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模式识别受体在先天免疫中的作用：Toll样受体最新研究进展Toll样受体作为识别病原保守结构的成分，其发现大大促进了我们对机体是如何感知病原入侵、引起先天免疫反应并启始针对特定病原的适应性免疫反应的认识。尽管TLRs对宿主防御是很关键的，但已经越来越明确，TLR信号传递负性调节的缺失，以及TLRs对宿主自身分子的识别，都与炎症反应和自身免疫疾病的发病机理有密切的关系。而且，现在已经清楚的知道，TLRs和最近证实的胞浆先天免疫感受器的相互作用，对发动有效的免疫反应是至关重要的。本文将阐述TLR在宿主防御和疾病中的生物学作用的最新研究进展。在过去的十年中，人们对先天性免疫识别细菌成分以及它在宿主抵抗感染中的关键作用的认识，已经取得了极大的进步。早期的观点认为先天性免疫反应非特异性识别细菌;然而，在19世纪90年代中期，TLRs的发现表明：先天性免疫对病原的识别实际上是特异的，它依赖由生殖细胞编码的PRRs，PRRs已经进化为识别涉及病原相关分子模式（PRRs）的外源病原成分。TLRs是I型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重复区的胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区介导PAMPs的识别；胞内区的TIR结构域是信号向下游转导所必需的。截至目前，已经分别在人和小鼠身上发现了10种和12种可以发挥功能的TLRs，其中的TLR1-TLR9是二者共有的。由于一种逆转录病毒的插入，小鼠的TLR10并不发挥作用，而TLR11、TLR12和TLR13已经在人的基因组中丢失。对每一种TLR缺陷型小鼠的研究表明，它们各自在PAMPs识别和免疫反应中发挥不同的作用。几种TLR胞外区晶体结构的说明为证实一些PAMPs可以充当TLRs的配体提供了结构上的认识。TLRs可以识别来自于细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的包括脂质、脂蛋白、蛋白和核酸等成分。PAMPs可在细胞的不同部位被TLRs识别，这些部位包括胞浆膜、内噬体、溶酶体和内噬溶酶体。TLRs在细胞上的合适定位，对于配体结合的难易、对诸如核酸之类的自身分子耐受的维持以及下游信号转导都是至关重要的。自从包含TIR结构域的接头分子My88被发现后，TIR信号转导通路得到了大量的研究。随后其它包含TIR结构域的接头分子的发现表明，不同的TLRs选择性的招募不同的接头分子，针对感染的细菌做出特异性免疫反应。研究表明，特定类型细胞的信号通路决定他们的免疫性能。例如，浆细胞样DC和炎性单核细胞有特定的信号通路控制抗病毒反应，可能其它的细胞就没有。最近，TLR信号传导领域的科学家投入了大量的注意力在转录后修饰、信号分子空间结构调整以及TLR靶基因的特性描述的研究。TLRs发现后，包括RLRs和NLRs在内的几类细胞浆模式识别受体也先后被发现。RLR家族主要包括3个成员，RIG-1、Mda5和LGP2，它们主要识别RNA病毒。NLR家族包括超过20个成员，其中的一些可对多种PAMPs、非PAMP粒子和细胞应激做出反应，并引发包括分泌IL-1的炎性反应。另外，还有一些细胞表达自今未能鉴定的PRRs，它们识别双链DNA，并诱导产生型干扰素。这些PRRs可由包括非免疫细胞在内的许多种细胞表达，并且，有时识别与TLRs相同的PAMPs。这些PRRs和TLRs一起在先天和获得性免疫反应中发挥重要作用。图：PAMP被细胞表面的TLRs识别，TLR4和MD2一起与LPS结合形成复合物。LPS六条链中的5条与MD2结合，剩下的一条与TLR4结合。受体多聚体的结构是由两个拷贝的TLR4-MD2-LPS复合物组成，通过招募包含TIR结构域的接头分子TIRAP（mal）和MyD88（MyD88依赖通路）来启动NF-B早期活化的信号传递。继而，TLR4-MD2-LPS复合体被内在化并保留在内噬体中，在内噬体中它通过招募TRAM和TRIF来引发导致IFR3和晚期NF-B活化的信号转导，进而诱导型干扰素的生成（TRIF依赖通路）。早期和晚期NF-B的活化对于炎性细胞因子的诱发都是必要的。TLR2-TLR1和TLR2-TLR6异二聚体分别识别三酰脂肽和二酰脂肽。三酰脂肽的三条链中的两条与TLR2结合，另一条与TLR-1（没有TLR-6）的疏水通道结合。TLR2-TLR1和TLR2-TLR6通过招募TIRAP和MyD88来诱导NF-B的活化。TLR5识别鞭毛蛋白，并通过MyD88活化NF-B。尽管TLRs是抗感染的必不可少的保护性免疫，但不合适的TLR反应会导致严重的慢性炎症反应和全身性自身免疫疾病。确实，TLR介导的反应的负反馈调节缺失的小鼠会患这些疾病。更重要的是，越来越多的证据表明，死亡细胞产生的内源分子或是某些病理状态会刺激TLRs，并导致炎性反应和自身免疫疾病的发展或加速。在这篇文章中，我们研究了结构生物学、细胞生物学以及TLRs信号转导的现有认识，然后，我们会描述TLRs和胞浆PRRs在适应性免疫反应中的作用，最后，探讨TLR介导的内源分子的识别，以及它们在免疫系统中的作用的最新研究进展。