菠萝皮中黄酮类物质的提取3.doc

菠萝皮中黄酮类物质的提取负责人 石建雯 组员 王丽 潘燕华 李芳芳指导老师 王芳菠萝皮中黄酮类物质的提取石建雯 王丽 潘燕华 李芳芳浙江师范大学行知学院 生技052班指导老师：王芳摘要：采用浸提法，对菠萝皮黄酮类物质的提取进行研究，以固液比、提取温度、乙醇浓度、提取时间为主要考察因子，通过正交试验，确定影响最大的单因子因素是提取温度，其次是乙醇浓度，黄酮类物质的最佳提取条件是：固液比为1：40，提取溶剂为80%的乙醇，提取温度为80，提取时间为1.5h。在此条件下菠萝皮中提取的黄酮类物质得率为11.23mg/g。同时比较了索氏提取法，浸提法的得率是其的2.56倍。关键字：菠萝皮 黄酮类物质 提取Extraction of Flavonoids from Pineapple PeelShi Jianwen Wang Li Pan Yanhua Li Fangfang（College Of Xingzhi,Zhejiang Normal University,052）Director : Wang FangAbstract: This paper studies the extraction of pineapple peel flavonoids,leaching solid-solution ratio,extracting temperature,alcohol concentration and extracting time are taken as the main factors . Orthogonal experiment shows that the major factors affecting the content of total flavonoids were the extracting temperature and the alcohol concentration, the optimum extracting condition as:the solid-solution ratio of 1:40,the alcohol concentration of 80%,the extracting temperature of 80 and the extracting time of 1.5 hours. Under the optimum condition, the content of flavonoids is 11.23mg/g.Compered with Soxhlet,the content of flavonoids is 2.56times. Key words:Pineapple peel Flavonoids Extraction前言菠萝,凤梨科，多年生草木，性喜温暖，我国是菠萝十大主产国之一，主要分布在广东、海南、广西、福建、云南等热区省。”菠萝其色香味及营养价值佳，据报道菠萝皮渣含有的营养成分与果肉的基本成分相接近1。很长的时间内菠萝的加工产品主要是糖水菠萝罐头，在加工过程中有50%60%的菠萝皮未被利用2，这些资源的浪费也给环境带来了压力。基于此,对菠萝皮的研究也有初试成果,如菠萝皮发酵乳酸饮料的制作3；菠萝果酒、白兰地、果醋、果冻制造，产沼气、乙醇、柠檬酸，作为饲料4；测定菠萝皮中总糖、总酸、酶活性5；还有从菠萝皮中提取天然色素等6。但是，到目前为止，国内对菠萝皮中的黄酮类物质的研究还未有报道。黄酮类化合物(flavone)是广泛存在于自然界的一大类化合物。到目前为止已发现的黄酮类化合物己超过5000多种7 8 9。黄酮类物质对冠心病、心绞痛、高血脂、心血管疾病有很好的疗效10 11。菊科、唇形科、芸香科的黄酮类物质有抗病毒、抗肝毒、抗炎、抗过敏、抗血栓和末梢镇痛作用12 13 14 15 16；虎耳草科、马鞭草科的黄酮类物质除有抗菌作用外，还有醛糖还原酶抑制性和抗恶性疟原虫性17 18 19；豆科的黄酮类物质具有强的抗革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌20和抗氧活性21;番茄枝科的黄酮类物质具有细胞毒活性22和明显的抗菌、抗炎活性23 24。