第三章 分光光度计.doc

第三章分光光度计分光光度计和光电比色计的工作原理相同，都是利用物质对不同波长的光选择性吸收的现象，对物质进行定量及定性分析的仪器。第一节 分光光度计的类型分光光度计也有多种分类方法。按工作波长范围不同来划分，分光光度计分为红外分光光度计、紫外分光光度计和可见（光）光分光光度计三类。其中的紫外分光光度计均兼有可见光分光光度计的功能。按待分析物质对光的吸收性质不同，可分为分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计两类。上述的红外、紫外和可见分光光度计均属于分子吸收分光光度计。按待分析物质对光的作用效果来分，可分为发射光谱类分光分光光度计和吸收光谱类分光光度计两大类。在医学上应用的发射光谱类分光光度计主要有荧光(分光)光度计和火焰(分光)光度计两类。分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计都属于吸收类分光光度计。本节主要介绍基层医院最常用的721及722型两种可见（光）光分光光度计。第二节 可见分光光度计的原理及结构一、工作原理吸收式分光光度计都是根据物质对不同波长的光具有选择性地吸收的特点而进行工作的，它们都以朗伯-比尔定律作为定量依据。当一束平行的、特定波长的单色光照射到有色溶液后，该有色溶液就会对光产生吸收。溶液的浓度越大，对光的吸收越多。其吸收程度符合朗伯-比尔定律。即T（t0）100%lgt0式中：为透射比。t为透过光的强度。0入射光的强度。为吸光度。也叫消光度或光密度。为吸收系数。为溶液的浓度为溶液的厚度。朗伯-比尔定律（）说明：当一束光通过有色溶液后，溶液的吸光度A与溶液的浓度C及液层厚度L成正比。吸光度A与溶液的透射比T成负对数关系。比色分析时，溶液的透射比T很容易测量出来。通过对透射进行负对数计算，可以得到吸光度值。再将吸光度除以相应的系数，便可求出待测溶液的浓度。二、基本结构一般的可见分光光度计由光源、单色器、比色皿、光电转换器、前置放大器、对数放大器、显示部件及电源电路组成。如图3-2-1所示。图中的虚线部分也可以没有。显示器光源灯单色器比色皿光电转换前置放大对数放大浓度调节电源电路TTTAAC 图3-2-1 分光光度计基本结构图图中各部分的作用如下：光源灯发出的复合光经单色光器后，变为单色光。此单色光通过比色皿时，被比色皿中盛放的样品液吸收掉一部分，然后照在光电转换（检测）器上。光电转换器将照在它上面的光信号的强弱转变为电信号的大小。这一信号与溶液的透射比T成正比。此信号经前置放大器后，可以直接送到显示器将溶液的透射比显示出来。由朗伯-比尔定律可知，溶液的吸光度与透射比的负对数成正比。要想线性地显示吸光度A，必须经过负对数放大后才行。透射比经（负）对数放大器进行放大，变为吸光度A。吸光度A可直接送到显示器显示，也可再经过一个简单的浓度调节电路后，显示溶液的浓度值C。721型分光光度计没有图中虚线部分的电路。其吸光度A不能线性显示（也不能直接读取浓度）。所以其表头上的吸光度刻度是非线性的。下面将各部件作较详细的介绍。（一） 光源灯可见分光光度计的光源灯通常为钨丝灯和卤钨灯两种。前者的体积较大、寿命较短。并且随使用时间的延长，发光强度会慢慢变弱。卤钨灯可克服上述缺陷。这两种灯能产生从近紫外（320nm）到近红外（2500nm）之间的光谱。其发光稳定性与所加的电压有关。（二） 单色器单色器又叫单色光器。其作用是把复合光分解成分析时所需要的单色光。其分光方式有棱镜式和光栅式两种。棱镜式分光的方式比较落后。近代分光光度计都采用光栅分光。光源灯产生的光通过单色器后，被分解成红橙黄绿青蓝紫的光谱带。投照在出光狭缝的内壁。改变波长调节装置，棱镜或光栅的角度随之变化，其分解后的光谱便在狭缝内壁移动，所需要的单色光便从狭缝中透出来。与此同时，波长显示装置出将所调节的波长显示出来。（三）比色皿比色皿有多种称呼：如比色杯、比色槽、比色池、吸收池、测量池等。