细胞表面TLRs的结构和配体根据TLRs在细胞的结合位置和各自的PAMP配体，主要将其分成两个亚家族。一个由TLR21、TLR2、TLR24、TLR5、TLR6和TLR11组成，它们在细胞表面表达，并识别细菌表面的成分，如脂、脂蛋白和蛋白；另一家族有TLR3、TLR7、TLR8和TLR9构成，它们仅在胞内小泡中表达，如内质网、内噬体、溶酶体和内噬溶酶体，它们识别微生物核酸。TLR4，作为TLR家族最早发现的成员之一，被确认正是长期探求的对LPS做出反应的受体，LPS是革兰氏阴性菌外膜的成分，可以引起脓毒性休克。TLR4与MD2在细胞表面形成复合物，它们共同充当LPS的主要结合构件。对TLR4-MD2和LPS形成的复合物的结构的研究表明：LPS六条脂肪酸链中的五条结合在MD2的疏水袋上，而剩下的一条链被暴露在MD2的表面与TLR4结合。磷酸基团也与带正电的TLR4残基相互作用。受体多聚体的最终构造是由两个TLR4-MD2-LPS复合物组成的， 它通过招募胞内接头分子来启动信号转导。其它的一些蛋白，如LBP和CD14等，也参与了LPS的结合。LBP是可结合LPS的胞浆可溶蛋白，CD14是一个由糖基磷脂酰肌醇连接的，包含富含亮氨酸重复的蛋白，该蛋白可结合LBP，并传递LPS-LBP给TLR4-MD2复合物。除了结合LPS，TLR4还参与呼吸道合胞病毒融合蛋白、小鼠乳房肿瘤病毒封装蛋白、肺炎链球菌溶血素和植物源的抑制细胞生长的药物紫杉醇的识别，尽管TLR4和这些配体相互作用的在结构上的认识还没有得到证明。 TLR2广泛参与来自细菌、真菌、寄生虫和病毒的PAMPs的识别，包括细菌表面的脂肽、革兰氏阳性菌的肽聚糖和磷壁酸、分支杆菌的阿拉伯木聚糖脂、真菌的酵母聚糖、克氏锥虫的tGP2粘蛋白以及来自麻疹病毒的红血球凝集素蛋白。TLR2通常与TLR1或TLR6形成异二聚体。TLR2-TLR1异二聚体特异识别革兰氏阴性菌的三酰脂肽和支原体，而TLR2-TLR6异二聚体识别革兰氏阳性菌的二酰脂肽和支原体。有研究从结构认识上证实了这些异二聚体区分脂肽结构的机制。TLR2-TLR1和TLR2-TLR6共享一个m样结构（图1）异二聚体在TLR2-TLR1-配体复合物上，pam3CSK4的三条链中的两条与TLR2结合，而第三条链与TLR1的疏水通道结合。这样三酰脂肽的识别就实现了。然而，因为TLR6没有疏水通道，所以TLR2-TLR6异二聚体就不能够识别三酰脂肽。同时，TLR1和TLR6不同的脂质结合袋都负责脂蛋白的区分。而且，TLR2能够与细胞表面协助PAMP识别的共受体一同起作用。这些共受体包括CD 36和dectin-1，CD36可与TLR2-TLR6异二聚体共同介导部分TLR2激动剂的感知，而dectin-1是一种C型凝集素，可以结合真菌葡聚糖，并诱导其内在化。尽管确信，TLR2激动剂主要诱导产生炎性细胞因子、巨噬细胞的非型干扰素及DCs，它还可以响应牛痘病毒感染并诱使炎性单核细胞产生型干扰素，这表明，TLR2在抗病毒反应中具有针对特定类型细胞的作用。看起来，通常是诱使型干扰素产生因素的核酸，并不参与TLR2的活化。TLR5识别细菌鞭毛的鞭毛蛋白成分（图1）。小肠的CD11c+CD11b+固有层DCs对TLR5有高表达量。固有层DCs在促进产生IL-17的TH17细胞和TH1细胞的分化有非常特殊的作用，同时，对初始B细胞分化成产生IgA的浆细胞以应对鞭毛蛋白也有促进作用。而且，固有层DCs可以产生视黄酸，这使得体液免疫和细胞免疫都能够实现。小鼠的肾脏和膀胱相对于TLR5而言对TLR11有高表达量。TLR11被认为是用来识别导致肾盂肾炎细菌的成分的 ，因为TLR11缺失的小鼠容易感染这种细菌。TLR11还可以识别来自兔弓形虫的肌动蛋白样分子。核酸感应TLRs的结构和配体TLR3最初被认为是用来识别模拟合成的双链RNA（dsRNA）、聚肌胞苷酸（poly（I:C）的，它模拟病毒感染，并通过促进型干扰素和炎性细胞因子的产生来引发抗病毒免疫反应。识别的机制是通过对人的TLR3胞外区结合dsRNA的结构分析来阐明的（图2）。TLR3胞外区有一个大的马蹄样结构，它可能是为了增加表面积并帮助识别dsRNA.在TLR3胞外区凸出表面的侧面，dsRNA结合在N端和C端两个不同的位置，这为TLR3通过C端区域形成同二聚体提供了足够的稳定性。除了识别poly（I:C），TLR3还识别呼吸道肠道病毒的基因组RNA、单链RNA复制过程中产生的双链RNA、病毒（包括呼吸道合胞病毒、脑心肌炎病毒和西尼罗河病毒）以及某些小分子干扰RNA。TLR3通过产生型干扰素和炎性细胞因子来触发抗病毒免疫反应，这表明在抗病毒感染中发挥关键作用。TLR3缺陷的小鼠易于遭受小鼠巨细胞病毒的致命感染，而TLR3缺陷的人更易感染HSV-1。TLR7最初被确认识别咪唑喹啉衍生物，如咪喹莫特和瑞喹莫德（R-848）和鸟嘌呤类似物，如罗唑利宾（有抗病毒和抗肿瘤的特点），识别来自RNA病毒的单链RNA，如水泡性口膜炎病毒、A型流感病毒和人免疫缺陷综合症病毒（图2）。TLR7还识别合成的多聚尿嘧啶RNA和某些小分子干扰RNA。