（病原生物学专业论文）真核表达质粒pcdna3mdcifnγvp1的构建及免疫效果研究.pdf

。 - 一一；：i 目录 呲y 州1 吣8 骶0 叭叭0 砒5 州0 l l 4 矾 中文摘要o o oooooo oooo ooo ooo doo ooo 1 英文摘要o ooo oo 4 研究论文真核表达质粒p c d n a 3 m d c - i f n - y - v p i 的构建及免疫 效果研究 前言d ooo o0 o ooioo ooo 8 日u 舌”“”一”“一”“。 ” “一“”一” 材料与方法o i o oooo ooooo o00 0oo ooo 9 结果“o oo ooo 2 0 附图o o0 goo o o oooo o ooooo ooo oooooooo oom ooooooo 2 3 附表o oo ooo o oooooo ooo ooooo 3 3 讨论4 0 结 仑- 4 5 参考文献4 6 综述细胞因子作为d n a 疫苗基因佐剂的研究进展5 l 致 谢6 6 个人简历6 7 中文摘要 真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n y v p 1 的构建及免疫效果研究 摘要 目的：柯萨奇病毒b 组3 型( c o x s a c k i e v i r u sg r o u pbt y p e3 , c v b 3 ) 是引 起人类病毒性心肌炎的主要病原体。v p l 是c v b 3 的主要衣壳蛋白，含有 几个t 细胞和b 细胞表位，免疫原性强，可刺激机体产生保护性的中和 抗体。但国内外研究表明，编码v p l 的d n a 疫苗免疫小鼠后虽然可诱导 机体产生中和抗体，但效价比较低，不能有效阻止致死量c v b 3 的感染。 因此，如何增强v p l 基因的免疫原性，提高免疫保护作用是当前倍受关 注的问题，也是本室近几年的研究重点。 本室曾采用d n a 疫苗的靶向策略【5 1 ，将巨噬细胞源趋化因子( m d c ) 与v p l 基因融合，构建成融合d n a 疫苗p c d n a 3 m d c v p l ，对致死量 的c v b 3 攻击的保护率有一定程度的提高，但仍达不到实用程度。本室曾 尝试利用i l 一2 、i l 1 8 、g m c s f 等细胞因子作为基因佐剂，来提高 p c d n a 3 m d c v p l 融合d n a 疫苗的免疫原性，都有一定的效果，但仍 不能有效阻止致死量病毒感染。 i f n - 1 , 是一种能对多种细胞产生上调和诱导m h c i 、i i 类分子作用 的细胞因子。m d c 对抗原提呈细胞( a p c ) 的趋化作用，更好的发挥干 扰素的免疫增强作用，同时介导v p l 进入a p c 细胞，从而促进抗原加工 递呈。另外m d c 对t h 2 细胞具有趋化作用，这将增加a p c 和t h 2 细胞 的结合机率，从而增强v p l 引起的免疫效应。本研究联合应用m d c 和 i f n - y ，构建了真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n 吖v p l ，通过免疫小鼠后 诱导的特异性免疫应答水平和病毒攻击后免疫保护作用来观察接种后的 免疫效果。 方法： ( 1 ) 利用本室前期构建的p c d n a 3 i f n 吖质粒，用自行设计 的i f n 吖特异性引物进行p c r 扩增；( 2 ) 将扩增产物与p m d l 8 t 载体连 接，构建质粒p m d l 8 t i f n 丫，转化d h 5 0 t 大肠杆菌，筛选重组子，提 取质粒进行酶切鉴定和测序；( 3 ) 取酶切的i f n 吖片段与经过同样酶切的 中文摘要 p c d n a 3 m d c v p l 载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核 表达重组质粒p c d n a 3 m d c i f n 丫v p l ，并进行测序；( 4 ) 用碱裂解法 从转化的d h 5 a 大肠杆菌中大量提取质粒p c d n a 3 m d c i f n 吖v p l 、 p c d n a 3 m d c v p l 、p c d n a 3 v p l 和p c d n a 3 i f n - y ，用聚乙二醇( p e g ) 沉淀法进行纯化；( 5 ) 动物实验：将6 8 周龄雄性b a l b c 小鼠随机分 为5 组，每组2 3 只；分别为生理盐水对照组、p c d n a 3 v p l 对照组、 p c d n a 3 i f n y 对照组、p c d n a 3 m d c v p l 对照组、p c d n a 3 m d c i f n 1 ， v p l 组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次 每只接种1 0 0 u g ，每3 周免疫一次，共免疫3 次；每次免疫后第2 0 天， 眼眶静脉采血，分离血清，用微量中和试验( 固定病毒稀释血清法) 检 测血清中c v b 3 特异性中和抗体。