医学硕士答辩-欧琴答辩.ppt

EBVLMP2B细胞表位的预测 克隆 表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究 温州医学院2004级硕士学位论文答辩 答辩人 欧琴导师 张丽芳教授夏克栋教授专业 病原生物学2007 5 17 主要内容 研究背景 研究目的 研究方案 结果 分析与讨论 结论 研究背景 EB病毒 Epstein Barrvirua EBV 属于 疱疹病毒科 引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症 移植后淋巴细胞增多症 PTLD 霍奇金病 Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌 NPC 研究背景 肿瘤亚型EBV阳性率 表1EBV相关的增生性疾病 Burkitt淋巴瘤E BL100 S BL15 85 AIDS BL100 NPC低分化或未分化100 霍奇金病mc ld80 90 ns30 T细胞淋巴瘤fatalIM100 AILD40 淋巴母细胞瘤fatalIM100 与器官移植相关100 与AIDS相关70 80 研究背景 LMP2不是转化基因 维持EBV潜伏感染 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原之一 研究背景 表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向 多表位疫苗能选择性诱导多价 多特异性应答和控制免疫应答类型 研究背景 NPC患者血清中能检测LMP2抗体 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据 以B细胞表位为基础的多肽抗原可用于血清学检测 研究目的 1 预测EBVLMP2的B细胞表位 可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据 2 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒 采用6个组氨酸标签 His tag 表达表位融合蛋白 并用Ni NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白 3 将纯化的蛋白分别免疫小鼠 检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体 选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原 用ELISA检测NPC组 CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体 为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨 研究方案 一 EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测 研究方案 采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 http www expasy org sprot 采用EXPASY服务器提供的SOPMA GOR nnPredict HNN方法预测LMP2二级结构 http www expasy ch tools 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 http www expasy ch tools 采用EXPASY服务器提供的Hopp Woods Emini Jameson Wolf Zimmerman方法预测LMP2的亲水性 表面可及性 抗原性 极性及柔韧性参数 http www expasy org cgi bin protscale pl 对上述方法预测的结果进行综合分析 推断LMP2的B细胞表位 并用吴玉章等建立的抗原性指数 AI 综合评判EBVLMP2的B细胞优势表位 研究方案 二 EBVLMP2B细胞表位的克隆 表达及其融合蛋白的纯化 研究方案 引物设计与合成 退火获得目的基因 pET32a EBV LMP2B细胞表位重组质粒的构建 纯化 连接 转化DH5 大肠杆菌 转化BL21大肠杆菌 诱导 表达 纯化表位融合蛋白 SDS PAGE Westernblot分析 pET32a 质粒酶切 酶切 测序鉴定 研究方案 引物碱基序列酶切位点 OZLF 675 TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAABamHIAGGGCGGATCTTCGATGCGG3 OZLF 685 GATCCCGCATCGAAGATCCGCCXhoICTTTAACAGCCTGCTGTAAC3 OZLF 695 TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG3 BamHIOZLF 705 GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC3 XhoIOZLF 715 TCGAGTTAATTCGGGATAAATTCBamHITGTGCTGGACAATGATTTG3 OZLF 725 GATCCAAATCATTGTCCAGCACAXhoIGAATTTATCCCGAATTAAC3 图1pET32a B细胞表位的重组质粒图 研究方案 研究方案 层析纯化蛋白 灌胶 BufferB液调节吸光度和透光度 样本处理 样本加入层析柱中 收集滤液 BufferB液洗涤 至A 0 01 收集滤液 BufferD液洗涤 至A 0 01 收集滤液 BufferE液洗涤 至A 0 01 收集滤液 样本收集 SDS PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况 BufferB 8M尿素 pH8 0 BufferD 8M尿素 pH6 8 BufferE 8M尿素 pH4 0 研究方案 三 EBVLMP2B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究及血清学检测 研究方案 动物 ICR小鼠免疫方式 背部皮下多点注射采血方式 眶静脉采血 3只 组 研究方案 ELISA检测 以纯化的融合蛋白作包被抗原以B95 8细胞作包被抗原选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原 检测NPC组 CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体 结果 一 EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测 结果 H 螺旋 e 片层 c 无规卷曲 未预测结构 t 转角图2EBVLMP2二级结构预测 结果 aa144 150202 208265 268318 322375 390445 455 图2按SOSUI程序预测EBVLMP2蛋白跨膜区 膜内区域 跨膜区 膜外区域 结果 图3各种不同参数对EBVLMP2的预测结果 a 亲水性参数b 极性参数c 柔韧性参数 d 表面可及性e 抗原性 二级结构10 82 89 108 116 126 142 149 198 206 288 295 317 321 339 348 379 389 414 422 481 497膜外区域144 150 202 208 265 268 318 322 375 390 445 455亲水性15 26 36 41 