COS细胞冻存和复苏传代培养ppt课件.ppt

COS7细胞冻存和复苏传代培养 指导老师陆家海欧阳丽萍 研究目的 建立CoS 7细胞培养的方法观察COS 7细胞培养的特点了解COS 7细胞的用途 建立CoS 7细胞培养的方法 主要阐述CoS 7细胞培养的体系 观察COS 7细胞培养的特点 是贴壁细胞还是悬浮细胞 细胞培养过程中形态的变化 分裂生长的形式等 了解COS 7细胞的用途 COS 7细胞的来源 特性及生命医学用途 小结 COS7细胞 猴细胞的一种细胞系 为重组病毒的宿主细胞 是表达SV40大T抗原的非洲绿猴肾细胞株 能支持部分突变型SV40和含SV40ori的质粒载体的复制 可高水平表达外源基因 常作为瞬时表达宿主 故本实验建立COS7细胞的冻存和复苏传代方法 一 实验材料1细胞株cos7细胞株2试剂RPMI 1640培养基 小牛血清 NBS N 2 羟乙基 哌嗪 Ng 2 丙磺顺酸 Hepes Sigma公司产品 胰蛋白酶 碳酸氢钠以及链霉素和青霉素3实验准备 1培养液的配置1 1 RPMI 1640液 1640粉2袋 Hepes2 14g 碳酸氢钠4 0g加水至2000ml调至PH 7 15 过滤 1 2 1640完全培养液 10 小牛血清 双抗 含链霉素 青霉素 的1640培养液 4 保存 1 3 10 DMSO冻存液的配置 1份DMSO 3份小牛血清 6份完全培养基1 4 胰蛋白酶1 25g EDTA 乙二胺四乙酸二钠 0 10g 于烧杯中先用少许PBS调成糊状 再补充PBS至500ml 搅拌混匀4小时后用滤器过滤除菌 分装 低温保存 2Cos7细胞冻存方法2 1 取对数生长期的细胞 收集细胞前换液一次 2 2 Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液 1200转 分离心1分钟 去上清 弹指法分散沉淀细胞后 左手摇动离心管 右手逐滴加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液 2 3 分装 细胞悬液分装在2ml冷冻管中 密封后标记细胞名称和冷冻日期 2 4 梯度降温冻存 冷冻管置 20 停留1 2小时 再降至 70 过夜 投入液氮 3Cos7细胞复苏3 1 将加有小牛血清 双抗的1640完全培养液从冰箱取出 升至室温 3 2 从液氮中取出冻存管 迅速投入3738 水浴中 摇晃使其在1分钟左右融化 3 3 转至EP管 加1640完全培养液至1 5ml左右 吹打 1200转 min 离心3分钟 3 4 去上清 再加1640完全培养液至1 5ml左右漂洗 离心3分钟 去上清 加新鲜培养液吹打重悬浮细胞 转至培养瓶中加培养液至总体积约4ml 置温箱培养 4Cos7细胞传代4 1 弃掉培养瓶内原来的培养液 加入5 7滴 轻轻转动培养瓶 让胰蛋白酶浸匀整个瓶底 吸出胰蛋白酶 4 2 再加入8 10滴0 25 胰蛋白酶 将培养瓶置37 5 CO2孵箱2 3min 观察细胞胞体回缩变圆 细胞接近脱离瓶壁时终止消化 4 3 小心吸出并弃去胰酶 加入1 2ml1640完全培养液 用吸管吹打细胞 制成细胞悬液 1 4传代 各瓶加入培养液2ml 放入37 5 CO2培养箱继续培养 二结果 1复苏细胞 第1d 镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中 折光性强 胞体呈圆形 第2d 复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁 第3d 复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快 折光性好 5d后可按比例传代 2传代细胞 第1d 镜下观察传代细胞悬浮于培养液中 折光性强 胞体呈圆形 第2d 中 传代细胞镜下观察细胞已贴壁 折光性好 少数细胞出现伪足 第3d 传代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸出伪足 