第三次免疫后3 周，每组3 只小鼠取脾 脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒( c e l lc o u n t i n gk i t 8 ，c c k 8 ) 法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性t 淋巴细胞( c y t o t o x i c tl y m p h o c y t e ，c t l ) 杀伤活性的检测：另每组2 0 只小鼠用5 l d 5 0 c v b 3 进 行腹腔注射，观察并记录小鼠存活情况至感染后第2 l 天。 结果：( 1 ) 用自行设计的i f n 吖特异性引物经p c r 扩增出了i f n - 7 基因片段，基因片段的长度与预期结果符合。( 2 ) 成功构建原核克隆载体 p m d l8 - t i f n y ，d n a 测序证实目的基因序列与g e n b a n k 登录序列相同。 ( 3 ) 基因序列插入p c d n a 3 m d c v p l 后，酶切和测序结果证实成功构 建了p c d n a 3 m d c i f n 。1 ，v p l 。( 4 ) 各次免疫后血清c v b 3v p l 特异性 i g g 水平分别为：p c d n a 3 m d c v p l 组1 ：7 0 7 ， l ：1 6 8 2 ，1 ：2 8 2 8 ： p c d n a 3 m d c - i f n - y vp 1 组1 ：7 3 2 ，1 ：1 8 0 2 ，1 ：2 9 2 8 ；其余组各次平均 效价均低于1 ：5 。单因素方差分析表明，三次免疫后以上两组中和抗体滴 度逐次增加，但两组之间无统计学差异。其他各组间无差异。( 5 ) 小鼠 脾淋巴细胞增殖活性经单因素方差分析表明，以c v b 3 刺激时， p c d n a 3 m d c i f n y v p1 组高于p c d n a 3 m d c v p1 组( p 0 0 5 ) ；以c o n a 刺激时，两组无差异。( 6 ) 小鼠脾淋巴细胞特异性c t l 杀伤活性经单因 素方差分析表明，p c d n a 3 i f n 吖组、p c d n a 3 m d c i f n - 7 v p i 组均高于 p c d n a 3 m d c v p l 组( p o 0 5 ) 。( 7 ) 用5 l d 5 0c v b 3 攻击小鼠，各组平 均存活率分别为：生理盐水对照组1 0 ，p c d n a 3 i f 2 q y 组2 0 ， p c d n a 3 v p l 组15 ，p c d n a 3 m d c - 、坤1 组4 0 ， 中文摘要 p c d n a 3 m d c i f n 吖一v p1 组3 5 。 结论：( 1 ) 成功构建了原核表达质粒p m d l 8 - t i f n 吖。( 2 ) 成功构建 了真核表达质粒p c d n a 3 m d c i f n - ) v p l 。( 3 ) 用致死量c v b 3 攻击小 鼠后，各组均未能有效的增强小鼠的免疫保护作用，不能预防致死量 c v b 3 感染。( 4 ) 小鼠免疫后血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高。 ( 5 ) p c d n a 3 m d c - i f n y v p l 免疫组诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖活 性和特异性c t l 杀伤活性高于p c d n a 3 m d c v p l 免疫组。( 7 ) 通过中 和抗体滴度、特异性淋巴细胞增殖指数、特异性c t l 杀伤活性实验，证 明p c d n a 3 m d c i f n 丫v p l 融合疫苗免疫小鼠后，免疫保护作用有一定 的提高。 关键词：柯萨奇病毒b 组3 型( c v b 3 ) ；d n a 融合疫苗；佐剂：巨噬 细胞源趋化因子( m d c ) ；干扰素丫( i f n - 丫) ；中和抗体；小鼠 英文摘要 c o n s t r u c t i o no fp c d n a 3 m d c i f n - - - v p la n ds t u d yo ni t s i m m u n o l o g i c a le f f e c ti nm i c e a b s t r a c t o b j e e t i v e ：c o x s a c k i e v i r u sg r o u pbt y p e3 ( c v b 3 ) i n f e c t i o n s a r e c o m m o nc a u s e so fa c u t ea n dc h r o n i cm y o c a r d i t i si nh u m a n v p1i sam a j o r c a p s i dp r o t e i no fc v b 3 ，w h i c hc o n t a i ns e v e r