硒的形态分析方法概述及其在生物有效性研究中的应用.doc

硒的形态分析方法概述及其在生物有效性研究中的应用摘要：硒的形态研究是了解环境中硒的毒性、生物可利用性、迁移和生物地球化学循环等方面的基础。本文总结了环境样品中硒形态的研究方法，及其形态分析在生物有效性研究中的应用。关键词：硒；形态分析；方法；生物有效性；应用1前言硒位于第六主族, 是一种准金属元素。地壳中硒的丰度仅为0.05-0.09 g/g, 但由于人为因素与自然因素的影响使硒在自然界中分布日益广泛, 一般大气、水、土壤中硒水平为g/g-ng/g级。一定条件下, 各种形态的硒类化合物可相互转化。有报道以葡萄糖作为外加碳源, 研究天然水体中亚硒酸钠通过微生物反应转化为单质硒和挥发态硒(如二甲基硒、二甲基二硒) 的实验。1957年，Schwar首先证明硒作为谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心, 是人体必需的微量元素。近年来, 适量的硒摄入水平与癌症、心血管病、糖尿病、白内障、老年痴呆症等各种疾病的密切相关性日益引起人们的重视。我们在贫硒地区通过口服亚硒酸钠来治疗预防克山病、大骨节病。硒作为多种重金属元素(如Cd、Hg等)的天然解毒剂、可拮抗环境中多种有害物质的毒性。硒化合物的生理、生物活性，及其在环境中的迁移转化规律，同硒存在的化学形态及不同化学形态下硒的浓度水平直接相关。硒分析方法在研究生命科学、环境科学、材料科学等领域均具重要意义。1 环境中硒的存在形式硒存在形式的早期研究主要集中于矿床学、矿物学和环境地球化学。朱建明等1于2003年对已发现的107种硒矿物进行了总结和归类，概述了表生环境中硒的存在形式。环境中硒主要以无机和有机硒形式存在(表1)2-4,5，不同硒形态间会因pH、Eh和生物作用(如甲基化)等因素的影响而发生转变，其中pH-Eh是主要的影响因素。图1给出了常温常压下不同形态硒稳定存在的pH-Eh范围。表一 环境中主要的硒化合物2,5Table 1 The major selenium compounds in the environment硒化合物化学式存在条件无机硒硒化氢(-a)H2Seb气体，不稳定，水中易分解成Se0硒氢化物(-)Se2-还原环境，金属硒化物，土壤中元素硒(0)Se0还原环境稳定存在，水中不溶解亚硒酸盐()SeO32-弱氧化条件，易溶解，如土壤或大气颗粒偏亚硒酸盐()HSeO32-酸性或中性条件，易还原，如土壤中二氧化硒()SeO2化石燃料燃烧放出的气体，易溶于水硒酸盐()SeO42-弱氧化条件，易还原，易为植物利用硒酸根()SeO42-，HSeO4-一般土壤环境有机硒二甲基硒化物(DMSe)(CH3)2Seb土壤中微生物、细菌形成的挥发组分二甲基二硒化物(DMDSe)(CH3)2Se2b植物形成的挥发组分二甲基硒砜(CH3)2SeO2bDMSe的前期还原挥发产物，由代谢形成三甲基硒(CH3)3Se+动物代谢产物，以尿形式排放注：a表示无机硒化合物中硒的价态；b表示该硒化合物具有挥发性。此外，生物体内还有硒代半胱氨酸(Selenocysteine)、硒代胱氨酸 (Selenocystine)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine)、硒乙硫基氨基酪酸(Selenothionine)、硒甲基硒代半胱氨酸( Se-methyl selenocysteine)、硒甲基硒代蛋氨酸(Se-methyl selenomethionine)、-谷氨酰硒甲基硒代半胱氨酸( -glutamyl-Se-methyl selenocysteine)、硒蛋白(Selenoprotein)等有机硒化合物5,6，对它们的分离和定量分析一般要用仪器联用技术。图1 常温常压下硒的pH-Eh图7Fig.1 Eh-pH diagram of selenium species at 25，1atm ，and Se=10-6M2总硒测定2.1分子荧光分析法和吸光光度法现行中华人民共和国标准中采用 2,3-二氨基萘荧光法8。