 在降温阶段 嗜温 细菌的数量又有所回升 而在高温阶段的优势菌则主要是芽孢杆菌属 b 口c f j 的一些种 如枯草芽孢杆菌伊 s 甜6 f f 矽 地衣芽孢杆菌佃 办砌p 玎咖 行圳和环 状芽孢杆菌佃 c f 彤材肠刀砂 b e f f a 等人 1 1j 曾经在堆肥过程中的高温期筛选出嗜热 菌属 这些细菌能够在6 5 以上 甚至高达8 2 的垛温下生长 一些细菌 例如 芽孢杆菌 能够生成很厚的孢子壁以抵抗高温 辐射和化学腐蚀 1 2 因此芽孢 杆菌属p 口c f s 的一些种 例如枯草芽孢杆菌伊 j 6 f f 埘 地衣芽孢杆菌 俾 把 p z 咖 聊例和环状芽孢杆菌俾 c f c 口刀砂成为了堆肥高温阶段中的代表性 6 硕士学位论文 细菌 或是优势菌 放线菌是具有多细胞菌丝的细菌 因此它更像是真菌 在堆肥化过程中 放线菌可以分解一些纤维素 并溶解木质素 同时 它们比真菌能够忍受更高 的温度和p h 值 所以 尽管放线菌降解纤维素和木质素的能力并没有真菌强 但是它们在堆肥过程中的高温期却是分解木质纤维素的优势菌群 1 3 1 据研究 放线菌之所以降解木质素纤维素的能力低于真菌 可能是放线菌比细菌和真菌 的繁殖缓慢 在养分充足的时候在竞争中居于劣势 w a k s m a n 等 1 4 研究认为 诺卡氏菌伽d c a 砌矽 链霉菌西触p 幻聍吵c p s 高温放线菌伸p 肌d 口c 砌d 彬 c p s 和单 孢子菌阳f c r 0 肌d 刀d s p d 圳等都是在堆肥中占优势的放线菌 放线菌很少利用纤维 素 但它们能容易地利用半纤维素 并在一定程度上分解木质素 1 1 3 5 堆肥中的真菌 在堆肥化过程中 真菌对堆肥物料的分解和稳定起着重要的作用 真菌不 仅能分泌胞外酶 水解有机质 而且由于其菌丝的机械穿插作用 还对物料施 加一定的物理破坏作用 促进生物化学作用 与细菌相比真菌抗干燥能力强 但物料含水量大 通风不良时不利于真菌的生长和繁殖 嗜温性真菌地霉菌信e o 护f c 甜m 印 和嗜热性真菌烟曲霉向妒p g f 淞 加肌f 朋f 砂是堆肥生料中的优势种群 其他一些真菌 如担子菌p 口j f 讲d 以y c d f f 甩矽 子囊菌向j c d 力吵c d f f 疗砂 橙色嗜热子囊菌彻p 肌d 口j c j 口甜 口万f 妇c s 也具有较强的 分解木质纤维素的能力 l5 1 有的研究针对堆肥化中真菌群体落演替 将真菌分 为三个特征组 并指出利用复杂碳源 能力及耐受高温的程度是决定真菌在堆 肥中定殖的两个最重要的因素 第一组真菌包括中温类群 它们在堆肥的升温 的前几天很快被杀死 嗜热真菌和耐热真菌也被杀死 嗜热真菌在高温期降温 之后人无法定殖 是因为它们仅能降解简单碳源 而不能利用纤维素和半纤维 素 所以堆肥后期无法定殖 耐热真菌可以利用纤维素和半纤维素 所以在堆 肥后期可以继续存在 第二组真菌是在高温期结束后很快出现真菌 它们都能 很快利用纤维素和半纤维素且快速生长 第三组真菌在高温结束后一段时间堆 温下降阶段 它们在二次发酵对木质素的降解起着主要作用 研究显示i l6 1 温度是影响真菌生长的最重要因素之一 绝大部分的真菌是 嗜温性菌 可以在5 3 7 的环境中生存 其最适温度为2 5 3 0 但是 在堆 肥过程中 由于高温时间持续较短 在增强真菌降解能力的同时却不足以将其 致死 因此 高温意味着小群落的嗜热性真菌成为生物降解的重要因素 其他 影响真菌生长的重要因素包括 碳源 氮源和p h 值 通常较低的氮浓度是真菌 降解木质素的前提条件 但有时低氮浓度却会成为木质素分解的一个限制因素 多数真菌喜欢酸性环境 但实事上它们又都能在很广的p h 值范围内生存 1 7 1 8 l 7 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 总之 在有机废物降解过程中 真菌起着至关重要的作用 应调节堆肥物 料环境以促进真菌生长 1 1 5 堆肥化微生物学研究进展与发展趋势 1 1 5 1 