a lt - c e l l a n db c e l le p i t o p e s ， w h i c hc a ni n d u c et h ep r o d u c t i o no fe f f e c t i v en e u t r a l i z i n ga n t i b o d y b u tm o s t s t u d i e sh a v es h o w e dt h a ta l t h o u g ht h ev a c c i n ec o n s t r u c t e dw i t hv p1a l o n e c o u l di n d u c et h ep r o d u c t i o no fa n t i b o d y , t h et i t r e so ft h ea n t i b o d yp r o d u c e d w e r e u s u a l l yt o o l o wt o p r o t e c t t h eh o s tf r o ml e t h a lc v b 3 c h a l l e n g e t h e r e f o r e ，i ti sn e e d st ob er e s o l v e dt oe n h a n c et h ep r e t e c t i v ee f f e c to fv p1 g e n ev a c c i n e ，w h i c hi st h ef o c a lp o i n to fr e s e a r c hi no u rl a b t h er e c o m b i n a n td n av a c c i n ep c d n a 3 m d c v p1 e n c o d i n gm d ca n d c v b 3v p1h a db e e nc o n s t r u c t e di no u rl a bw h i c hu s e dt a r g e ts t r a t e g yo fd n a v a c c i n e i te n h a n c e dt h ep r o t e c t i o nr a t eo fl e t h a lc v b 3c h a l l e n g e b u tt h e r e c o m b i n a n tv a c c i n ei si m p e r f e c t i ns o m ec a s e s ，i te n h a n c e dt h ep r o t e c t i v e e f f e c to fp c d n a 3 m d c - v p1d n av a c c i n ew h i c hi l 2 、i l 18 、g m c s fw e r e u s e da sg e n ea d j u v a n ti no u rl a b b u ti ts t i l lt or e m a i nc a nn o t p r o t e c tt h eh o s t f r o ml e t h a lc v b 3 c h a l l e n g e i f n 吖i sak i n do fc y t o k i n ew h i c hc a nu p - r e g u l a t i o nm a n yc e l l sa n d i n d u c et h ea c t i o no fm h c ia n di i m d cc a nb e t t e re d u c ei m m u n o l o g i c a l e n h a n c e m e n to fi n t e r f e r o nd e p e n d so nt h ec h e m o t a x i st oa p e a tt h es a m e t i m e ，i tc a np r o m o t ea n t i g e n p r o c e s s i n ga n da n t i g e n p r e s e n t i n ga b i l i t yb y m e d i a t i n gv p 1t oa p c m o r e o v e r , m d ch a sc h e m o t a x i st ot h 2 s oi tw i l l e n h a n c e i m m u n o l o g i c a l e f f e c ti n d u c e d b y v pl t h r o u g hr a i s i n g t h e p r o b a b i l i t yo fb e i n gi n t e g r a t e sb e t w e e na p ca n dt h 2 w ec o n s t r u c t e d e u k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l a s m i dp c d n a 3 