其作用是用来盛装比色溶液。可见光区使用的比色皿都用光学玻璃制成，它只能用于可见光区。不能在紫外分光光度计上使用。比色皿有5mm、10mm、20mm、40mm等多种规格。其中10mm是最常用的标准规格。大于10mm用于溶液过稀的场合，小于10mm用于溶液过浓的场合。（四）光电检测器 光电转换器又叫光电检测器，是用来将光能转换成电能的器件。分光光度计所使用的光电检测器均采用线性转换器件。常用的光电检测器的类型有光电池、真空光电管、光电倍增管以及半导体光电二极管、光敏电阻等。721型和722型分光光度计使用的光电检测器都是真空光电管。为了防止电磁信号及杂散光的干扰，光电检测器通常都是和前置放大器一起，单独放在一个光电管暗盒中。 （五）前置放大与对数放大光电检测器转换成的电信号，通常先送到前置放大器，经前置放大器放大到足够大以后，再送到显示装置。如前所述，前置放大后的信号与溶液的透射比T成正比。只有将透射比作负对数放大后，才能线性地显示吸光度A。（六）浓度调节电路浓度调节电路通常由电位器组成。在比色皿中放入已知浓度的标准溶液后，调节浓度调节电路，使仪器显示其浓度值。而后，才能进行浓度测定。最简单的分光光度计如721型，信号经前置放大后直接送到磁电式表头进行显示，仪器没有对数放大及浓度调节电路。表盘上的吸光度刻度为非线性的对数刻度。（七）显示装置可见分光光度计常用的显示装置有磁电式表头及数字式表头两种。（八）电源电路电源电路用于产生光源灯所需要的稳定电压及仪器放大电路所需要的其他直流电压。复习题：1. 分光光度计按波长分类有哪几种？最常用的是哪一种？2. 一台分光光度计基本组成有哪些？3. 分光光度计常用的分光器件是什么？4. 分光光度计使用对数放大器的目的是什么？第三节 721型和721A型分光光度计（上海第三分析仪器厂生产）国内从20世纪70年代就开始生产721型分光光度计。此同一型号的仪器国内有多个厂家生产。几十年来各厂家产生的721分光光度计，除了光路部分较少变化外，其他部分则不尽相同。如除了指针式读数外，还有采用数字表头读数的721A型。721A型将显示部分改为数字表头显示，电路部分增加了对数放大器，可以线索性地读取吸光度，还可以读取浓度。其他部分变化不太大。 一、技术指标 波长范围：360nm800nm。波长精度：（360600）nm3nm，（600700）nm5nm，（700800）nm8nm。波长重复性：相应波长准确度的一半。透射比准确度：2.5%透射比重复性：0.5%暗电流稳定性：0.5%光电流稳定性 1.5。电源电压变化范围：220V10%仪器尺寸：506mm345mm200mm仪器净重：17kg 二、面板介绍 仪器的外观如图3-3-1所示。 波长读数盘 指示表头 比色皿暗盒盖 电源开关 试样室拉杆 电源指示灯 波长调节钮 0点调节钮 100%调节钮 灵敏度选择开关图3-3-1 721型分光光度计的外形三、721型分光光度计的使用方法仪器经过运输和搬运等原因，可能会造成波长及吸光度的准确度发生变化。再加上分光光度计属于国家强制检定项目，所以，分光光度计在使用前，应经过计量单位检定，只有计量检定合格，且在计量有效期内的仪器才能使用。 使用本仪器前，应该仔细阅读该机的使用说明书，了解各个操作旋钮之功能。在未接通电源之前，应该对仪器的安全性进行检查。在确信电源线接线正常、接地良好、各个调节旋钮的起始位置正确后，再接通电源开关。 此外，应先检查旋在仪器底部的两个硅胶干燥筒。正常时，筒内的硅胶应为蓝色。受潮后，会变成淡粉色。发现硅胶变成淡粉色后，应予以更换或者将硅胶烘干到蓝色后再使用。否则，可能引起仪器工作不正常（如显示不稳，调“0”，调“100”不能到位等）。仪器的使用步骤如下：1在仪器未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上。若不是这种情况，应卸下仪器上盖板，调节电表上的校正螺丝，使表头指在“0”位。2将灵敏度旋钮调至“1”挡。此时，仪器的放大倍数最小，稳定性最好。