原理是利用四价硒与DAN(2,3-二氨基萘)反应生成强荧光特性的4,5-苯并苤脑，用有机溶剂萃取后在荧光分光光度计上于激发波长366nm、发射光波长520nm处测定荧光强度。此法选择性好、灵敏度高，但操作繁琐费时且试剂需进口且对人体有害。王守兰等9用该法测定富硒米、富硒茶中痕量硒，检出限为1ng。常规荧光法测定硒时，存在485nm杂质荧光峰与519.2nm检测荧光峰相重叠，干扰了硒的测定，使结果偏高。胡益水10采用一阶导数荧光法测定茶叶中的硒，有效地消除干扰，改善了灵敏度和检测限。紫外及可见分光光度法为硒的常用分析方法，常用试剂有环戊酮、硫代乙醇酸苯肼、 二氨柯嗪、邻苯二胺等、以及3,3-二氨基联苯(DAB)和2,3-二氨基萘(DAN)应用最为广泛11-13。杨明敏等14在0.5mol/L盐酸介质中用巯基棉富集水中硒()，解吸后用一种新的萃取分光光度法测定，本法基于硒()将碘离子氧化成碘络离子，碘络离子和结晶紫分子形成的配合物被二甲苯萃取，检测下限可达0.5g/L。此外，催化光度法也常用于食品中痕量硒的分析。郝素娥15应用催化光度法测定了硒酵母中有机硒的含量，测定原理是四价硒能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合生成的红色偶氮染料的吸光度在一定范围内与硒成正比。刘长久16利用阻抑氧化甲基橙动力学光度法测定四价硒，研究了反应的最佳条件及动力学参数，建立了动力学光度法测定痕量硒的新方法。寻找高灵敏度的显色试剂和建立高灵敏的显色体系依然是光度法今后的研究方向。2.2原子光谱法原子吸收光谱法是基于物质所产生的原子蒸汽对特定谱线的吸收作用来进行定量分析的一种方法。石墨炉原子吸收光谱法存在硒的挥发损失、干扰等问题。张奇等17在用石墨炉原子吸收法测定样品中硒时采用不同的基体改进剂均获得较好的效果。王宏18采用石墨炉平台技术和塞曼扣背景系统消除基体干扰，并用铜基体改进剂，测定了鸡蛋中微量硒，也获得满意结果。氢化物石墨炉原子吸收光谱法是近年来发展起来的一项技术。它使测定元素转化成气态氢化物与基体分离，受干扰较小、灵敏度高、重现性好。马玉平19将流动注射技术与之结合，克服了间歇式氢化物发生器操作复杂，测定速度慢的缺点，使该法的实用价值得到提高。样品不经分离，直接进样测定。刘波静等20用氢化物原子吸收法测定螺旋藻中痕量硒，结果令人满意。该方法下限可达17ng/g，样品回收率为98.89%-101.20%。氢化物原子荧光光谱法21原理是将样品中硒转化为Se()，用NaBH4或 KBH4作还原剂，将Se()在HCl介质中还原成SeH4，由载气带入原子化器中进行原子化，在硒特制空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，在去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光，其荧光强度与硒含量成正比。氢化物原子荧光光谱法，测定食品中硒准确度高、灵敏度、精密度好，线性范围宽，所用试剂毒性小，实用性强，已列入国标法。在任何高温气体中，如有1%以上原子或分子被电离，该气体即具有相当大的电导率，这种自由电子、离子和中性原子或分子组成的中性气体，即称为等离子体20。HG-ICP-AES已广泛应用于啤酒、蜂蜜、猪肉中痕量硒的分析22。在天然药物中该法也常被使用。2.3电化学法测定硒的电化学法有电位滴定法、溶出伏安法、催化极谱法、离子选择电极法等，应用较多的是溶出伏安法和催化极谱法，具有仪器简单、灵敏度高、应用范围广等特点。葛宣宇23自制的玻碳金膜电极采用微分电位溶出伏安法测定了矿泉水中的硒，最低检出限0.5g/L。汪振辉等24用Nafion修饰金膜玻碳电极溶出伏安法测定痕量硒，解决了非汞电极测定硒时重现性差的问题，同时改善了灵敏度和选择性。硒在很多底液中都能产生良好的极谱波，但以Na2SO3 -NH4Cl-HClO4 -KIO3底液法测定硒灵敏度最高。