m d c - i f n - 7 - v p1 t h r o u g h c c o m b i n e dw i t hi f n - t ，t oo b s e r v ei t si m m u n i z a t i o ne f f e c to nf u s i o ng e n e d n av a c c i n e t h r o u g h t h el e v e lo f s p e c i f i c i m m u n e r e s p o n s e a n d 4 英文摘要 一_ _ 一 i m m u n o p r o t e c t i o ni nm i c e m e t h o d s ：( 1 ) t h ed n af r a g m e n to fi f n - yw a sa m p l i f i e db yp c r f r o m t h ep l a s m i dp c d n a 3 i f n - 7 ( 2 ) 1 1 1 ep c rp r o d u c tw a sl i n k e dt op m d 18 t s i m p l ev e c t o ra n dw e r et r a n s f o r m e dt oe c o l id h 5 a ，i n s e r t e dt h er e c o m b i n a n t c l o n ew e r es e l e c t e d t h ep l a s m i dw a si d e n t i f i e db yb a m hic u t t i n ga n d s e q u e n c i n g ( 3 ) t h e i n s e r t e d s e g m e n t w a s i s o l a t e d ，l i n k e d t o p c d n a 3 m d c v p 1c u g e db yt h es a m ee n z y m e st oc o n s t r u c tae u k a r y o t i c e x p r e s s i n gp l a s m i d o fp c d n a 3 m d c i f n - y v p1 a r e rt r a n s f o r m e d ，t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dw a s i d e n t i f i e d b ye n z y m ec u t t i n ga n ds e q u e n c i n g ( 4 ) l a r g ep r e p a r a t i o n w e r e p e r f o r m e d t o o b t a i nt h e p l a s m i d s o f p c d n a 3 m d c i f n 吖v p1 ，p c d n a 3 m d c - v p 1 ，p c d n a 3 v p 1 ， a n d p c d n a 3 i f n yf r o mt r a n s f o r m e de c o l id h 5 a ，a n dp u r i f i e db yp e g ( 5 ) b a l b cm i c ea g e d6 - 8w e e k sw e r ed i v i d e di n t of i v eg r o u p sa tr a n d o m i n c l u d i n gs a l i n ec o n t r o lg r o u p ，p c d n a 3 v p 1c o n t r o lg r o u p ，p c d n a 3 i f n - 7 g r o u p ，p c d n a 3 m d c v p l g r o u pa n dp c d n a 3 m d c i f n - t 。v p 1 g r o u p e v e r y g r o u pc o n s i s t e do f 2 3m i c e t h ep l a s m i dw e r ei n o c u l a t e dt ot h em i c e i n ad o s eo f10 0 u go fd n ae v e r ym o u s e ，i n t r a m u s c u l a r l y ( i m ) i nq u a d r i c e p s m u s c l ea t3 - w e e ki n t e r v a l sf o r3 t i m e s t w e n t yd a y sa f t e re v e r yi n j e c t i o n ，s e r a w e r ec o l l e c t e da n dt h et i t e r sf o rc v b 3 一s p e c i f i cn e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e