柑桔属柠檬类果实果胶酯酶的活性分析.doc

柑桔属柠檬类果实果胶酯酶的活性分析摘要: 果胶酯酶( PE 或PME) 能催化果胶脱酯生成低酯果胶和果胶酸, 属于一类果胶酶, 广泛应用于食品特别是果品加工工业中。以新鲜柠檬为原料, 采用NaCl- 冷冻离心- 盐析的方法提取柠檬果实中的果胶酯酶, pH- stat 法对果胶酯酶进行活性分析。研究温度、pH、相对储藏度等因素对柠檬类果实果胶酯酶的活性影响, 并探索该酶的最适温度、最适pH 值, 进而研究该酶的热稳定性; 对柠檬果实中果胶含量进行测定。实验表明: 58 , pH=6.90 时柠檬中的果胶酯酶的活力最高。关键词: 果胶酯酶; 柠檬; 活性果胶酯酶( pectinesterase)( 缩写PE 1,1,11) , 国际酶委员会将果胶酯酶归类为果胶果胶酰基水解酶。它能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇, 通过去除果胶分子链上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基团( 主要是羟甲基或羟乙基) , 增加果胶在水中的溶解度; 所产生的果胶酸在Ca2+等离子的桥联作用下, 使细胞间的黏合加强, 从而容易形成凝胶。因此, 果胶酯酶常用于制备低甲氧基果胶以及用于果汁加工澄清等技术中。另外,果胶酯酶还能够提高食品粘度、延长货架期1、脱苦、去除异味和水果果皮等, 有研究发现, 果胶酯酶与植物病毒运动蛋白之间有相互联系2- 3。果胶酯酶在食品工业中有着极其重要的作用和开发前景。它广泛存在于一些植物如番茄、桔皮、苹果、葡萄、香蕉、梨、马铃薯、柠檬、向日葵、大豆、烟草等以及一些细胞壁降解的微生物如细菌、真菌等中。柠檬在植物学中属柑橘属类, 柠檬中含有大量的果胶酯酶, 它与细胞壁结合紧密, 主要存在于柠檬的皮、白皮层以及汁胞细胞中4。我国盛产柠檬, 但对柠檬皮渣的利用不够重视。柠檬皮渣不但是提取果胶的最佳原料5, 同时也是果胶酯酶的良好来源。本文对柠檬皮及果肉中的果胶酯酶进行了生物学特性分析, 为果胶酯酶在食品工业中的应用提供依据, 同时充分利用柠檬皮渣, 变废为宝, 还可有效地保护生态环境。1.1 材料与试剂新鲜柠檬: 市售; 果胶( JCO1 高酯果胶) : 宜昌金川生物科技公司; 氢氧化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等试剂均为分析纯。1.2 仪器1 材料与方法ZD- 2 型自动电位滴定仪: 上海精密科学仪器有限公司; JJ- 1 型增力电动搅拌器: 江苏省金坛市医疗仪器厂; DHG- 9075A 型电热恒温鼓风干燥箱: 上海益恒实验仪器有限公司; JJ- 2(2003- 61)组织捣碎匀浆机: 常州国华电器有限公司; 冷冻离心机(Centrifuge5810R): Eppendorf.Inc.USA.等1.3 方法1.3.1 粗酶液的提取将柠檬果肉掰瓣, 捣碎均质, 加入2 倍量的1 mol/LNaCl 溶液, 盐提。搅拌1 h 后4 冷冻离心( 5 000 g,20 min) , 过滤得上清液, 然后用饱和度为75 %的( NH4) 2SO4 饱和粗酶液, 离心沉淀即得到较纯净的酶液。4 下保存备用。( 柠檬皮则是洗净后切成小块, 捣碎均质, 加入4 倍量的1 mol/L NaCl 溶液, 盐提。之后处理方法和果肉一致) 。1.3.2 PE 活力的测定果胶酯酶催化水解果胶分子而释放出H+, 使反应体系的pH 下降, 用碱液( 0.05 mol/L NaOH 溶液) 使反应体系的pH 始终保持在7。通过碱的消耗量可以反应出果胶酯酶的活性。测定方法: 一定温度条件下, 取30 mL 1 %的柑橘果胶溶液于100 mL 三角烧瓶中, 用0.05 mol/L 的NaOH 调pH 到7 后, 加入10 mL 粗酶液, 同时开始记时, 通过自动电位滴定仪用0.05 mol/LNaOH 滴定, 保持溶液的pH=7。以反应的NaOH 微摩尔数反应时间作图, 由所得曲线最初部分的斜率表示果胶酯酶的活力, PE 活力单位为mol/s, 即每秒钟消耗1 mol NaOH 定义为一个PE 活力单位。1.3.3 温度对酶活性的影响1.3.3.1 PE 最适温度的确定分别在30、40、50、60、70 下测定PE 活力, 作活力- 温度曲线图。1.3.3.2 pH 对酶活性的影响在最适温度下, 分别于不同pH 条件测定PE 活力, 作活力- pH 曲线图。