汪模辉25用催化极谱法测定茶叶和大麻笋中的痕量硒，采用二阶导数法测定，线性范围为0-50ng/25ml，检出限为1.44ng/25ml。极谱法存在的缺点是电极易被污染，电活性物质有毒性。2.4其它分析方法气相色谱法(GC)测定四价硒有很高的灵敏度和可靠性。原理是利用邻苯二胺及其衍生物选择性地与四价硒生成苯并硒二唑，通过色谱法分离，用电子捕获器进行检测。靳利娥26将枸杞用密封消化罐分解消化，加入KBH4将其中的硒转化为氢化物，用液氮冷阱捕集、 浓缩，通过GDX-104色谱柱进行分离，检出限为8.610-11g，分析了大同、太原、运城和忻洲四地所产枸杞中硒的含量。高效液相色谱法(HPLC)与GC原理相似，使用的是荧光检测器。离子色谱配以电导检测器多用于样品中硒的形态分析。中子活化技术测定硒具有快速、准确、灵敏度高且能同时分析许多元素等优点，但一般实验室不具备该实验仪器设备，还未得到广泛应用。使用电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)测定硒灵敏度高，但基体干扰严重，适当的前处理有助于清除干扰，改进进样技术也可使检测限进一步降低。3形态分析食品中的硒多以硒蛋白和硒代氨基酸等有机态存在。目前，测定有机硒的方法大多是测其总量-先测定无机硒()含量，再测总硒含量，两者差值即为有机硒的含量，对其中硒的形态研究较少。然而食品中硒的形态不同，在人体内代谢途径不同，产生的功效也不同，因此，分析硒的形态也十分必要。3.1硒蛋白的分离纯化硒蛋白的分离纯化方法有盐析法、离子交换法、薄层色谱、凝胶色谱、气相色谱及电泳法等。吴永尧等27用(NH4)2SO4分段盐析，分子筛柱层析，分离出水稻中硒蛋白组分。聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对蛋白质分子量的确定有很好的精确性，而且样品的预处理简单，适合对未知蛋白质的分离和测定。谢申猛等28采用凝胶电泳技术分离恩施高硒地区大豆中含硒蛋白组分，分辨出27条蛋白条带，用高效液相色谱荧光法对这些条带分别进行硒含量测定，发现13条硒蛋白，用标准分子量蛋白标定含硒蛋白组分的分子量。3.2硒蛋白及氨基酸的检测普遍认为，在谷物、大豆和硒酵母中硒主要以硒代蛋氨酸形式存在，而动物组织中硒主要以硒代半胱氨酸存在，约占总量的50%以上。郝素娥等15用透析法使硒酵母中有机硒和无机硒分离，再用氨基酸分析仪测定了硒酵母中硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，采用低速长柱，与其它氨基酸的分离度达90 %以上。农晋琦等29将硒半胱氨酸甲基化，硒胱氨酸还原后再甲基化生成甲基硒半胱氨酸与溴化氰发生专一性反应生成硒氰酸甲酯，再用气相色谱法测定了硒酵母和硒蛋白中的硒氨基酸。随着现代分析仪器的发展，各种联用技术的使用使硒的形态分析更加广泛和深入。吴永尧等27将硒蛋白经酸水解后采用标准样对照法用高效液相色谱分离，检出硒代氨基酸，再用质谱法进一步确定其形态。李方实30提出了一种高效液相色谱分离和ICP-MS或FAAS作为元素专一检测器在线测定硒的化学形态方法，用ESA阳离子色谱柱以柠檬酸铵为流动相，分离测定三甲基硒离子、硒代蛋氨酸、亚硒酸和硒酸盐。各种联用技术中HPLC-ICP-MS和CE-ICP-M灵敏度较高。文献31,32用 RP-HPLC-ICP-MS分析海鸥蛋中的有机硒化合物，分析出6种硒化合物，其中两种用标准加入法确证为硒半胱氨酸和硒胱氨酸。HPLC-ICP-MS和CE-ICP-MS联用技术进行形态分析常需同标准物质对照完成，尽管可灵敏提供样品分离后相应元素测量信息，但不能给出对应的结构组成，电喷雾质谱技术ESI-MS与HPLC、CE等分离手段联用可完全地分析溶液中存在的金属类生物大分子化合物的化学键结构与金属结合或螯合的特定蛋白质、氨基酸分子的结构，但其灵敏度较低。今后，在提高硒检测方法灵敏度和准确度的同时，要发展对硒的各种形态分离富集技术和高灵敏度、高选择性的分析方法。