总的来说黄酮类化合物，具有防治高血压、血管硬化以及抗自由基、降低血清胆固醇等作用25 。本文对菠萝皮中黄酮类物质的提取进行了研究，这既有利于对菠萝皮的综合利用以减少资源浪费和减少环境压力，又拓宽了黄酮类物质的来源。1 材料和方法1.1 试验材料试剂原料 ：市售新鲜菠萝皮，60烘干，剪碎，贮于磨口瓶中备用 芦丁(AR)：上海鼎国生物技术有限公司 乙醇为分析纯试剂：杭州萧山化学试剂厂亚硝酸铝、三氯化铝、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯试剂：上海精析化工科技有限公司1.2 主要试验仪器紫外可见分光广度计：上海精密科学仪器有限公司JY1002电子天平：上海精密科学仪器有限公司DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司全波长酶标仪：ThermoHWS28型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司1.3 试验方法1.3.1 菠萝皮中黄酮类物质含量的测定方法 黄酮类物质的含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法2 标准溶液的制备精密称取105干燥恒重的芦丁0.500g，用95%乙醇配制成1mg/ml的标准品溶液，备用。 最大吸收波长的确定精密吸取标准芦丁溶液0.1、0.2、0.3ml，分别加水至3ml，加5%亚硝酸钠0.5ml，放置6min，加10%硝酸铝0.5ml，混匀放置6min，加5%NaOH2.5ml，混匀放置15min，蒸馏水定容至10ml，以不加标准芦丁溶液组作为空白，用752紫外分光光度计在400-600nm每隔2nm测其吸光值。 芦丁标准曲线的制作分别精密吸取标准芦丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0ml，分别加水至3ml，加5%亚硝酸钠0.5ml，放置6min，加10%硝酸铝0.5ml，混匀放置6min，加5%NaOH2.5ml，混匀放置15min，蒸馏水定容至10ml，作空白对照，用752紫外分光光度计在最大吸收波长处测吸光值。 样品中黄酮类物质的测定取3ml样品于10ml的容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.5ml，混匀，放置6min，加10%硝酸铝0.5ml，混匀，放置6min，加5%氢氧化钠2.5ml,混匀，放置15min,蒸馏水定容至10 ml。于490nm处测吸光值。同时取蒸馏水3ml，以相同的步骤作为对照组。将测得的吸光值代入回归方程的黄酮类物质的含量，通过下面公式计算样品中黄酮类物质的得率：样品中黄酮类物质得率（mg/g）=(CV)/W C:样品中黄酮类物质的浓度(mg/ml) V:提取液总体积(ml) W:称取的菠萝皮质量（g）1.3.2 菠萝皮中黄酮类物质的提取工艺研究 浸提法的研究.1 提取溶剂对黄酮类物质提取的影响取1g菠萝皮样品，以固液比1：50，分别加入20%、40%、60%、80%、95%乙醇于80浸提2h，过滤，定容，测吸光值，比较、分析结果。（重复操作三次。）.2 固液比对提取黄酮类物质提取的影响取1g菠萝皮样品，分别以固液比1：10、1：30、1：50、1：70加入 75%乙醇80浸提2h，过滤，定容，测吸光值，比较、分析结果。（重复操作三次。）.3 提取时间对黄酮类物质提取的影响取1菠萝皮样品，以固液比1：50、加入75%乙醇80下分别浸提0.5h、1h、2h、3h，过滤，定容，测吸光值，比较、分析结果。（重复操作三次。）.4 提取温度对黄酮类物质提取的影响取1g菠萝皮样品，以固液比1：50，加入75%乙醇分别于20、40、60、80下浸提2h，过滤，定容，测吸光值。(重复操作三次。).5 浸提法正交试验的研究在单因子基础上，运用L9(34)正交试验，考察固液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度对提取结果的影响，以菠萝皮中黄酮类物质的得率为考察指标，从而确定黄酮类物质的最佳提取方案。 