3调节仪器波长旋钮，调至所需波长处。4打开试样室盖，开启电源。调“0”旋钮，使电表指示“0”。盖上试样室盖，调“100”旋钮使电表指示100附近。若调不到“100”，可调节灵敏度钮，增加灵敏度挡数。打开试样室盖，将仪器预热20分钟。5在试样室盖打开的情况下，再次调节0旋钮，使电表指示“0”。6将装有参比溶液及样品液的比色皿放置于比色架中。参比液放一份，样品液可以放置三份。参比液通常放置于最前或最后位置。注意，比色皿外壁的液体一定要擦拭干净，否则，会造成大的测量误差。7盖上试样室盖，将装有参比溶液的比色皿（有时以空气作参比）拉或推入光路，调节“100”旋钮，使电表指示“100”。如果调不到“100”，则可适当增加灵敏度挡数。上述“调0”及“调100”步骤应反复调节两三次。8将装有被测溶液的比色皿依次推或拉入光路中，然后，从指示表头上读出被测量溶液的透射比T或吸光度A值，并将其记录下来。四、721A型分光光度计的使用方法1将灵敏度旋钮调至“1”挡。2调节仪器的波长钮，即将波长置于测试所需的波长处。 3打开试样室盖，开启电源。将选择开关置于“T”挡，调“0”旋钮，使数字显示“00.0”。然后，盖上试样室盖，调“100”旋钮，使数字显示在“100.0”附近。若调不到“100.0”，则可适当增加灵敏度挡数。打开试样室盖，对仪器预热20min。 420min后，在打开试样室盖的情况下，调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”。 5将装有参比和待测溶液的比色皿放置于比色架中。6关上试样室盖，将装有参比溶液的比色皿（有时以空气作参比）置于光路中，调节“100”旋钮，使数字显示为“100.0”。如果显示不到“100.0”，则可适当增加灵敏度挡数。上述“调0”及“调100”即“4”与“6”两步骤应反复调节两三次。 7将被测溶液置于光路中，从显示器上直接读出被测溶液的透射比（T）值。并将其记录下来。 8吸光度（A）的测量：当进行完上述第（6）步后，即当仪器的数字显示为“ 100.0时，将选择开关置于”挡，旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后移入被测溶液，表头示值即为试样的吸光度（A）值。 9浓度（C）的测量：将选择开关由“A”旋至“C”，将已标定（知道）浓度的溶液移入光路中。调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值。然后，将被测溶液移入光路中，显示器上的读数即为所测溶液的浓度值。 五、721型分光光度计使用注意事项 1在能使参比液调到“100”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡。在低挡时，仪器有更高的稳定性。所以使用时一般先放置在“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。改变灵敏度后必须重新校正“0”和“100”。 2在大幅度改变波长或大幅度旋转“100”旋钮后，需等待片刻后才能正常工作。因光能量急剧变化，光电管及钨丝灯均需一段响应平衡时间。3根据溶液含量的不同，可以酌情选用不同光径长度的比色皿，目的是尽可能使电表读数或数字显示处于（0.20.8）A吸光度值内。在这一区域内的读数更准确。4本仪器还配有0.5A、1A及1.5A三块中性滤光片。这三块滤光片是在测量浓度过高的溶液时用的。例如，在测定吸光度为1.7A左右的溶液时，我们在电表指示上易造成过大的读数误差（721型）或数字显示吸光度值不稳（721A）。如果在测定时，在参比溶液处再加放一块1A的中性滤光片，则电表读数（721）或数字（721A）为0.74A，则实际值为1.74A。但是，要注意的是：这三块滤光片只是粗略的标称值。具体到在每个波长下的值或你需要的波长下的值是多少，都是未知数。使用前，需要在计量合格的更高一级的分光光度计上确定其数值后，才能这样使用。