TLR7在pDCs有高表达量，pDCS在感染病毒后可以产生大量的型干扰素，而pDCs应答RNA病毒诱导产生的细胞因子完全依赖TLR7，这表明TLR7充当单链RNA病毒的感受器。而且，cDCs上表达的TLR7感应细菌RNA类型包括B型链球菌并诱导产生型干扰素。pDCs的TLR7介导的RNA病毒的识别以复制独立的方式发生。病毒被内在化并被招募到内噬溶酶体上，继而触发TLR7介导的对ssRNA的识别并起始抗病毒反应。而且，TLR7还可以识别复制的水疱性口炎病毒，它通过自噬的方式进入胞浆，自噬是溶酶体降解胞内蛋白的过程，这涉及到称为自噬体的具有双层膜的小泡的形成（图2）。在感染水泡性口膜炎病毒后，缺失可诱导自噬体形成的自噬相关蛋白Atg5的pDCs表现出产生型干扰素缺陷。pDCs表现出基本的自噬体形成。这些发现表明，pDC对于递呈胞质病毒复制中间体给溶酶体是至关重要的，在溶酶体中，TLR7参与它们的识别和随后的抗病毒反应的起始。TLR8与TLR7是在进化上最相似的。TLR8介导R-848和病毒ssRNA的识别。相对于TLR7缺陷的小鼠，TLR8缺陷的小鼠对这些激动剂反应正常。TLR8在许多组织中都有表达，而在单核细胞中表达量最高，细菌感染后还会上调表达量。TLR9识别未甲基化的2-脱氧（CpG）DNA基元，这一结构多见于细菌和病毒，而极少在哺乳动物细胞中出现（图2）。合成的CpG寡聚核苷酸充当TLR9的配体并直接活化DCs、巨噬细胞和B细胞，还促使强烈的TH1反应。DNA寡核苷酸有磷酸骨架时，DNA糖骨架的2脱氧核糖对于TLR9的识别是非常重要的。相反，在非天然的硫代磷酸骨架存在时，CpG基元是必不可少。TLR9在pDCs中有高表达量，而且它充当DNA病毒感染（如，小鼠巨细胞病毒、HSV-1和HSV-2）的感受器。除了识别DNA，TLR9还直接识别不溶性的结晶疟原虫色素，结晶疟原虫色素是作为恶性疟原虫消化宿主血红蛋白后排毒过程的副产品而产生的。核酸感应TLRs的细胞定位如前所述，核酸感应TLRs固定在细胞内的许多个不同的部位。内噬溶酶体酸化过程的阻断能够抑制TLR7和TLR9诱导的反应，这一发现表明，内在化的核酸分子被递呈给内噬溶酶体对于这些TLRs的相互作用是至关重要的。在未受刺激的细胞中，TLR9和TLR7被专门的隔离在内质网中，当接受配体刺激后，迅速的传递给内噬溶酶体（图2）。这种转运是由定植在内质网上的蛋白UNC93B1来调节的，UNC93B1是一个跨12层膜的蛋白。带有一个编码UNC93B1基因错义突变的小鼠，在应答TLR7和TLR9配体以及TLR3配体时，有产生细胞因子和上调共刺激分子的缺陷， 这种小鼠对细菌和病毒高度易感。据报道，UNC93B1缺陷与人类患者的HSV-1脑炎有关。来自这些患者的细胞对TLR3、TLR7和TLR9激动剂有低反应性，但是对细胞外的TLRs有完整的反应。UNC93B1特异结合内质网中TLR3、TLR7和TLR9的跨膜区，而且TLR7和TLR9在带有3d变异的DCs中不离开内质网。这些结果共同表明，UNC93B1协助TLR7和TLR9从内质网到内噬溶酶体的传递，这对于这些TLRs诱发免疫反应是必要的。TLRs的运输还受到另两个保留在内质网中的蛋白PRAT4A 和 gp96的调控。PRAT4A分别连接TLR4和TLR9，对于TLR4和TLR9分别被转运到胞浆膜和内噬溶酶体都是必要的。PRAT4A缺陷的细胞没有对TLR2、TLR4和TLR9激动剂的反应，而TLR3介导的反应在这些细胞中是完整的，这表明TLR3和TLR9转运的调控是不同的。TLR9是已知的有内噬溶酶体中的胞内蛋白酶降解的，它产生一个介导配体识别并起始信号转导的功能受体（图2）。可能介导TLR9降解的蛋白酶包括组织蛋白酶，如组织蛋白酶B，组织蛋白酶S，组织蛋白酶L，组织蛋白酶H和组织蛋白酶K，以及天冬氨酸肽链内切酶。然而，关于TLR9功能的降解依然存在争议。N末端区域的特殊富含亮氨酸重复的降解使得TLR9不能对配体反应，并且TLR9带正电的N末端区域可能介导与CpG DNA的结合，这表示完整结构在TLR9活化中的重要作用。 图2：胞内TLRs识别PAMP。TLR3识别来自病毒或被病毒感染的细胞的dsRNA。dsRNA结合在TLR3胞外区凸出表面的侧面的N端和C端两个位置，这使得TLR3通过C端区域形成同二聚体。TLR3活化TRIF依赖通路，诱导产生型干扰素和炎性细胞因子。在pDCs，TLR7识别来自内噬溶酶体的ssRNA病毒的ssRNA，并通过MyD88分别活化NF-B和IRF7，并诱导产生炎性细胞因子和型干扰素。另外，自噬体也参与了递呈ssRNA到表达TLR7的小泡的过程。TLR9识别来自细菌和病毒的RNA。TLR9通过胞内蛋白酶溶蛋白性降解对向下游的信号传导是必要的。在pDCs中TLR9通过招募MyD88来活化NF-B和IRF7。TLR3, TLR7 和 TLR9主要以稳定结合的形式定植在内质网上，并转移到内噬溶酶体，然后结合他们的配体。在内质网中，UNC93B1与这些TLRs相互作用，并且对这种转移是必不可少的。gp96缺陷的巨噬细胞在应对TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7和TLR9受体激动剂时，缺乏细胞因子诱导反应，gp96是内质网热休克蛋白90家族的成员。