索氏提取法的研究.1 提取时间对黄酮类物质的研究取1g菠萝皮样品，75%乙醇90索氏提取5h、6h、7h、8h，过滤，定容，测吸光值。2 结果与分析2.1 菠萝皮黄酮类物质含量的测定2.1.1 最大波长的确定黄酮类化合物在亚硝酸盐存在的碱性条件下与Al（NO3）3形成稳定的红色配合物26乙醇提取物中的总黄酮含量测定采用NaNO2Al（NO3）3比色法，以芦丁为标样，在最大吸光值处测定，计算提取物中的总黄酮含量。结果（图1）表明，在400-600nm间，芦丁标准溶液在波长490nm（图1箭头所示）处测得最大吸收值，且吸收范围较宽，所以选择吸收波长490nm作为测定波长来确定桑叶黄酮的含量，以判断黄酮提取的最佳条件。（图1. 不同浓度溶液的吸收光谱(n=2)）2.1.2 芦丁标准曲线的绘制配制一系列不同浓度的芦丁标准溶液于波长=490nm处，测定吸光度，依芦丁浓度吸光度标准工作曲线，得出回归方程： C=0.0904A+0.0001，相关系数R2=0.9997。其中C表示浓度，A表示吸光值。表明本方法线性关系良好，可作为桑叶黄酮含量的测定方法。表1. 标准工作曲线的测定结果芦丁溶液V (ml)芦丁C (mg/ml)吸光值A0000.10.010.1070.20.020.2180.30.030.3300.40.040.4480.50.050.5480.60.060.6660.70.070.7760.80.080.8760.90.090.9821.00.101.116根据上表中的芦丁浓度C与吸光值A之间对应关系，以芦丁标准曲线溶液的浓度C与吸光值A作图得（图.2 芦丁标准曲线）2.1.3 浸提法单因子实验结果 乙醇浓度结果比较目前国内外提取黄酮类物质的研究中，一般采用甲醇、乙醇、丙酮和水等有机溶剂。丙酮的提取效果比甲醇、乙醇好，但其具有毒成分且价格较贵，一般不采用29。甲醇也有一定毒性，所以本次试验用乙醇作为提取黄酮类物质的有机溶剂。由图3所示，乙醇浓度在20%-80%之间时，黄酮类物质的得率随浓度的增大不断增大。乙醇浓度在40%-60%之间时，黄酮类物质的得率增幅较大，从7.23mg/g增大到8.944mg/g。乙醇浓度在20%-40%之间，黄酮类物质得率的增加不是很显著。乙醇浓度20%和40%时的黄酮类物质得率分别为6.344mg/g和7.239mg/g。乙醇浓度为80%时黄酮类物质得率为9.98mg/g。当乙醇浓度达到95%时，黄酮类物质的得率有所下降，为7.91mg/g，因为随着乙醇浓度的增大很可能会同时浸出色素等其他物质，影响其结果30。所以通过综合考虑提取浓度为80%。 图3 固液比结果比较由图4表明，黄酮类物质的得率会受固液比的影响。在1：30处出现了一个转折点，在1：10-1：30之间，随着固液比的增大，测得的黄酮类物质的得率从1.281mg/g增加到11.090mg/g。而当固液比增大到1：50时，黄酮类物质的得率开始减小，为9.527mg/g。一般随着溶剂量的增大，黄酮类物质的溶出量会增大，但随溶剂量达到一定值后，一方面由于黄酮的溶出量有限，另一方面由于有杂质的溶出，会影响提取结果27。所以本试验最佳固液比为1：30。 图4 提取时间结果比较由图5所示，提取时间在0.5h和1h之间的黄酮类物质得率增幅比较显著，提取时间0.5时的得率为7.91mg/g,提取1h和2h的结果比较接近，黄酮类物质得率分别为10.092mg/g和10.4998mg/g，这可能是因为此时黄酮类物质的提取已达到基本平衡。当提取时间为3h时，得率有所下降，为8.7311mg/g,可能是因为提取时间的增长,破坏了黄酮类物质的化学结构,使其失活。也可能是因为随着提取时间的加长，溶出的杂质也会增多。所以通过综合考虑提取时间为1h比较经济。 图 提取温度结果比较由图6所示，温度在20-80之间，黄酮类物质的得率始终随温度的升高而增大。温度从60升到80时，得率增大的较显著，从5.367mg/g增加到8.224mg/g。在温度20-60之间,黄酮类物质的得率增幅较小，20时的得率为2.427mg/g，40时的得率为4.110mg/g。高温溶剂能加快分子运动，软化细胞壁，使有效成分溶出的速度加快，从而使黄酮类物质溶出度增大。