sw e r e t i t r a t e d t h r e ew e e k sa f t e rt h e t h i r di m m u n i z a t i o n ，s p l e n o c y t e sf r o m3 i m m u n i z e dm i c e so fe a c hg r o u pa n dh a r v e s t e dt oa n a l y z et h el y m p h o c y t i c p r o l i f e r a t i v ea c t i v i t ya n ds p e c i f i cc t lc y t o t o x i ca c t i v i t yb yc c k 一8a s s a y a t t h es a m e t i m e ， a n o t h e r t w e n t y m i c e sw e r e s u b j e c t e d t o i n t r a p e r i t o n e a l ( i p ) c h a l l e n g ew i t h5 l d s o c v b 3a n dt h en u m b e ro fs u r v i v i n g a n i m a l sw a sm o n i t o r e du pt ot w e n t y - o n ed a y sp o s ti n f e c t i o n r e s u l t s ：( 1 ) 1 1 1 eg e n ef r a g m e n t so fi f n 吖w a sa m p l i f i e db yp c r t h e l e n g t ho ft h ef r a g m e n t sw a ss a m e a se x p e c t e d ( 2 ) t h ep r o k a r y o t i cc l o n e v e c t o r sp m d18 m f n yw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ，d n as e q u e n c i n g s h o w e dt h a tt h es e q u e n c e si si d e n t i c a lt ot h es e q u e n c er e c o r d e di ng e n b a n k ( 3 ) a f t e rt h eg e n ef r a g m e n t sw e r ei n s e r t e dt ot h ep c d n a 3 m d c v p1 ，t h e , m b i n e dd l a s m i d 。d e n t i f i e db yc u t t i na n d therecombinedp l a s m i dw a sl g e n t l t t e ge n z y m ec u t t i n ga n as e q u e n c i n g , t h e s 英文摘要 r e s u l t sw e r ei d e n t i c a la se x p e c t e da n ds u g g e s t e d t h a tt h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i n g p l a s m i do fp c d n a 3 m d c i f n - 7 。v p 1h a db e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y ( 4 ) t h em e a nt i t e r so fn e u t r a l i z i n ga n t i b o d y a f t e r e v e r y i m m u n i z a t i o ni n p c d n a 3 m d c v p lg r o u p w e r e1 ：7 0 7 ，1 ：1 6 8 2 ，1 ：2 8 2 8 ，r e s p e c t i v e l y , a n d t h a ti np c d n a 3 m d c i f n - 7 一v p lg r o u pw e r e1 ：7 3 2 ，1 ：18 0 2 ，1 ：2 9 2 8 ， r e s p e c t i v e l y t h em e a nn e u t r a l i z i n ga n t i b o d yt i t e r s i ns a l i n ec o n t r o lg r o u p ， p c d n a 3 v p 1c o n t r o lg r o u pa n dp c d n a 3 i f n - yg r o u pw e r ea l ll o w e rt h a n 1 ：5 t h es t a t i s