而且已证实gp96结合TLR9.这些发现表明，不像只调控某些特定TLRs转移的PRAT4，gp96担当TLRs的通用伴侣蛋白。TLR信号传导中包含TIR结构域的接头分子每个TLR都引发特定的生物学反应。如，TLR3和TLR4都产生型干扰素和炎性细胞因子反应，而细胞表面TLR1-TLR2,TLR2-TLR6和 TLR5主要诱导炎性细胞因子（图1和2）。这些不同由于包含TIR结构域的接头分子的发现而得到解释，这些接头分子包括MyD88, TIRAP(Mal),TRIF和TRAM,它们被各自的TLR招募，并活化各自的信号通路（图1和2）。MyD88是第一个被发现的TIR家族成员，被除了TLR3外的所有TLRs使用，并活化转录因子NF-B和有丝分裂原蛋白激酶MAPKs，进而诱导炎性细胞因子。相反，TRIF被TLR3和TLR4使用，并诱导其它的通路，进而活化转录因子IRF3和 NF-B，随后诱导型干扰素和炎性细胞因子。TRAM 和TIRAP充当类型接头分子，它分别为TLR4招募TRIF，为TLR2和TLR4招募MyD88。因此，TLR信号通路可以大致的分为MyD88依赖型通路和TRIF依赖型通路，MyD88依赖型通路驱动诱导炎性细胞因子，而TRIF依赖型通路同时负责型干扰素和炎性细胞因子的诱导。TLR4是唯一的同时利用四个接头分子并活化两个通路的TLR（图1）。TLR4最初招募胞浆膜的TIRAP，随后帮助招募MyD88来触发NF-B和MAPKs的初始活化。TLR4随后经历动力依赖的内吞作用，并被转移给内噬体，然后形成一个有TRAM和TRIF而不是TIRAP和MyD88的信号复合体，进而引发TRIF依赖通路的活化，导致IRF3的活化以及晚期NF-B和MAPK的活化。因此，TLR4活化MyD88依赖型通路早于TRIF依赖型通路。特别地，两个通路的活化对通过TLR4信号传导的炎性细胞因子的诱导都是必要的，与此相反，对于其它的TLRs，任何一个信号通路的活化都足以诱导产生炎性细胞因子。为什么单一信号通路的活化不能满足通过TLR4信号通路诱导产生的炎性细胞因子需要，仍然是个谜。MyD88依赖通路TLRs被它们同源的PAMPs结合后，MyD88招募IL-1相关受体激酶IRAK4, IRAK1, IRAK2 和 IRAK-3（图3）。IRAK4最先被活化，并对NF-B和MAPK下游的MyD88的活化发挥关键作用。IRAK的活化导致与TRAF6的相互作用，一个E3连接酶催化连接到靶蛋白上Lys63（K63）的多聚泛蛋白的合成，包括TRAF6自身和IRAK1协同二聚E2泛素结合酶UBC13和Uev1A。连接有K63的多聚泛蛋白链结合到TAB2和TAB3的新型锌指型泛蛋白结合域来活化TAK1，TAB2和TAB3是激酶TAK1复合体的调节成分。连接有K63的多聚泛蛋白链还结合到NEMO的泛蛋白结合结构域，NEMO是IKK复合体的必要调节成分，NF-B的活化需要它。因此，K63多聚泛蛋白链可能负责招募TAK1来形成IKK复合体，然后允许TAK1通过它临近IKK复合体的部分使IKK，通过磷酸化和随后的B蛋白的降解使NF-B活化。然而，Ubc13缺陷的细胞对TLR激动剂表现出正常的NF-B活化，不管NEMO的连接有K63的多聚泛蛋白是否缺陷，这表明在NEMO介导的NF-B活化中存在不依赖连接K63的泛蛋白的机制。由线状泛素链组装复合的NEMO的头尾相连的线性多聚泛素化已被证明在IKK活化过程中是非常重要的。TAK1通过诱导MAPK激酶的磷酸化（而不是泛素化）同时活化MAPKs Erk1, Erk2, p38和Jnk，然后活化多种转录因子，诱导AP-1，同时影响翻译。不管有没有正常的NF-B活化，Ubc3缺陷型细胞表现出削弱的MAPK的活化。但是，负责MAPK活化的Ubc3的直接靶标仍是未知。MyD88通路的活化导致许多基因的启动，而且其中的一些对依赖NF-B的转录有关键作用（图3）。这些基因包括I B蛋白I B ，它充当NF-B p50亚基的共诱导活化者，帮助IL-6和IL-12p40的诱导产生；C/EBP ，它和NF-B一同最大化IL-6的产生；I B-NS，它通过调节NF- B p65亚基的DNA结合活性抑制IL-6和TNF；以及ATF3，它通过招募组蛋白脱乙酰基酶来限制NF-B活化。TRIF依赖的通路TRIF依赖的通路在IRF3和NF-B都活化后达到高峰（图3）。TRIF招募TRAF6并活化TAK1用于NF-B的活化，这一过程有可能是通过依赖泛化素的机制，这一机制与依赖MyD88的途径相似。TRIF也可以通过同型RIP相互作用来获得RIP1. TLR3会活化激活与K63有关连的泛素，RIP1会经过这一泛素的处理，并且这一处理过程需要NF-B的激活。TRADD伴随着RIP1，缺少TRADD的细胞RIP1泛化素有缺陷，并且得不到NF-B的活化，这就意味着TRADD参与的RIP1的激活发生在TLP3的下游。Pellino-1是环状Pellino家族的一份子，其控制包括E3的泛素连接，Pellino-1缺失会导致RIP1泛化素的缺失，并且NF-B无法激活，以响应TLR3受体激动素的作用，尽管MyD88途径的NF-B激活仍然正常。