但是，并不是温度越高越好，一方面温度过高可能造成黄酮化合物化学结构变化，使活性成分破坏，同时杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，还会造成溶剂损失28。另一方面乙醇沸点为75,温度过高,使乙醇过快挥发,造成溶剂损失。所以通过综合考虑后，提取黄酮类物质的定在60-80之间。 图 正交试验结果根据单因子考察结果，拟定正交试验方案如下（表2）： 表2 正交试验方案表分子水平乙醇浓度A(%)固液比B提取温度C（）提取时间D（h）1701:20600.52801:307013901:40801.5 表3 黄酮类物质提取L9(34)正交结果因素乙醇浓度固液比提取温度提取时间实验结果(得率mg/g)实验11112223336.0577.1736.3461.1161231231236.1836.5896.8030.6201232313125.7586.5647.2531.4951233122316.0216.6186.9360.9154.4446.2537.4747.2817.4616.7766.8256.0546.159实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9均值1均值2均值3极差 表4 正交试验方差分析表因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性乙醇浓度2.01221.1084.460*固液比0.59420.3274.460-提取温度3.36121.8514.460* *提取时间1.29520.7134.460误差7.268注：* *具有显著性差异*具有较显著差异-没有显著差异，可当作误差由表4正交试验方差分析表结果所示，四种因素对提取结果影响大小为：提取温度C乙醇浓度A提取时间D固液比B。 由表3正交试验结果所示，提取温度C和乙醇浓度A对提取结果的影响最显著，为1.851和1.108，提取时间D和固液比B对提取结果的影响并不显著，固液比可当作误差。从结果看，就单因子水平（固液比）1到3中的总黄酮的得率与单因素明显不同，表明不同因素水平组合实验时各因素水平间存在一定的交互作用，这正是单因素试验的缺点，本试验考虑单因素及正交试验确定的最佳提取组合：A2B3C3D3，即菠萝皮浸提法的最佳提取条件为80%乙醇为提取溶剂，在固液比1：40条件下于80提取1.5h。在上述最佳提取条件下测得的菠萝皮中黄酮类物质得率为11.23mg/g。2.1.4 不同时间的索氏提取结果比较由图7所示，提取时间对黄酮类物质提取率的影响很大。回流6h所得的得率最高，为4.393mg/g。回流时间超过6h后，提取率逐渐降低，这可能是因为回流时间过长，黄酮类物质的化学结构被破坏了，影响了其得率。 图72.2 索氏提取法与浸提法比较 由图8所示，浸提法所得的结果好于索氏提取法，浸提法的得率近是索氏提取法的2.56倍。这可能是由于索氏提取时温度过高（95左右），破坏了黄酮类物质的活性成分，同时可能还溶出了其他物质（如色素），影响了黄酮类物质的得率。而且索氏提取的时间比较长，其成本较浸提法高，所以从综合考虑，提取菠萝皮中的黄酮类物质采用浸提法较好。 图8 3小结3.1 小结本文研究了索氏提取法和浸提法提取菠萝皮中的黄酮类物质。结果表明浸提法要优于索氏提取法。用75%乙醇索氏提取6h的得率为4.393mg/g。浸提法正交实验得出菠萝皮中黄酮类物质提取的最佳条件是：固液比1：40，乙醇浓度为80%，提取温度为80，提取时间为1.5h。在此条件下菠萝皮中黄酮类物质的得率为11.23mg/g。参考文献1 李英.菠萝皮渣酿酒试验初试J,热带作物科技,1991(5):62642 黄发新,詹云辉.菠萝皮渣酿制白兰地的初步研究J,广西热作科技,1997(2):31353 朱玉强,王统一.菠萝皮发酵乳酸饮料的制作J,江苏食品与发酵,2002(4):33354 苑艳辉.菠萝皮的综合利用J,实用技术,2005(2):1441465 古和平,林文光,邹建云.云南热作科技J,1997,20(4):31336 司新超,黄和.菠萝皮色素的提取及稳定性研究J,广西热带农业2007,109(2):147 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