t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ed i f f r e n c e so fn e u t r a l i z i n ga n t i b o d y t i t e r so fe v e r yg r o u pp r o d u c e da f t e rt h es e c o n di n o c u l a t i o n ，t h em e a n n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y t i t e r si n p c d n a 3 m d c v p 1 g r o u p ， p c d n a 3 m d c - - i f n - t - - v p 1 g r o u p w a sh i g h e ra n dh i g h e r ,b u tw a sn o t s i g n i f i c a n tw h e na n a l y s e db yt h em u l t i p l ec o m p a r i s o n o t h e rg r o u p sw e r en o t s i g n i f i c a n t ( 5 ) w h e ns t i m u l a t e db yc v b 3 ，t h es p l e n o c y t e sf r o mv a c c i n a t e d m i c e sw i t hp c d n a 3 m d c i f n 一丫一v plg r o u ps h o w e ds t r o n g e rp r o l i f e r a t i v e a c t i v i t yt h a np c d n a 3 m d c - v p 1g r o u p ( p 0 0 5 ) w h e ns t i m u l a t e db yc o n a ， t h ep r o l i f e r a t i v ea c t i v i t yo fm i c e si nt h et w og r o u p sw e r en o ts i g n i f i c a n t ( 6 ) t h es p e c i f i c l y m p h o c y t i c c t lc y t o t o x i c a c t i v i t y o fm i c e sw i t h p c d n a 3 i f n 吖g r o u pa n dp c d n a 3 m d c i f n 一丫一v p 1 g r o u pw e r es t r o n g e r t h a n p c d n a 3 m d c - v p 1 g r o u p ( p 7 8 。 5 ml i c l 溶液：称取l i c i1 5 6 9 ，加水定容至5 0 m l ，过滤除菌，分 装保存。 1 3 p e g ( 8 0 0 0 ) 溶液：称取n a c i9 3 6 9 ，溶于8 0 m l 水中，得1 6 m n a c i 溶液；再称取p e g ( 8 0 0 0 ) 1 3 9 ，加入n a c l 溶液中，混匀，加水 定容至1 0 0 m l ，过滤除菌，分装保存。 1 8 2 琼脂糖凝胶电泳试剂 载样缓冲液： 电泳缓冲液( 5 0xt a e ) 0 2 5 溴酚蓝 2 5 二甲苯青 8 0 甘油水溶液 1 2 1 9 ( 4 0 m m ) t r i s 一碱 18 6 9 ( 2 m m ) e d t a n a 2 2 8 5 5 m i 冰乙酸定容至5 0 0 m l 1 8 3 细菌培养基及相关试剂 2 y t 液体培养基： 胰蛋白胨1 6 9 酵母浸膏粉1 0g n a c l5 9 溶于9 5 0 m l 蒸馏水中，用1 mn a o h 调 p h 至7 2 ，加水定容至1 l ，高压灭菌。 2 y t 固体培养基： 1 0 0 m l 液体2 y t 培养基中加入1 5 9 琼脂粉，高 压灭菌。 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) ：称取1 9 氨苄青霉素溶于2 0 m l 生理 盐水中，配制成储存液( 浓度为10 0 m g m 1 ) ，经过 0 2 2 u r n 滤器过滤除菌后，于2 0 保存。 1 8 4 细胞培养基及相关试剂 r p m l l 6 4 0 液体培养基：r p m l l 6 4 0 粉剂1 0 4g ，加入碳酸氢钠2 9 ， 溶于去离子水中，以1m h c l 调节p h 至6 8 ，定 研究论文 容至1 0 0 0 m l ，0 2 2 9 i n 滤器过滤除菌后，于4 。c 保 存。 d h a n k s 液的配制： 氯化钠( ( n a c l )2 9 氯化钾( k c b0 1 9 磷酸氢二钠( n a h p 0 4 12 h 2 0 ) 0 3 8 9 碳酸氢钠( n a h c 0 3 ) 0 0 8 7 5 9 磷酸二氢钾( r d q 2 p 0 4 ) o 0 15 9 三蒸水定容至2 5 0 m l ，0 2 2 岬滤器过滤除菌，4 。