综上所述，TRIF与TRAF6, TRADD, Pellino-1 ，RIP1组成高蛋白分子传递复杂的信息以用于TAK1的激活，TAK1的激活又反作用于NF-B 与MAPK的激活。除了能引导NF-B的激活以外，TRIF的依赖途径还能引导IRF3的激活与干扰素的转录。TRIF招募一个包括IKKs TBK1 和IKKi (IKK)在内的信息传递复合体，这个复合体可以促进IRF3的磷酸化，并且可以引导其向细胞核方向的转运。TBK1-IKKi被TRIF激活需要TRAF3. TRAF3的缺失会损害TLR3引导干扰素形成的过程，同时对于TLR7, TLR9 和 RLR的引导过程也有影响，这些都表明TRAF3在不同核酸的PRR的干扰素引导中起着十分重要的作用。TLR4的信号传递过程中TRAF3也会合并入MyD88的复合体上。但是，是将TRAF3依附于K48关联的泛素化过程，之后经cIAP1 与 cIAP2降解。cIAP1 与 cIAP2都是MyD88信号转导复合物的一部分，但不属于TRAF3复合物。TRAF3的促使降解膜近端的信号转导复合物的转移至细胞质这一过程又促使了TAK1的激活。这些发现都表明TRAF3能促进IRF3的激活，同时抑制MyD88依赖途径。依赖MyD88与TRAF3的依赖途径的在调控上的不同，是通过单一分子，这已在NRDP1的研究中有报告。NRDP1是一个包含环状E3连接酶，其可与TBK1相互作用并且可以通过K63关联的泛化素加强TBK1的激活过程，对上述过程，需要Ubc13的参与。同时它通过它的相互作用，以及MyD88的降解来抑制依赖MyD88的途径。通过这些分子来平衡应激细胞因子和型干扰素的产生量，可能在控制肿瘤细胞扩散和自身免疫疾病起至关重要的作用。pDCs中的TLR7和TLR9信号通路TLR7和TLR9信号通路已经得到了广泛研究，试图解释病毒感染后它们诱导产生型干扰素的可能性。pDCs中TLR7和TLR9的特殊之处在于它们都需要MyD88来诱导型干扰素（图3）。在这种情况下，pDCs稳定表达的IRF7 结合MyD88并与IRAK4, TRAF6, TRAF3, IRAK1 和 IKK形成复合蛋白信号复合物，IRF7被IRAK1与或或IKK 磷酸化，从复合物上脱离，并转移到核内。除了需要磷酸化，IRF7活化可能还需要TRAF6和Ubc13依赖的泛素化。然而，IRAK1, IKK 和 TRAF3分别地参与了IRF7, MyD88, IRAK4的活化，而TRAF6对IRF7 和NF- B的活化是关键的。控制pDCs产生型干扰素的其它成分也已经被发现（图3）。OPNi是由TLR9诱导的一种骨架蛋白前体，它在胞浆中是沉默的，而在pDCs中是MyD88-IRF7复合体的成分。药物抑制磷酸肌醇3 - OH激酶（PI（3）K）能消除IRF7的核易位。而且，mTOR 和p70S6K都是PI（3）K的下游靶标，mTOR 和p70S6K被抑制会打断TLR9和MyD88的相互作用，进而导致IRF7的核转移和型干扰素的诱导被削弱。这些发现表明，在病毒感染期间，PI(3)K-mTOR通路加速pDCs产生型干扰素。IRF5被结合到MyD88复合物，并控制IL-6 和 IL-12p40的诱导。MyD88-IRF5通路也被许多其它类型细胞的TLRs利用，如巨噬细胞和cDCs。敲除IRF8的pDCs表现出TLR9介导的型干扰素和炎性细胞因子诱导缺失，只有很少的NF- B活化，这表明可能IRF8和NF- B共同诱导细胞因子。CpG-TLR9信号复合体在内涵体中的保留也是pDCs控制抗病毒先天免疫反应的重要机制。A(D)型CpG寡脱氧核苷酸包含一个单一的CpG基元和一个多聚（G）尾巴在硫代磷酸二脂键骨架上，它可以诱导pDCs分泌型干扰素。它和TLR9, MyD88和 IRF7一同pDCs的早期内涵体中稳定保留。相反，B(k)型CpG寡脱氧核苷酸包含多个CpG基元在磷酸骨架上，它可以诱导cDcs产生IL-12和B细胞的活化，它迅速转移到晚期内涵体和溶酶体，导致很少的IRF7活化。图3：TLR信号通路的概述。TLR介导的反应主要有MyD88依赖型通路和TRIF依赖型通路控制，MyD88依赖型通路被除了TLR3外的所有TLR使用，而TRIF依赖型通路为TLR3和TLR4使用。TRAM 和TIRAP分别是TLR4和TLR2-TLR4复合体的类型接头分子。在cDCs和巨噬细胞，MyD88招募IRAK4, IRAK1, IRAK2 和 TRAF6，并通过活化NF- B, MAPK 和 IRF5来诱导炎性反应。TRAF6与TAB2和TAB3一同活化TAK1，并活化IKK复合体构成NeMO 和IKK，并催化IB蛋白用于磷酸化。NF- B 诱导 C/eBP , I B, I B-NS, Zc3h12a, ATF3 和 tristeraprolin (TTP)，进而影响基因编码IL-6, IL-12p40 或TNF。TRIF 招募 TRAF6, TRADD 和TRAF3。TRADD 和 Pellino-1 and RIP1相互作用。RIP1 和TRAF6 共同活化 TAK1，导致MAPK 和NF- B的活化。TRAF3 活化激酶 TBK1 和 IKKi进而磷酸化并活化IRF3，最后，控制型干扰素的转录。Nrdp1参与 TBK1-IKKi 的活化。TLR4信号传递过程中，TRIF依赖通路导致炎性激活。