否则，有可能会引起更大的误差。5取放比色皿时应拿其磨沙面，并经常检查所用的同一套比色皿是否配套正常。检查方法是：在比色皿中放入相同的溶液，在相同的波长下测量，测出的透射比误差不大于0.5%。否则，应对比色皿进行清洁处理。处理后若仍有不合格者，应将其剔除，不能再使用。需要注意的是，每个仪器的比色皿都是配套的，不能和其他仪器的比色皿单独调换。6仪器使用完毕，应用塑料套罩住整个仪器，并在塑料套内放置数袋防潮硅胶。7经常注意仪器底部旋入的两个干燥剂筒及试样室盒内的干燥剂袋内的硅胶是否变色，如发现变红，应及时将其取出调换或烘干至蓝色，等冷却后放回原处。8比色皿每次使用完毕后，应立即用蒸馏水洗净，再用细软而易吸水的布或镜头纸擦干，存于比色皿的盒子内。六、721型分光光度计的调校该仪器使用较长时间后，可能发生一些故障，或者仪器的性能指标有所变化。需要进行调校或修理。现将本机的调校及简单故障的修理分别简单介绍如下： （一）仪器的调校：1光源灯的调整 打开试样室盖，先将光量调节器即面板上100旋钮顺时针方向调到头，再把波长调节至580nm处，在比色皿暗盒通光孔处放一张白色纸卡，然后，把仪器接上电源，使光源灯的灯丝部分正确垂直地对准灯架上园形光孔。观察白色卡片纸上的单色光，应为明亮的黄色光斑，边缘无光晕或杂色现象。否则，调节光源灯的位置，或仪器底座上固定光源灯架的三个螺丝，使达上述效果。2仪器光源灯电压的调整：为了保证仪器使用的稳定性并延长光源灯的使用寿命，钨灯稳压电源的输出电压最高调整为11.5V。即，在100旋钮顺时针旋到底时，光源灯盒接线座的两端的电压应为11.5V。否则，可调电源电路板上的W201电位器，将电压调到11.5V。3调不到零点情况的处理调节仪器面板上的调零钮时，如果仪器的零点受调，但调到了极限也到不了零点。对于这种情况，可以调节仪器的粗调零电位器来解决。调节方法如下：先将面板上的调零钮调到中间位置。该调零钮通常为10圈电位器，从任一端向中间调五圈即行。然后，打开仪器左侧的小盖板，用小螺丝刀慢慢调节里面的一只电位器，使指针指零即行。4波长校正：分光光度计的波长准确度（也有人称为波长精度），是分光光度计的重要指标之一。波长准确度指的是波长盘所显示的波长值，与狭缝此时出射的实际的波长值（又叫真值）之间的符合程度。通常用二者之差来表示其误差的大小。波长误差大，会影响测量准确度。所以,无论何种型号的分光光度计，均要求它在波长精（准确）度的允许误差范围内工作。如果发现波长超差，就需要及时校正。检查721型仪器波长是否超差的方法如下：打开试样室盖，用100%电位器先将光源灯调到最亮。然后，将波长盘置于580nm处,观察仪器出射的光应为黄色。然后，将波长盘置于590nm处，观察仪器出射的光应为橙色。在这种情况下，误差通常都在允许范围之内，可不必调整。若不是这种情况，说明波长超差，应对波长进行校正。分光光度计波长的校正有许多方法。如可以用有色溶液、干涉滤光片、镨钕玻璃（滤光片）、氧化钬玻璃（滤光片）、以及汞灯等来进行波长校正。本机附有一块镨钕滤光片，可以用它来进行波长校正。镨钕滤光片是一种含有镨和钕金属的特殊玻璃片。在可见光区，它有一系列固定的吸收峰，这些吸收峰的波长变化很小，可以用它们来校正分光光度计的波长。校正前，先将波长调到580nm，然后，打开仪器左侧的小盖板，将波长校正螺杆外的固定螺母旋松，再用螺丝刀慢慢调节波长校正螺杆，使在测量室放置的纸板上的光为黄色。这一步为粗调，只有粗调后，才能进行细调。否则，会越调越乱。哪个螺杆为波长校正螺杆呢？打开仪器左侧的小盖板后，可看到内部有四个调节螺杆。对于厦门光学仪器厂生产的仪器来说，正中间一个，左边上下各有一个，右边中间有一个。右边的一个为波长校正螺杆。上海第三分析仪厂及山东高密分析仪器厂的721型分光光度计正好与此相反。但对于721型分析分析仪器来说，不管是哪个厂家生产的，要记住谁是波长校正螺杆也容易，在四个螺杆中，除正中间一个之外，边缘三只螺杆呈等腰三角形，位于三角形顶点的那只螺杆就是波长调节螺杆。