c 保存。 t r i s n h 4 c i 的配制： ( 1 ) 0 1 7 m o l lt r i s b 液 2 0 5 4 9t r i s 加8 0 m l 三蒸水，1mh c i 调节p h 至7 6 5 ，定容至 1 0 0 m l 。 ( 2 ) o 7 4 7 9n h 4 c i 溶于9 0 m l 三蒸水，再加10 m lt r i s b 液，0 2 2 1 a m 滤器过滤除菌，4 保存。 胎牛血清：5 6 灭活3 0 分钟，分装后于2 0 保存。 胰蛋白酶：称取胰蛋白酶粉剂0 2 5 9 ，溶于1 0 0 m lh a n k s 液中，搅拌 均匀，用5 6 碳酸氢钠调节p h 至7 2 ，0 2 2 “m 滤器过滤除菌， 2 0 保存。 1 9 主要实验仪器及设备 t g l l 18 台式低温高速离心机太仓医疗器械厂 低速离心机北京医用离心机厂 t d 型电子天平金诺仪器有限公司 t n 型托盘式扭力天平上海第二天平仪器厂 c h a s 恒温振荡器常州国华电器公司 w g p 3 0 0 型电热恒温培养箱万达仪器有限公司 空气浴振荡培养箱哈尔滨东联技术开发公司 可调微量移液器( 2 10 0 0 9 1 )g i l s o n 公司 $ 6 4 8 电热恒温水浴箱上海医疗器械七厂 一7 0 低温冰箱日本三洋公司 研究论文 2 0 低温冰箱 u v 一7 5 4 紫外可见分光光度计 h b p x 2 2 0 型p c r 仪 d y u i i i 型稳压稳流电泳仪 f r 9 8 0 电泳图像分析系统 超净工作台 c 0 2 培养箱 o l y m p u s 倒置生物显微镜 普通光学显微镜 31 8 c 多功能型酶标仪 2 方法 日本三洋公司 山东高密彩虹分析仪器有限公司 h y b a i d 公司 北京六一仪器厂 复日科技有限公司 哈尔滨东联技术开发公司 日本三洋公司 日本o l y m p u s 公司 日本o l y m p u s 公司 上海三科仪器有限公司 2 1 原核重组质粒p m d l8 - t i f n y 的构建 2 1 1 引物设计 根据g e n b a n k 登录的i f n y 基因序列( m 0 0 8 3 3 7 ) 及m d c 和v p l 序列，设计上下游引物，引入b a m hi 酶切位点，经引物分析软件p r i m e r p r e m i e r5 0 分析其可行性。由上海生工生物工程公司合成。 l i f n y l ( 两端带l i n k e r 的i f n y ) 引物： 上游： 5 7 一c a c q 鱼笪匹g g t g g a g g t g g p 汀c a c t c a t g g c t g t t t c t g 3 下游： 5 - c c g q q 2 竖a c c g c c a c c c c g c t t c c t g a g g c t g 3 上游引物含有b a m hi 识别序列( 下划线部分) 和起始密码子a t g ， b a m hi 识别序列和起始密码子之间含有接头序列( l i n k e r ) ，5 ，端有3 个 保护碱基。下游引物含有b a m hi 识别序列( 下划线部分) 和接头序列 ( l i n k e r ) ，5 端有3 个保护碱基。 2 1 2p c r 反应扩增i f n y 基因【9 1 以小量提取的质粒p c d n a 3 i f n y 为模板，按t a b l e1 向0 2 m l e p p e n d o r f 管中依次加入各种试剂，混匀并稍离心，置于p c r 仪中。循环 参数为：9 4 c 预变性5m i n ；9 4 c 变性4 5 s ，5 4 c 退火4 5 s ，7 2 。c 延伸5 0 s ， 3 0 个循环；7 2 * c 延伸5 m i n 。扩增产物经1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2 1 3p c r 产物的回收与纯化 研究论文 采用天根生化科技有限公司的胶回收试剂盒回收p c r 产物，步骤如 下： 2 1 3 1 将p c r 产物经琼脂糖电泳后，用干净的手术刀切下含预期大小的 d n a 片段的琼脂块放入1 5 m le p p e n d o r f 管中。2 1 3 2 向每o 1 9 琼脂糖胶 加入3 0 0 j t l 溶胶液p n ，混匀后5 0 水浴1 0 m i n ，使胶彻底溶解，其间不 断温和上下翻转离心管。 2 1 3 3 待溶解的胶溶液降至室温后，将其加入一个吸附柱中，1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0 s - 6 0 s ，倒掉收集管内液体：将吸附柱重新放入收集管中。 2 1 3 4 向吸附柱中分别加入7 0 0 u l 和5 0 0 1 a l 漂洗液p w1 2 ，0 0 0r p m 离心 3 0 s , - - 一6 0 s 各一次，倒掉收集管内液体；将吸附柱重新放入收集管中。 