在 pDCs, TLR7 和TLR9与 IRAK4 和 TRAF6一起招募 MyD88，活化诱导炎性细胞因子的IRF5 和 NF- B，还活化诱导型干扰素的IRF7。对于IRF7活化，需要IRAK1- 和 IKK 依赖的磷酸化，而且TRAF3位于这些激酶的上游。OPNi 参与 IRF7 活化，并且OPNi参与 IRF7 活化，IRF8促进NF- B激活。PI(3)K-mTOR-p70S6K 轴加强 TLR7 和 TLR9信号通路。IRF1在 cDCs 而不是 pDCs中通过TLR7 and TLR9参与 I 型干扰素的诱导。在已发现的TLRs负调节因子中，TANK (抑制TRAF6), A20 (抑制 TRAF6和 RIP1), ATG16A (抑制炎性激活) and SHP-1 (抑制 IRAK1 和IRAK2)被认为是阻止由于增强的或延长的TLRs信号引起的炎性疾病。黄色，TLRs;绿色， 刺激因子; 粉色, 负调节因子; 蓝色，靶基因。TLR信号的负调节TLR诱导反应的负调节，对于抑制炎性反应和有害的免疫反应是非常重要的。目前，已经发现了在多个水平上抑制TLR信号通路的负调节因子。这些负调节因子包括接头分子的剪切变异体及其相关蛋白，泛素连接酶，脱泛素酶，转录调节因子和小RNA。本文我们重点关注了TLR介导免疫反应的负调节因子，其破坏或变异导致体内持续的炎症。TANK 结合TBK1和 IKKi，并且与NF- B 和IRF3的活化都有联系。TANK缺陷的小鼠自发形成自身免疫性肾小球肾炎，这种情况可以通过用抗菌素治疗抑制，或是MyD88和IL-6缺乏。尽管有完整的型干扰素诱导反应，TANK缺陷的巨噬细胞和B细胞表现出更多的NF- B活化和在应对TLR配体时产生更多的IL-6。TANK缺陷的细胞还表现出加强的TRAF6 泛素化。因此，TANK还充当巨噬细胞和B细胞TRAF6泛素化的负调节因子（图3）。编码自噬相关分子Atg16L1的基因的变异被认为与克罗恩氏病有关。Atg16L1缺陷的小鼠高度易感葡聚糖硫酸酯钠引起的急性结肠炎，可以通过用IL-1 和 IL-18的抗体治疗来阻止。而且，来自这些小鼠的巨噬细胞表现出更多的半胱天冬酶-1的活化，响应LPS也产生更多的IL-1 和 IL-18。在缺少Atg16L1时，由LPS导致的半胱天冬酶-1过度活化需要TRIF，这表明Atg16L1负调节TRIF依赖通路，并导致半胱天冬酶-1活化（图3）。而且，取自Atg16L1缺陷小鼠的小肠潘氏细胞表现出应对小肠损伤相关基因的更高表达。因此，Atg16L1对小肠炎症抑制是必要的。TLR刺激迅速诱导产生调节蛋白Zc3h12a，Zc3h12a包含一个CCCH型锌指结构域和RNA酶结构域。Zc3h12a通过RNA酶活性降解3非翻译区的IL-6mRNA和IL-12p40mRNA。在应对TLR激动剂时，Zc3h12a缺陷的巨噬细胞持续产生显著多的IL-6和IL-12p40，但是正常量的TNF，而Zc3h12a缺陷的小鼠具有更高的血液免疫球蛋白水平和自身抗体产物。这些结果共同表明，Zc3h12a通过影响mRNA稳定性和阻止自身免疫来负调节TLR诱导的炎性反应（图3）。另一个锌指蛋白，Xfp36，可阻止自身免疫性关节炎的发生。Xfp36结合TNFmRNA3非翻译区富含AU成分，并通过脱腺苷化移走poly（A）尾巴，进而导致降解（图3）。因此，这些锌指蛋白通过不同的机制来控制mRNA的稳定性。A20是有TLR刺激诱导产生具有两种酶活性的蛋白，它可作为E3泛素连接酶和脱泛素化酶。体外分析表明，A20通过调节RIP1和TRAF6来限制NF- B的活化。A20缺陷型小鼠由于自发的多器官炎症和多种恶病质而过早死亡，这表明A20在体内有抗炎性作用。同时缺失A20和MyD88使小鼠免于过早死亡，并减少这些小鼠的炎症反应。而且，服用抗生素可防止恶病质。因此，A20可以禁止由共生菌诱发的TLR信号。带有编码酪氨酸磷酸化基因SHP-1变异的小鼠，形成炎性损伤与应答TLR刺激时巨噬细胞的异常活化有关。MyD88缺陷抑制这种炎症，这表明SHP-1负性调节MyD88依赖通路。据报道，SHP-1还抑制IRAK1 和IRAK2的功能。PAMP识别中的非TLR胞浆PRRs先天免疫系统通过RLRs、NLRs和一种未知的dsDNA感受器识别胞浆PAMPs。RLRs (RIG-I, Mda5和LGP2)是解旋酶，通过接头分子IPS-1来识别病毒的RNA和信号，诱导抗病毒反应。NLRs代表了PRRs的一个大家族，应答包括多种PAMPs、非PAMP粒子和细胞应激在内的多种刺激。NLRs中，Nod1和Nod2识别细菌细胞壁成分的降解产物，而NLRP3 (NALP3)响应各种刺激形成炎性体复合物，通过半胱天冬酶-1促进IL-1和 IL-18的分泌。而且，细胞可通过未知通路触发型干扰素的诱导来响应来自病原的dsDNA和自身未能完全降解的dsDNA，尽管STING 和TBK1都是dsDNA触发信号所必需的成分。DAI (ZBP1-DLM1)已被确定为dsDNA的公认胞浆感受器，它在响应dsDNA时增加型干扰素的产生。但是，DAI缺陷型小鼠在用dsDNA刺激时有完整的型干扰素诱导，这表明DAI是多余的。