43 60 65 74 90 96 101 119 176 179 199 205 236 242 414 416 483 492表面可及性13 18 20 22 25 32 39 64 67 82 90 92 95 112 114 116 73 178199 201 203 204 235 240 378 380 383 384 416 420 484 496抗原性10 83 88 109 111 121 174 179 198 207 235 241 290 293 340 348 380 387 413 421 471 476 483 491极性20 23 45 55 57 59 65 74 90 94 102 117 198 203 234 342 483 491柔韧性10 85 89 121 199 205 218 222 236 244 289 296 342 347 370 378 381 383 385 388 412 420 483 493 预测方法预测结果 结果 表3应用不同方法预测EBVLMP2蛋白B细胞表位的肽段位置 结果 145 150TASVST0 005199 209RIEDPPFNSLL0 037318 322TLNLT0 036381 391KSLSSTEFIPN0 028 B细胞表位区域氨基酸序列抗原性指数 表4EBVLMP2的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数 二 EBVLMP2B细胞表位的克隆 表达及其融合蛋白的纯化 结果 结果 图4重组质粒pET32a ozlf 67酶切鉴定1 DNA Hind DNAMarker 2 pET32a ozlf 67 3 pET32a ozlf 67 EcoRI 4 pET32a 5 pET32a EcoRI 图5重组质粒pET32a ozlf 69酶切鉴定1 DNA Hind DNAMarker 2 pET32a ozlf 69 3 pET32a ozlf 69 EcoRI 4 pET32a 5 pET32a EcoRI 图6重组质粒pET32a ozlf 71酶切鉴定1 DNA Hind DNAMarker 2 pET32a ozlf 71 3 pET32a ozlf 71 EcoRI 4 pET32a 5 pET32a EcoRI 重组质粒酶切鉴定 结果 测序结果 图73个重组的目的基因的测序图 结果 B细胞表位融合蛋白鉴定 图8B细胞表位融合蛋白表达产物SDS PAGE和Western Blot分析1 蛋白分子标准物 2 IPTG诱导重组质粒pET32a ozlf 67蛋白表达 3 IPTG诱导重组质粒pET32a ozlf 69蛋白表达 4 IPTG诱导重组质粒pET32a ozlf 71蛋白表达 5 IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达 6 BL21 结果 ozlf 67 ozlf 69 ozlf 71融合蛋白和His蛋白的纯化 图9纯化的ozlf 67蛋白SDS PAGE电泳分析1 蛋白分子标准物 2 样品穿透液 3 BufferB液滤液 4 BufferC液滤液 5 7 BufferE液滤液 图10纯化的ozlf 69蛋白SDS PAGE电泳分析1 蛋白分子标准物 2 样品穿透液 3 BufferB液滤液 4 BufferC液滤液 5 8 BufferE液滤液 图11纯化的ozlf 71蛋白SDS PAGE电泳分析1 蛋白分子标准物 2 样品穿透液 3 BufferB液滤液 4 BufferC液滤液 5 6 BufferE液滤液 图12纯化的His蛋白SDS PAGE电泳分析1 蛋白分子标准物 2 样品穿透液 3 BufferB液滤液 4 BufferC液滤液 5 BufferE液滤液 结果 结果 三 EBVLMP2B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究 结果 图13不同免疫原在不同时间的抗体均值 X SD 分别包被3种表位融合蛋白ozlf 67 ozlf 69和ozlf 71 分别检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效价差异 结果 图14多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果 与His蛋白免疫组比较 结果 B95 8细胞作为包被抗原 ELISA检测3种表位融合蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价 图15B95 8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价 与His蛋白免疫组比较 结果 选用Ozlf 67融合蛋白为诊断抗原 ELISA检测NPC组 CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体 图16ozlf 67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价 与正常组比较 结果 表5ozlf 67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率 与正常组比较 分析与讨论 预测的B细胞表位是线性B细胞表位 主要的参数有二级结构 跨膜区 亲水性 表面可及性 抗原性以及柔韧性等 抗原性和亲水性是形成表位的首要条件 因而优势表位的形成是多种因素综合作用的结果 分析与讨论 采用分子生物学方法分别得到了包含预测表位片段的重组质粒 并得到了融合蛋白 为进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础 分析与讨论 3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体以B95 8细胞作为抗原包被酶标板 B细胞表位融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异性结合 但抗体效价较低 可能是由于单个表位肽的结合能力较弱 分析与讨论 选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原 ELISA检测NPC患者血清特异性抗体 用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值 结论 1 预测EBVLMP2的B细胞表位可能位于其N端199 209 318 322和381 391区段 2 分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a ozlf 67 pET32a ozlf 69和pET32a ozlf 71 在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf 67 ozlf 69 ozlf 71 通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白 3 表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测 表明3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体 具有较强的免疫原性 抗体效价随免疫次数增加而升高 表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合 4 Ozlf67蛋白作为诊断抗原 具有较强的抗原性 用于NPC的血