其他几只螺杆则不允许随便调节。具体调节方法如下：粗调过后，在比色皿架中垂直放上镨钕滤光片。镨钕滤光片的颜色和中性滤光片的不同，从侧面看，它呈淡红色。然后，从520nm附近向540处慢慢转动波长盘。边转边观察表针。正常时，应在5293nm处有一吸收峰，即此处表头指示的透射比最小。若此吸收峰的波长值与529之差超过4nm，（技术指标规定为5nm，考虑到滤光片本身并没有校正，其本身就有1nm的误差）就需要进行校正。校正时，将波长盘调在529nm处 ,若刚才测得的吸收峰小于529nm,慢慢顺时针调节螺杆，使指针返回最小示值。反之，应进行反向调节，使指针指到最小。需要指出的是：这样的校正只是一点校正，这一点的波长准确了，并不能保证高端或低端的波长不超差。粗略的两点校正，可将波长盘再旋回580nm处，观察出射光的颜色，应为纯黄色。更精确的波长校正，应由计量部门每年进行一次。5吸光度（A）斜率的调整721A型仪器的电路中因为多了对数放大器，要增加吸光度斜率的调整一项内容。调整方法如下：将选择开关置于“T”挡，波长任选，先调“00.0”，再调节仪器的显示值为“100.0”。然后，将选择开关置“A”，旋动吸光度调零旋钮，使得显示值为“.000”。接下来，再将选择开关再置回“T”挡，调整“100”旋钮，使透射比值为“10.0”；而后，将选择开关再置“A”挡，仪器的显示应为1.000。否则，要揭去上盖板斜面上白色装饰钮，可见到“吸光度斜率调整电位器”，也有的仪器将该电位器标着“E（A）调1”。用小螺丝刀轻微的旋动，使显示值为“1.000”。第四节722型分光光度计（上海第三分析仪器厂生产）722型分光光度计和721型的不同在于，722型的单色器是采用光栅分光的。其波长准确度及透射比准确度都比721型要高，并且采用数字式表头显示。可以线性地读取吸光度，并可以进行浓度直读。此种型号的仪器国内也有多家生产。一、技术指标波长范围：（330800）nm。波长精度：2nm。波长重复性：0.5nm。光谱带宽：6nm。透射比准确度：0.5%透射比重复性：0.5%吸光度测量范围：01.999。浓度直读范围：02000。光电流稳定性 0.5。（500nm处测）杂散光：1%。T/A换挡偏差：0.003A。电源电压：220V10%，（49.550）Hz外形尺寸：552mm400mm230mm仪器净重：22.5kg二、面板介绍及使用方法（一）面板722型分光光度计面板各旋钮如图3-4-1所示。1.数字电压表 2.消光调零旋钮 3.T、A、C选择开关 4.消光调斜率电位器5.浓度调节旋钮 6.光源室 7.电源开关 8.波长手轮 9.波长刻度10.试样槽拉手 11.100%调节旋钮 12.T调零旋钮 13.灵敏度调节旋钮 14.干燥器图3-4-1 722型分光光度计外型（二）使用方法使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。以及各个操作旋钮之功能。在未接通电源前，应该对于仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。接地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。 仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒（在仪器的左侧），如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶，或者倒出烘干后再用。仪器经过运输和搬运等原因，可能会造成波长及吸光度的准确度发生变化。如前所述，分光光度计属于国家强制检定项目，所以，此机在使用前应经过计量单位检定，取得检定证书并在计量有效期内才能进行使用。使用步骤如下：1将灵敏度旋钮调置“1”挡。此时虽然放大倍数最小，但仪器最稳定。2开启电源开关，电源指示灯应亮。将选择开关置于“T”挡，调节波长调节器，将波长调至测试用波长下。