堆肥化微生物学研究进展 目前堆肥化中微生物学研究主要有三个方面 一是采用传统的基于生理功能 的筛选方法从堆肥或其他生态系统中选育高效菌株 并可能通过菌种的遗传变 异或基因重组寻找高效菌株 开发适应性强 高效的堆肥菌剂 二是进一步研 究堆肥化中某些有机质的微生物降解机理 特别是较难降解的物质 如木质素 纤维素 半纤维素等 为菌剂开发 过程控制 腐熟度快速检测及堆肥技术的 推广应用打下生物学基础 国内外已提出了应用分子生物学技术动态研究微生 物群落的多样性 真实反映微生物的生存状态 利用这种新的研究方法和实验 技术对堆肥微生物进行全面和系统的研究 对于揭示堆肥的微生物学机理 改 革堆肥工艺有着重大意义 三是改善固体废物颗粒间隙微生物生长繁殖以及生 化降解反应的生态微环境 使之更有利于微生物对有机垃圾的分解反应 1 1 5 2 堆肥化微生物学发展趋势 作为目前研究的热点 堆肥微生物菌剂研究虽取得了不小的进展 出现了 不少成熟的产品 有些已经初步实现了工业的利用 但由于我国目前还未实现 垃圾分类收集 对于堆肥处理中高效多功能微生物菌剂的需要也就显得更为迫 切 不过这些研究只要还是集中在寻找各种菌株组合上 关于构建微生物混合 添加剂仍然缺乏系统的理论指导 尤其在对菌株之间相互作用的了解上 所做 的很多工作还都具有一定的特异性或偶然性 研究者需要在了解不同菌株特性 及相互关系的基础上 逐渐形成系统的微生物添加剂构建理论 堆肥化中限速有机物的降解一直被认为是快速堆肥的关键 也是高效复合 菌剂开发的理论基础 各有关方面虽然对堆肥化中纤维素的降解进行了多年的 研究并取得了一定的进展 但是对更难攻击的木质素的降解研究却因木质素结 构的过于复杂而徘徊不前 在其进一步用于实际堆肥化中针对以下几方面还有 待深入探索 木质素在堆肥过程中的降解机制研究 针对固态发酵 复杂堆肥 环境 探寻适合的酶活测定方法 运用现代生物学技术构建更多更加高效的降 解菌 探索木质素降解菌与其他生物类群的生态系统关系 尽可能的减小微生 物之间的拮抗作用 8 硕 学位论文 1 2 堆肥化中木质素的降解 1 2 1 木质素和纤维素的碳循环 木质纤维作为自然界中的主要有机物构成一年生植物量的1 3 多年生植物 量的1 2 在碳循环中起着重要的作用 如图1 2 所示 堆肥中木质纤维的主要结 构形式是纤维素约占4 0 半纤维素约占2 0 一3 0 木质素约占2 0 一3 0 尽管许多微生物能分解单独存在的纤维素 但由于在细胞壁中纤维素受到木质 素的保护 而木质素有完整坚硬的外壳 生物不易被微生物降解 1 9 因此纤维 素的分解受到限制 2 0 1 i f 维寮 p f 绷 寮术质素 jj j 惜 篮i i 喷 散乍野香族残余物 竹l 咙代谢 一 懈 停腐砬 卜 c o i c h 二 r 1 f i i 敢镐 己脯儡泥攥 泥嵌 i 一 图1 2纤维素和木质素碳循环 1 2 2 木质素的结构及性质 木质纤维素包括木质素 纤维素和半纤维素 木质素 1 i g n i n 与纤维素及半 纤维素共同形成植物体骨架 是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大天然 高分子材料 据估计全世界每年可产生6 0 0 万亿吨 2 1 1 木质素以衬质包裹纤维 素和半纤维素 且沉积或填充于纤维素构成的微晶纤维中 阻碍纤维素的降解 1 2 2 1 木质素的结构 对木质素结构的研究很早以前就开始了 其研究历史可以追溯到十九世纪 三十年代 但正规的化学研究是在1 9 3 0 年以后 而此前的研究主要是探索性的 研究工作 此后的研究随着新的检测设备不断出现和研究手段的进步 对木质 素的研究进入了一个实质性的阶段 提出了具有代表性的木质素结构模型物和 木质素衍生物合成过程 近几年来随着生物工程和遗传学的发展 对木质素的 结构的研究进入了全新的时期 由于木质素的结构复杂 目前对于其结构完整的结论还没有最终得出 一 般认为木质素基本的结构框架是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚 9 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 酚类三维网状高分子芳香族化合物 在植物体内以苯丙烷为主体的木质素主体 结构有三种 非缩和形结构 即愈创木基结构 松柏醇 紫丁香基结构 芥子醇 和对羟苯基结构 b 一羟基肉桂醇 如图1 3 所示 n o 仑c 一 对羟苯基结构 一c c 愈创木基结构 紫丁香基结构 图1 3 苯丙烷单元基本结构 从生物合成过程来看 这三种基本结构单元首先都是由葡萄糖发生芳环化 反应形成莽草酸 s h i k i m i ca c i d 然后由莽草酸合成上述三种木素的基本结构 最后再由这三种基本结构聚合形成植物体内分子量更大的一些基本成分 最常 见的有六种 见图1 4 1 2 引 这些基本成分再通过任意组合 共聚化后 形成具有 不均匀的 无旋光性的 交差键和与高度分散结构的聚合物一一木质素 它包 围着纤维素 和半纤维素一起填充于微原纤维之间 与细胞壁成分紧密结合 构成一体 防止过多水分和有害物质渗入植物细胞壁 对植物起支持和保护作 用 但另一方面 木质素与细胞壁紧密结合使其结构非常稳定 不易降解 另外木质素的结构单元在不同品种的植物及不同年龄的植物当中 其细胞 壁的形态 比例都各有不同 也给木质素结构的深入研究更增加了困难 在木质素研究过程中 由于提取出的木质的样本不同 同时木质素在提纯 和分离的过程中原有结构可能会被破坏而发生不同程度的缩合 降解 因此确 定木质素的准确结构很困难 木质素天然结构中 单元间主要联接方式是p o 4 和q o 4 约占5 0 左右 其它有代表性连接键有b 一5 b 一1 5 5 联苯型联 接等 l o 硕上学位论文 尊 o l li o h a i c h m e h c o h d m e b h c h o h i h c i i h c c h o h l 亡h 0 c h o ho h e 1 2 2 2 木质素的性质 c h 2 0 h f 图1 4 木质素的六种基本结构 h c 木质素的物化性质会因提取得方法不同而有差异 原本木质素是白色或接 近无色的物质但由于在分离 制备的过程中采用的方法不同 因此会呈现深浅 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 不同的颜色 例如由重氯甲烷甲基化后得到的木质素颜色呈白色 而酸木质素 铜氨木质素 过碘酸盐木质素的颜色较深 呈浅黄褐色或深褐色等 原本木质 素的相对分子量一般为几十万 而分离木质素因为在分离过程中会产生降解 缩合和变性等变化 因此它的相对分子量就要低的多 一般能达到几千到几万 木质素的相对密度大约在1 3 5 1 5 0 之间 测定是用不同的液体得到的数值也会 略有差异 木质素的光学特性是目前研究木质素结构较常用 较为有效的物理 学方法 在红外光谱上有明确的特征峰 波峰集中在1 6 1 0 1 6 0 0 c m 1 和 1 5 2 0 1 5 0 0 c m 属芳香环骨架结构 在紫外光谱上有明显的芳香环 共轭烯键 等吸收带 核磁共振法在研究木质素的结构方面也显示了巨大的威力 可以对 木质素上各种基团进行准确的定性和定量分析 由于分子大 相对分子质量 1 0 1 0 5 溶解性差 分子结构复杂而不规则 含有各种生物学稳定的复杂键型 没有任何规则的重复单元或易被水解的键 所 以微生物及其分解的胞外酶不易与之结合 对酶的水解作用呈抗性 是目前公认 的微生物难降解的芳香族化合物之一1 2 引 木质素分子结构中存在有芳香基 酚羟基 醇羟基 羰基 甲氧基 羧基 共轭双键等活性基团 可以进行氧化 还原 水解 卤化 硝化 磺化 酸解 醇解 烷基化 酰化 缩合或接枝共聚等化学反应 这些化学反应均为有效利 用木质素提供了良好的指导作用 另外利用可降解木质素微生物所产生的生物 酶活性的化学反应机理的研究有了长足 深入的进展 例如目前已发现的能有 效降解木质素的生物酶 