细胞轮廓清楚 折光性强 细胞数量明显增多 3传代细胞传至第6 8代仍保持增殖状态 细胞生长速度未见减慢 能长满瓶底 三讨论 1养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难 首先 细胞株在传代中其性质发生变化 其次 在传代中有微生物污染的危险 解决这些困难的办法就是将细胞冻存 细胞冻存在液氮中 贮存时间几乎是无限的 因为在 130 以下 所有的生化反应已停止 而液氮的温度在 150 160 之间 2培养细胞在瓶壁汇合后 需进行分离再培养 否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大 导致营养不良而引起细胞衰老 停止生长 甚至死亡 为了维持细胞的存活和生长 必须进行稀释再培养 即将培养瓶内的细胞分离 稀释 接种到新培养瓶内继续扩大培养 首次传代的细胞接种数量要多些 使细胞尽快适应新环境 以利于细胞的生存和增殖 通常原代细胞按1 2分种传代 细胞株按1 4分种传代 3实验需严格遵守无菌操作规则 以减少操作引起的污染 一切操作 都要在火焰周围进行 瓶口 吸管等要经过火焰消毒 但用于吸取细胞培养液 小牛血清 酶液的吸管使用后不能在火焰上消毒 因为残留在吸管中的培养液烧焦炭化 再使用时会把有害炭化物带入培养液中毒害细胞 4实验完毕 关闭超净台鼓风机和电源 未使用器材放入饭盒内 用过的玻璃器材投入清水中浸泡 用酒精棉球擦拭工作台面 可减少培养液被微生物污染 5细胞冻存复苏的基本原则是慢冻速融 可最大限度的保存细胞活力 细胞直接冻存时 细胞内外的水分会很快形成冰晶 引起一系列不良反应 因而在冻存时尽可能地减少细胞内水分及冰晶形成 是保护细胞减少损伤的关键 目前多采用甘油和二甲基亚砜 DMSO 作保护剂 它们对细胞无明显毒性 分子量小 溶解度大 易穿透细胞 可以使冰点下降 通过缓慢冷冻 使细胞内水分尽可能多的渗出细胞外 减少细胞内冰晶形成 而复苏细胞时 采用快速融化 可保证细胞外结晶在很短时间内融化 避免缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶 在本实验中 我们用二甲基亚砜作保护剂 经过两个低温梯度 过夜后移入液氮 融化复苏时在37 2分钟内完成 对细胞未造成明显损伤 复苏后细胞存活率可达90 细胞形态 生长速率与未冻存细胞相比 未见明显差异 6cos7细胞生长分为3期 延缓期 增殖期和停滞期 首次传代一般在Cos7细胞增殖早期 此时细胞刚刚度过延缓期 脆弱易损 首次传代对于Cos7细胞是否能长期存活尤为重要 而在Cos7细胞增殖后期 细胞贴壁紧密 消化时间不足 细胞不易从瓶壁脱落 不仅传代细胞数量少 影响实验的准确性 而且由于局部代谢物的积累 细胞即进入停滞期 若消化时间过长 待细胞完全从瓶壁脱落 则细胞膜已受损 死细胞增多 胰蛋白酶是常用的消化液 可使细胞脱离附着物表面和相互离散成单个细胞 但胰蛋白酶对细胞也有损伤可影响细胞活性 5 本文建议采用0 25 胰蛋白酶在37 消化2min的参数 这是因为在37 下胰蛋白酶活性最大 所需消化时间最短 可避免胰蛋白酶长时间作用于细胞造成细胞的损失 7本室探讨了37 CO2条件为培养Cos7细胞的适宜环境 因为刚复苏细胞增殖缓慢 自身调节pH的能力差的缘故 显示复苏细胞要在37 5 CO2条件下培养才能顺利传代并保持较好的生长状态 参考文献1GluzmanY SV40 transformedsimiancellssupportthereplicationofearlySV40mutants Cell 1981 23 175 182 2SambrookJ FristchEF ManiatisT MolecularCloning ALaboratoryManual 2nded ColdSpringHarborLaboratoryPress ColdSpringHarbor NY 19893中山大学中山医学院分子医学研究