预热20分钟。3打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“000”。在比色皿架内放入参比比色皿及待测溶液杯的比色皿，盖上试样室盖。拉动比色皿架，使参比液处于光路中，此时，光电管受光。调节“100”旋钮，使数字显示为“ 1000”。4如果显示不到“1000”，则可适当增加灵敏度数值。但尽可能使用较低挡，以使仪器稳定性更好。改变灵敏度后，必须按重新校正“0”和“ 100.0”5反复调整两三次“0”和“100”后，仪器即可进行测定工作。6吸光度A的测量：进行过上述5步后，将选择开关置于“A”挡。调节吸光度调零旋钮，使得表头显示为“000”。然后将被测样品移入光路，表头所显示的值即为被测样品的吸光度。7浓度C的测量：将选择开关由“A”旋到“C”。将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值。然后将被测样品移入光路，即可读出被测样品的浓度值。8在大幅度改变测试波长后，应稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间）。稳定后，重新调整“0”和“100”。才能进行测定。三、维护保养1为确保仪器稳定工作，在电压波动较大的地方，应将该机接到稳压器上使用。2当仪器工作不正常时，如数字表无亮光，光源灯不亮，电源指示灯不亮，应先检查仪器后盖上的保险管是否开路，再检查仪器的电源线是否有问题。最后再怀疑电路部分。3仪器要接地良好。4仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥性。发现筒内的硅胶不再为蓝色后，应及时更新或烘干后再用。还有两包干燥剂在样品室内，也应经常烘干。5为了避免仪器积灰和沾污，在工作过后，应用塑料套子罩住整个仪器，并在套内应放数袋干燥剂。6仪器工作数月或搬动后，要检查波长和吸光度的准确度。以确保仪器的使用状态。7每台仪器所配套的比色皿，不能与其他仪器上的比色皿单个调换。8本仪器数字表后盖，有一个01000mV信号输出接口。插座的1脚为正，2脚为地。9在360nm以下波段使用时，如果使用石英比色皿(751型)，可获得更佳效果。四、仪器的调校及故障处理 仪器使用较长时间后，可能发生一些故障，或者仪器的性能指标有所变化，需要进行调校或修理，现分别简单介绍如下，以供使用维护者参考。（一）仪器的调校1光源灯的更换和调整：光源灯是易损件，当更换光源灯后，有可能造成光源灯偏离正常位置而影响正常测量。所以在更换光源灯后，应对其位置进行精确调整。在更换光源灯时应带上洁净的手套，以防止手汗污染灯壳而影响光亮。本机采用12V/30W插入式钨卤素灯。更换灯泡时应先切断电源，然后，用附件中的扳手旋松钨灯架上的两个紧固螺丝，便可将旧灯取下。然后装上新灯。将波长调至580nm左右，开启电源开关，并将选择开关置T 挡。上下左右慢慢移动灯的位置，直到成像在入光孔上。选择适当的灵敏度开关，观察数字表读数，再轻微移动灯的位置，直至表头读数最大为止。最后将两紧固螺丝旋紧。需要注意的是，通电后，灯的两个紧固螺丝上加着光源灯的电压，当钨灯点亮时，不要随意调节它。否则，会损坏光源灯的稳压电路。2波长准确度的检查与校正：一般情况下，将波长调到580nm,在比色皿暗盒内，放置一白色纸卡，若能观察仪器出射的光为黄色。然后，将波长调到590nm处,仪器出射的光为橙色。在这种情况下，波长误差基本上在允许范围之内，可不必调整。若不是这种情况，说明波长超差，应对波长进行校正。本仪器的分光系统采用光栅作为色散元件，其色散是线性的。因此，波长分度的刻度也是线性的。仪器附有一块用来校正波长的镨钕滤光片。通常是利用其在529nm处的吸收峰来进波长校正。方法是：在透射比T挡时，将镨钕滤光片放入所带的滤光片架中，然后将其垂直放入比色皿盒内，并使其处于光路中。从520nm向540nm慢慢调节波长，同时观察透射比变化。当找到透射比最小处时，停止转动