1.3.3.3 PE 热稳定性研究将PE 酶液分别在50 、55 、60 、65 温度下分别保温, 每隔15 min 取样测定酶残余活力, 作活力-时间曲线图。1.3.3.4 相对储藏度对酶活力的影响将同一批柠檬储存在冰箱的保鲜柜( 5 ) 中, 每隔5 d 进行一次酶活测定, 作活力- 时间曲线图。1.3.3.5 柠檬果皮和果肉中PE 活性比较分别从柠檬果皮和果肉提得粗酶液, 在最适温度和最适pH 条件下测定PE 活力。2 实验结果与分析2.1 温度对PE 活力影响通过测定不同温度( 25、30、40、50、60、70 ) 下PE 活力, 得到活力- 温度曲线图( 见图1) 。由图1 可以看出, 在25 70 条件下分别测得柠檬果皮、果肉的PE 活力明显不同。随着温度的升高, PE 活力呈现明显的上升趋势, 在58 时, PE 活力达到最大, 当高于58 时, PE 活力下降。由此, 可以推断该PE 酶的最适温度在58 左右。2.2 pH 值对PE 活力影响最适温度条件下, 在不同pH 条件下分别测定柠檬果皮、果肉PE 活力, 得到活力- pH 曲线图( 见图2) 。由图2 可知, 随着pH 的升高, PE 活力也同样呈上升趋势, pH=6.9 时, PE 的活力表现为最高, pH 高于6.9 后,PE 活力逐渐下降。曲线表明该PE 酶的最适pH 在6.9左右。图1 温度对PE 酶活力的影响曲线Fig.1 Temperature to the vitality of PE influence curve图2 pH 对PE 酶活力的影响曲线Fig.2 pH to the vitality of PE influence curve2.3 PE 热稳定性的测定将PE 粗酶液分别在50、55、60、65 下保温0 min60min 后, 测活力, 得到活力- 温度曲线图( 见图3) 。由图3 可知, 在不同温度下保存一定时间后, 酶的活力均呈下降趋势。在55 下保温60 min 后, PE 活力变化较小, 仍保有较高的活力。2.4 相对储藏度对柠檬中PE 活力的影响每隔5 d 后取出储藏的柠檬, 提取粗酶液, 测定PE 活力, 得到相对储藏度对酶活力的影响曲线( 见图4) 。由图4 可以看出, 在储藏一段时间后, 酶的活力均呈下降趋势。2.5 柠檬果皮和果肉中PE 活性比较( 见表1)由表1 可以得出, 同一条件下, 柠檬果皮中的PE活力高于果肉中PE 活力。3 结论本实验结果表明: 柠檬果皮和果肉中的果胶酯酶的最适温度为58 , 最适pH=6.90 。热稳定性较好, 储藏一段时间后, 酶活下降。果皮中PE 活性更高。由此表明, 该酶的最适宜工作环境是58 , pH=6.9。这很适合一般制备低酯果胶和果汁加工的生产条件。因此, 利用新鲜柠檬皮中的天然果胶酯酶进行酶促反应制备低酯果胶是目前制备低酯果胶的一种可行性办法。这不但有利于保护环境, 还有利于节约成本, 提高生产效率。参考文献:1 汤_鸣强, 谢必峰.果胶酶不同组分的酶学性质研究J.福建化工,2004( 1) : 13- 152 C.Versteeg, et al.Thermostability and Orange Juice Thud DestabilizingProperties ofmultiple PE fromOrange J.FOOD SCIENCE,1980(45):969- 9713 生吉萍, 申琳, 罗云波.果实成熟衰老相关酶的研究进展J.食品与机械,2000( 3) :7- 84 周志娟, 郝俊光, 李崎, 等.利用SDSPAGE 电泳对啤酒生产过程中蛋白质动态变化的研究J.酿酒, 2005, 32( 3) : 59- 625 Hui Yang,Junwen Zeng. Detection of Molecular Weight of PMCAIsoform with 20cm SDS- PAGE Electrophoresis:Compared with 8cmSDS- PAGEJ.EYE SCIENCE, 2005( 3) :179- 184收稿日期: 2006- 11- 02图3 柠檬中PE 耐热性曲线Fig.3 Lemon inside PE heat- proof curve图4 相对储藏度对酶活力的影响曲线Fig.4 Opposite hoard an influence for to the vitality of PE curve表1 柠檬果皮和果肉中PE 活性比较Table 1 Lemon fruit peel