4形态分析在研究微量元素生物有效性中的应用 食品中微量元素的形态分析不能停留在静态检测，而应该将该技术应用到如何提高微量元素的生物有效性和开发功能食品的研究上。微量元素在人体和其他生物体内的代谢过程和生物活性的研究与功能食品的开发具有密切的关系，前者可以为功能食品的研究开发提供重要的指导作用和质量控制的生物标准，而后者的发展可以提高食品中微量元素的生物有效性，从而提高食品的营养价值。4.1微量元素在生物体内代谢和生物活性的研究金属/非金属元素在生物体内的消化吸收、代谢、排泄等生物系统过程中通常存在多种化学形式33,34，通过测定元素的化学形态，对于研究元素在生物体内的生物活性或毒性以及代谢过程，对开发含有某种微量元素的功能食品及提高微量元素在人体内的生物有效性具有重要的意义。H.Gonzlez Iglesias等35利用HPLC-ICP-MS，以74Se和77Se为追踪同位素，测定老鼠身体组织液中的硒形态，研究硒在体内的主要反应和代谢情况。亚硒酸盐在生物体内很容易和血红蛋白结合，与谷胱甘肽反应被还原为硒化物，然后部分流入到血浆与白蛋白结合，转移到肝脏(GSSeSG)；一部分在血流中与蛋白结合，形成硒蛋白。Y.Ueda等36还以82Se 为追踪同位素用HPLC-ICP-MS研究老鼠体内硒蛋白P(Sel P)和细胞外谷胱甘肽过氧化物酶(eGPx) 的代谢情况，显示在老鼠体内注射示踪82Se 后，硒蛋白P(Sel P)中的82Se明显增加，而6-9h后含量下降；而eGPx中的82Se含量在6h后还持续增加。该研究证明了硒可以在肝脏中快速并有效地转化为Sel P，并转移到血浆中，而在肾脏中转化为eGPx并转移到血浆的过程比较缓慢。食品中微量元素的生物活性与其形态密切相关，例如SeMet是主要的硒氨基酸，是人和其他动物摄取硒的主要来源，具有较高的生物有效性。通过食品中微量元素的形态分析，了解微量元素的生物活性可以作为评价日常食品营养价值的生物标准。Reyes等37用二维色谱(排阻-反相)研究了富硒酵母中的含硒化合物的生物有效性，并采用ESI-MS在线与HPLC联用模拟测定肠胃消化过程中产生的低分子量硒化合物，结果发现SeMet是胃肠酶提取物中的主要成分，而SeOMet是长时间保存后的主要降解产物。溶剂提取物和残留物中的硒总量测定显893%的硒化合物可以通过胃肠消化提取，但是其中只有341%是自由态的SeMet，其余的硒化合物主要分别以低、中、高分子量的形式存在。实验说明胃肠液可以有效地融解酵母中与蛋白结合的硒形态，然而将他们转化为自由态的SeMet的效率较低。残留物中经SDS提取发现其中只有132%的硒化合物被提取出来，说明了残留物中的硒主要以非蛋白的形式存在，并且与不溶的基体化合物结合。4.2功能食品及食品质量控制Clark等38的研究及美国国家研究委员会39建议摄取硒量控制在200g/d可以达到预防疾病的效果，仅靠日常普通食品摄取硒元素根本无法达到这个标准；而在食品中直接添加的微量元素，人体并不能很好地吸收利用(一些元素的利用率不到1%)，只有存在于自然食品中的以各种生物化学态结合的微量元素才能更有效地被人体吸收利用或保留。因此，通过自然添加微量元素而开发的功能食品是人类摄取充分微量元素的健康食品，例如谷物可以从土壤中吸收硒元素，然后通过食物链进入人体被人体吸收利用。植物生长的环境对植物中微量元素的含量及形态起着决定性作用。通过这种微量元素在植物中的积累和转化作用，可以通过在土壤中添加某种微量元素达到发展功能农作物的目的。Stadlober等40研究了奥地利在土壤中加入含硒化物的复合肥使不同的谷物硒浓度增加情况。在实验中，作者利用阴离子交换色谱与ICP-MS联用鉴定并定量分析谷物中的硒化合物，以10mmol/L含2%甲醇的柠檬酸缓冲溶液为流动相，4种硒化合物 selenate、selenite、SeCys和SeMet6min可以达到基线分离。他们还研究了其他5种硒化合物Sehcys、Secysta、Seet、TmSe和DmpSe的保留行为，比较了水提取和酶水解生物基体提取硒总量，结果发现水提取率仅3%-9%，然而用酶水解提取率可以达到80%-95%，谷物中主要的硒形态是SeMet。