AIM2包含一个pyrin和HIN-200DNA结合结构域，与dsDNA结合，并与ASC形成炎性体，触发IL-1 产生。半胱天冬酶-1依赖的IL-1 产生需要AIM2，但是，在应答dsDNA刺激，可递呈DNA给宿主细胞质的牛痘病毒（双链DNA病毒）和兼性细胞内的革兰阴性菌图拉弗朗西斯感染时，AIM2对于型干扰素的诱导不是必要的。而且，AIM2缺陷的小鼠相对于对照小鼠更易遭到F. tularensis的致命感染，可能是因为IL-1 产生的缺陷。因此，AIM2是dsDNA诱导的IL-1 生产而不是型干扰素的关键成分。磷酸酶Eya被认为是与STING和IPS-1相互作用的分子，可加强dsDNA和RLR信号传递中编码干扰素的基因的启动子，尽管其生理学作用尚不清楚。这些类型的胞浆PRRs可由许多细胞表达，包括免疫和非免疫细胞，如成纤维细胞和上皮细胞，而且可识别与TLRs共有的PAMPs。在感染期间的获得性免疫反应的背景下，这些PRRS特有的作用和共有的作用都已经得到了研究。在所有的PRRs中，TLRs主要在抗原递呈细胞如DCs和巨噬细胞，已经B细胞中表达，而且，许多TLR激动剂触发抗体反应以及TH1和TH17反应。多个水平的证据都表明TLR在获得性免疫中有关键作用。已经被pDCs的TLR7和其它细胞的RIG-1感应的一个感染流感病毒的体内模型，表明发动B细胞和CD4+T细胞反应需要TLR7而不是RIG-1。在疫苗模型中，TLR7表现为保护性免疫。而且，感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒后CD8+T细胞的分化需要TLR7，而不是RIG-1。这些数据共同证明了TLR7在诱导有效的抗病毒的获得性免疫反应中的作用。然而，TLRs还不足以诱导足够强烈的获得性免疫反应，因为CD8+T细胞应答A型流感病毒时不需要TLR7或RLRs。A型流感病毒可以活化NLRP3f炎性体，触发IL-1 产生，并且获得性免疫的形成也需要这一通路。尽管，有几种机制曾被认为是触发NLRP3炎性体活化的，但已证实，A型流感病毒诱导的NLRP3炎性体活化是独有的，病毒编码的M2离子通道负责触发这种活化。虽然胞浆PRRs对形成适应性免疫的相对贡献仍不清楚，但它已被认为，非抗原呈递细胞（非- APC）的PRRS的胞浆信号参与促进了DC-介导的获得性免疫反应。Poly(I:C)被用作免疫佐剂，并由TLR3和Mda5识别。TLR3 在 CD8 + DCs中有高表达量， CD8 + DCs对凋亡的病毒感染细胞有高吞噬活性。TLR3缺陷型DCs在它们吞噬负载dsRNA的细胞和病毒感染的细胞时，不能够发动CD8+T细胞反应。因此，在DCs中TLR3识别从病毒感染细胞传递来的dsRNA触发DC变异，并将病毒抗原呈递给MHC类分子，这刺激CD8+T细胞反应（图2）。这一过程，涉及到交叉引导，可以有最初被感染的细胞分泌的型干扰素和其它的细胞因子促进，在这些细胞中Mda5参与了病毒的识别和细胞因子的产生。实际上，一个用于评价poly(I:C)在TLR3和/或Mda5信号成分缺陷的小鼠中的佐剂效应的研究表明，针对特异抗原的抗体的产生和CD4+和 CD8+T细胞的分化是同时受到TLR3和Mda5介导的通路的调控。而且，一个研究展示了在DCs、单核细胞和间质细胞中poly（I:C）被Mda5识别和结果诱导型干扰素的产生，为人类免疫缺陷病毒Gag蛋白疫苗设计的的小鼠模型的TH1反应需要这一过程。这表明，APCs和非APCs的PRR信号以及它们的相互作用足够发动一个强烈的获得性免疫反应。非抗原递呈细胞在构建获得性免疫反应中关键作用，已经由DNA疫苗的研究得到解释，DNA疫苗综合了有抗原序列的质粒和其它使先天免疫反应成为可能的因素。理想的B细胞和T细胞反应的诱导不需要TLR9、RLR或DAI，但需要TBK1和STING。特别地，细胞转移实验已经解释了在造血细胞和非造血细胞中dsDNA的识别都是DNA疫苗在体内的辅助性所需要的。图4：TLRs和免疫疾病的内源激动剂。由死亡细胞如HMGB1释放的内源分子和热休克蛋白及ECM的成分被TLR2, TLR4或TLR2-TLR4识别。淀粉和氧化的LDL都是被TLR4-TLR6与其共受体CD36一同识别。感染后产生的氧化的磷脂和抗菌肽防御素2被TLR4识别。这些内源分子被细胞表面TLRs识别并导致炎症和修复反应。自身RNA和DNA月LL37一同被内在化到内涵体，并分别被TLR7和TLR9识别。HMGB1自身的 DNA复合物通过RAGE被内在化并被TLR9识别。包含免疫复合物的自身核酸分子同Fc受体如Fc RIIa被内在化，并刺激TLR7和TlR9。凋亡过程中自身DNA分子的不完全降解可能被胞内DNA感受器感知并活化TBK1。TLR7、TLR9和一种目前未知的DNA感受器识别自身核酸分子，导致型干扰素的产生，并促进自身免疫和炎性疾病。细胞表面TLRs的内源配体已经越来越明了，除了应答PAMPs，TLRs响应内源宿主分子并触发炎性反应。这些内源分子中的大多数都是由与细胞死亡、伤害和肿瘤细胞产生的，包括胞外基质的降解产物、热休克蛋白和高迁移率蛋白，它们充当细胞表面TLRs才刺激因子（图4）。