2 1 3 51 2 ，0 0 0r p m 离心2 m i n ，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或5 0 温箱数分钟，彻底晾干。 2 1 3 6 将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量 洗脱缓冲液e b ，室温2 m i n 。1 2 ，0 0 0r p m 离心2 m i n 收集d n a 溶液。产物 一2 0 保存备用。 2 1 4 回收的i f n y 基因扩增产物与p m d l 8 tv e c t o r 的连接【9 连接反应中插入片段与载体片段的摩尔数之比为3 - 一4 ：1 。反应混合 物置1 6 1 2 1 6 小时。具体连接反应体系见t a b l e2 。 2 1 5 感受态e c o l id h 5 e t 的制备 取2 0 保存的e c o l id h 5 a 菌株，于2 y t 平板上划线接种，3 7 过 夜培养。挑取直径2 - 一3 m m 单菌落，接种3 m l2 y t 培养基，3 7 。c 振荡过 夜培养。取过夜培养菌液6 0 1 a l 转种到3 m l2 y t 液体培养基中( 接种比例为 l ：5 0 ) ，3 7 。c 振荡培养3 h 至o d 6 0 0 约o 2 o 4 之间。每3 m l 菌液分装2 个e p p e n d o r f 管，4 。c 4 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清，收集菌体，加新鲜 配制用冰预冷的o 1 mc a c l 26 0 0 9 l 管，冰浴静置1 h 后，4 。c4 0 0 0r p m 离心 1 0 r a i n ，弃上清，收集菌体，加o 1 mc a c l 21 2 0 1 a l ，用于转化。 2 1 6 转化【l o 】 取步骤2 1 4 连接产物分别加入1 2 0 9 ld h 5 0 t 感受态菌，冰浴3 0 r a i n ， 4 2 。c 热休克9 0 s ，冰浴2 r a i n ，加入2 y t 培养基8 8 0 1 a l ，3 7 振荡培养4 5 m i n ， 短暂离心，吸去8 5 0 i t l2 t y 上清，其余部分均匀涂布于含1 0 0 9 9 m l a m p i c i l l i n 的2 y t 固体培养基上，室温放置2 0 r a i n ，待液体吸干后，3 7 c 研究论文 倒置培养1 2 1 6 h ，转化实验分组见t a b l e3 。 2 1 7p c r 产物与p m d l 8 tv e c t o r 连接的阳性克隆筛选( 快速质粒小量抽 提) 【l o 】 从转化平皿中挑取若干转化子接种于3 m l2 y t 培养液( 含a m p i c i l l i n ) ， 3 7 振荡培养l o 小时，进行质粒d n a 的小量抽提，方法如下：1 5 m l 过 夜培养菌液，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5 s e c ，沉淀悬浮于1 0 0 i t ls o li 中，振荡混 匀，置冰浴5 m i n ，加入2 0 0 t x ls o li i ( 1 临用前配制) ，轻轻倒置几次混匀，较 透明有粘稠感后再加入1 5 0 1 x ls o li i i ，混匀，冰浴5 m i n ，1 2 ，0 0 0r p m 离心 1 0 m i n 。吸取上清，加r n a s ea1 0 u ，6 0 消化3 0 m i n ，等体积酚：氯仿：异 戊醇，抽提一次，加入2 倍体积的无水乙醇，2 0 放置1 0 m i n ，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，沉淀用7 0 无水乙醇洗涤一次，烘干后，沉淀溶于2 0 “l 三 蒸水中，2 0 保存备用。 2 1 8 目的基因阳性克隆的鉴定 用b a m hi 对可疑重组质粒进行酶切鉴定，酶切反应体系见t a b l e4 。 依次加入表中各组分后，轻弹管壁混匀，瞬时离心，3 7 水浴1 小时。反 应产物经1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。凡能切下与目的片段长度一致片段的 质粒，可初步断定为重组质粒，能提取出这一质粒的菌落为含重组d n a 的阳性克隆。将这一菌落的细菌接种半固体培养基，送上海生工生物工程 公司测序。 2 2p c d n a 3 m d c i f n y v p l 真核表达重组质粒的构建。 2 2 1 将测序证实的p m d l8 - t l i n k e r - i f n y l i n k e r 进行酶切，回收、纯 化i f n y 片段。本科室保存的含有b a m hi 酶切位点的p c d n a 3 m d c v p l e d n a 进行酶切、回收、纯化酶切产物p c d n a 3 m d c v p l 片段。