主要是白腐真菌在降解木质素过程中产生的木素过氧 化物酶 l i g n i np e r o x i d a s e 即l i p 锰过氧化物酶 m n d e p e n d e n tp e r o x i d a s e 即 m n p 及漆酶 l a c c a s e 它们所产生的胞外酶作为高效催化剂参与反应 借助自身 形成h 2 0 2 靠酶触启动一系列的自由基链反应 先形成高活性的酶中间体 将 木质素等有机物 r h 氧化成许多不同的自由基 r 其中包括氧化能力很强的羟 基自由基 o h 实现对木质素的生物降解 2 4 1 1 2 3 堆肥化中木质素降解研究的重要性 农林废物中 木质素 1 i g n i n 与纤维素及半纤维素共同形成植物体骨架 是 植物的主要成分之一 木质素以衬质包裹着纤维素和半纤维素 且木质素沉积 或填充于纤维素构成的微晶纤维中 它是植物细胞胞间层和初生壁的主要填充 物 对植物起机械支持和传导水分的作用 并能抵御病虫害和微生物对植物的 入侵 2 5 1 其产量是仅次于纤维素的最为丰富的有机物 通常在木质细胞中占 1 5 3 0 木质素为结构复杂 稳定 多样的生物大分子物 不同植物中甚至相同植 物的不同部位木质素的分子结构均不相同 其主要的前体单元为愈创木基丙醇 1 2 硕士学位论文 松柏醇 紫丁香基丙醇 芥子醇 和对羟基苯基丙醇 对香豆醇 木质素结构单 元间以b o 4 q o 4 b 1 5 5 b b 等键连接 其中约6 0 为醚键 针叶 树的木质素主要由松柏醇的脱氢聚合物构成愈创木基木质素 阔叶树的木质素 由松柏醇和芥子醇的脱氢聚合物构成愈创木基紫丁香基木质素 而草本植物则 是由松柏醇 芥子醇和对香豆醇的脱氢聚合物和对香豆酸组成 木质素依靠化 学键与半纤维素连接 包裹在纤维之外 形成纤维素 要在堆肥过程中迅速达到良好的腐熟度 加快木质素纤维转化为腐殖质是 关键 植物体内的纤维素受到木质素的保护 2 6 1 由于木质素的不溶性和固有的 化学特性以及结构细节的不确定性 导致木质纤维素材料很难降解 是其未得 到有效利用的主要原因 相关研究表明 未木质化的牧草中的纤维素8 0 可为牛 羊体内的微生物分解消化 而木质化的麦秸纤维素的可消化率仅为2 0 妨碍木 质纤维素生物转化的另一个主要障碍 是纤维降解酶类的比活力低 致使酶的 生产成本较高 影响了酶的广泛使用 近几十年来 国内外学者一直在寻找降解木质纤维素的最佳途径 但利用 微生物降解木质纤维素国内报道不多 特别是在木质纤维素作为堆肥原料 其 生物可降解性方面的研究则更少 在生活生产中 大部分的木质素被直接排放 不仅浪费了这种宝贵的资源 还对周围环境产生巨大影响 我国作为一个农业大国 每年约有7 亿吨农作物 秸杆由于木质素复杂的理化特性难以利用 最终作为固体废物被丢弃 同时 因为没有很好的处理方法 木质素作为木材水解工业和造纸工业的副产品 是 污染环境的有害物质 如散布在淮河流域周围大大小小的造纸厂排出的大量黑 液 主要成分是得不到利用的木质素 这些废液排入淮河 严重污染了当地的 地表水和地下水 导致该流域附近众多城镇居民生活用水困难 健康水平下降 农业生产下滑 堆肥中生物降解木质素作为一种降解木质素的比较低成本方法 不断研究完善它 对我国经济建设十分有好处 因此研究木质素的降解和利用 越来越成为热门的课题 1 2 4 堆肥化中降解木质素的微生物 堆肥中木质素的完全降解是在细菌 真菌及相关微生物的共同作用下完成 的 其中细菌能在一定程度上使木质素结构发生改性 成为水可溶的聚合产物 极少矿化木质素产生c 0 2 另外 细菌在木质素降解过程中主要起着间接的作 用 使真菌在这种作用下更容易的攻击木质素 真菌通过菌丝作用进入到木质 材料中 同时菌丝分泌出特殊的胞外酶攻击植物细胞壁中的木质纤维素 导致 木质素与纤维素的解聚和溶解 此外放线菌也对木质素的降解起到了一定的作 用 农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究 1 2 4