而且，死亡细胞和含免疫复合物的自身抗原都含有自身核苷酸，由它们释放的染色体DNA和核蛋白复合物可刺激胞内TLR7和TLR9，并导致系统性自身免疫病的形成（图4）。作为损伤和炎症的结果，ECM被胞内蛋白酶分解，并清除出细胞。据报道，部分被清除出细胞的成分可以活化TLR2或TLR4，或活化两者（图4）。这些成分包括双糖链蛋白聚糖、透明质酸、多功能蛋白聚糖、纤连蛋白额外域A和表面活性蛋白A。双糖链蛋白聚糖因诱导产生炎性细胞因子和趋化因子，并且这种诱导会因TLR2和TLR4 的缺陷而完全丧失。双糖链蛋白聚糖缺陷的小鼠对酵母聚糖和LPS导致的休克有高抵抗性，并具有低TNF凝聚物和单核细胞渗透入肺，这这证明了biglycan-TLR2-TLR4通路在增强细菌诱导的肺损伤中的作用。透明质酸碎片在肺损伤后释放并聚积，能够刺激巨噬细胞通过TLR2和TLR4产生趋化因子。在透明质酸参与的非传染的肺损伤小鼠模型中，TLR2和 TLR4双重缺陷的小鼠呈现低存活率，与较少的招募炎性细胞，增强的上皮细胞凋亡和更多的组织损伤，表明TLR2-TLR4介导的透明质酸的识别促进炎症和修复反应。额外区A和表面活性蛋白A也是有TLR4识别。除了ECM成分，其它的细胞成分如HMGB1和热休克蛋白充当TLRs的配体（图4）。HMGB1是一种核非组蛋白，是脓毒性休克和缺血性再灌注模型的促炎性调节物，并被TLR2、TLR4或TLR9识别。HMGB1的无效化抗体抑制肝脏缺血再灌注模型的损伤，并且在这一模型中，TLR4缺陷的小鼠表现较低的损伤。这一发现表明，在非感染的状态下，TLR4响应内源分子并介导炎性反应。胞浆HMGB蛋白HMGB1, HMGB2和 HMGB3作为通用的核酸感受器，活化TLRs、RLRs和DNA感受器的作用已被阐明。热休克蛋白，包括Hsp60, Hsp70, Hsp22 和 gp96，也被认为与通过TLR2, TLR4或TLR2-TLR4活化巨噬细胞和DC，诱导促炎性调节物有关，尽管，尚不清楚这种效果是否是由于这些用大肠杆菌产物准备重组蛋白受到污染。TLRs还参与某些病理状态下的炎性反应。在非感染的炎性疾病如动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病，氧化低密度脂蛋白蛋白和 -淀粉样蛋白，分别触发无菌炎症并以依赖于TLR4和TLR6的方式识别（图4）。这一识别可能是通过TLR4-TLR6异二聚体在清道夫受体CD36的协助下完成的。多功能蛋白聚糖是一个在肿瘤细胞中积聚的蛋白聚糖，通过TLR2、TLR6和CD14刺激肿瘤浸润髓样细胞产生TNF，加速肿瘤细胞新陈代谢。TLR2和多功能蛋白聚糖有直接联系。因此，TLR2对多功能蛋白聚糖的识别和最终的炎性环境可以支持肿瘤细胞的生存。感染同样是TLRs识别的内源分子释放的触发因素（图4）。抗菌肽防御素2，可直接中和入侵的微生物，它是由应答感染的黏膜组织和皮肤产生的，通过TLR4活化未成熟的DCS诱导上调共刺激分子，导致有效的免疫反应的诱导。TLR4和TRIF缺陷的小鼠可避免由于供给灭火的禽流感病毒引起急性肺损伤。这种病毒触发氧化磷脂的产生，氧化磷脂的产生承担通过TLR4-TRIF轴的急性肺损伤。因此，通过TLR4通路响应氧化应激是控制急性肺损伤的关键。不合理的TLR介导的对自身核酸的识别正常情况下，自身的核酸分子并不活化先天免疫反应。自身核酸分子在被内噬溶酶体中的TLRs识别前就已经被血清核酸酶合适的降解。TLR7和TLR9在细胞内的位置对于避免与胞外自身核酸分子接触是非常重要的。另外，蛋白水解成熟TLR9的（及可能TLR7 ）用于防止泄漏到细胞表面的TLR9不合适的识别自身DNA是很重要的。可能这些保护在炎性和自身免疫状态下已经被破坏。例如，当自身核酸分子与内涵体蛋白形成复合物时，它们可能会变得抵抗核酸酶并增加与体内TLRs，反过来促进并维持自身免疫过程。而且，发现TLR7和TLR9从内质网到内噬溶酶体的转移是由LPS配体外的部分诱导的，这证明了炎性实际上可以增加核酸分子与TLR7和TLR9的接触的可能性。在系统性红斑狼疮中，抗体与核酸或核蛋白有高凝聚。来自病人的血浆可促进pDCs产生型干扰素，且其浓度与病情严重程度有关。自身核酸分子或核蛋白被抗体结合后通过DCsd的Fc RIIa受体被内在化，然后传递给包含TLR7和TLR9的小泡，导致型干扰素的产生（图4）。而且，这些免疫复合物结合到B细胞表面抗原受体并被内在化以活化这些TLRs，导致自体反应B细胞的活化。因此，DCs和B细胞的协同活化，对于自身免疫疾病的形成和维持是很重要的。HMGB1既可以结合抗原又可以结合自身DNA。这些HMGB1-DNA复合体结合到RAGE上，并被转移到早期内涵体让TLR9识别，导致pDCs和B细胞的活化（图4）。LL37是由嗜中性粒细胞和角质形成细胞产生的抗菌肽，牛皮癣的皮肤损伤部位高表达LL37。LL37与坏死细胞释放的自身DNA和RNA形成聚合物，被内吞并保留在pDCs的内涵体中，然后分别活化TLR9和TLR7。在小鼠中发现的TLR7的复制体对TLR7配体有超反应。这些小鼠产生针对包含RNA自身抗原的抗体的同时还形成肾炎。降植烷是一个在植物中发现的异戊二烯烷烃，被注入到腹膜腔里后可诱导小鼠产生狼疮样疾病。随后的自身抗体的产生需要干扰素信号。这种情况下型干扰素产生的来源是未成熟的