土壤或其他生长环境中微量元素含量过高，会导致农作物中微量元素浓度过高，从而对人体造成危害。可以通过某些植物能吸收并积累有毒微量元素的作用，即植物对土壤的修复作用，来改善农作物的生长环境，如Brassica juncea可以吸收积累土壤中的硒。利用植物修复作用可以作为解决环境特别是土壤环境重金属污染的措施，这是一个经济有效的方法。研究元素在植物中的元素形态，了解微量元素在植物中的积累和转化过程，对研究植物修复作用有着重要的意义。Kahakachchi等41用HPLC-ICP-MS和GC-AED考察了在不同硒形态组织液培养条件下，Brassica juncea中根和芽不同部位对硒形态的吸收积累及代谢过程。实验结果显示根和芽不同部位对硒形态的吸收积累量不同，并且硒酸盐比亚硒酸盐更容易被植物的根吸收和在该植物中积累。从而探索了利用该植物的元素积累特征，除去环境中某些污染元素的一个有效方法。Montes-Bayn等42用离子对反相色谱与ICP-MS和ESI-MS联用测定了Brassica juncea中的硒形态，研究了硒在植物中的积累和代谢情况，Brassica juncea在分别含有selenate、selenite和SeMet的溶液中培养，结果发现，硒在Brassica juncea体内生成非蛋白硒化合物如MeSeCys，说明该植物对硒的毒性有较大的耐受性，而植物体内硒的吸收积累量与最初的硒形态关系为：selenateSeMetselenite。Vonderheide等43采用离子对色谱与ICP-MS、ESI-MS联用测定出Brassica juncea根释放物中含有硒胱氨酸(SeCys)2)、硒硫酸根离子(SSeO32-)和二甲基硒(CH3SeCH3)。4.3饲料添加剂动物饲料中添加某些必需微量元素可以促进动物生长，并预防疾病。刘文龙等44用ICP-AES氢化物发生法测定生物样品中的痕量硒。他们对若干生物样品进行分析并进行加样回收试验，其中用高压微波消化法对饲料进行处理后，回收率可达93.1%-94.5%。5展望随着临床化学、毒理学和营养学等科学领域的不断发展，微量元素形态分析对21世纪分析化学工作者提出了严峻的挑战，特别是在食品、医药和环境等研究领域中的微量元素形态分析显得尤为重要和迫切。采样、制备、消化和提取等前处理过程是形态分析至关重要的环节，必须保证此过程中不能破坏元素形态的结构，如温和、高效的酶水解消化和提取等方法。因此，发展稳定和高效的前处理方法是形态分析的重要任务之一。在各种学科领域相互交叉的今天，特别是生物科学和化学相结合的领域，形态分析也会在更多的领域中得到应用：(1)在营养学上，人们越来越重视食品的营养价值及其安全性，建立一个安全、可靠的食品安全及营养评价体系至关重要，元素形态的分析可以为此提供鉴定的标准；(2)在功能食品的开发研究上，含有某些微量营养元素的功能食品已得到初步的发展(如市场上已经出现了富硒大米，富硒鸡蛋，营养品等健康食品)，但是这些功能食品中微量元素的检测有待于进一步的完善，需要深入研究食品中的元素形态和微量元素形态的生物有效性，从而为食品工业开发功能营养食品提供重要信息和有利的生物标准，最终指导食品的生产、加工制备过程，以提高微量元素在人体的生物有效性；(3)通过研究植物中微量元素的形态，开发利用某类植物对环境的修复作用达到改善环境是一个具有很大前景的环境修复手段；(4)在药学、毒理学等领域，形态分析也可以发挥积极的作用。6.参考文献1朱建明,梁小兵,凌宏文,等.环境中硒存在形式的研究现状J.矿物岩石地球化学通报,2003,22(6):73-811.2Frankanberger W T,Benson S.Selenium in the environmentM.New York:Marcel Dekker,Inc.,1994,1-416.3彭安,王子健,Whanger 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