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实验设计典型错误辨析 要点 围绕三要素 实验因素 受试对象 实验效应 和四个基本原则 对照 随机 重复 均衡 去查找问题 两个不良习惯 单因素设计取代多因素设计 和 仅依据专业知识去设计对照组和处理组 指导思想上的问题 只有专业设计 缺乏统计研究设计墙上芦苇 头重脚轻根底浅荒唐透顶 颠倒黑白临床科研流程倒置缺乏完善的实验设计方案 首先应当有科研假设 对科研假设深思熟虑之后 提出研究目标的思路 在此基础上 结合专业知识和统计学知识 制定出完善的统计研究设计方案 在方案的指导下 有的放矢 循序渐进地开展科研工作 回顾性研究策略 也就是说 临床研究工作已经结束 才撰写所谓的 临床科研论文 这种工作往往缺乏完善的统计研究设计 在 随机 对照 重复 均衡 四个原则上存在严重问题 以至于推理证据不充分 说理底气不足 其结论难以令人置信 静息细胞法研究影响西索米星生物合成因素 原作者需要摸索不同的条件以筛选较为理想的静息细胞培养基 静息细胞培养基的组成就采用尽可能简单的已知成分的原料 能维持菌种最低限度的生命活动和继续合成西索米星 SISO 的能力 例一 1 2配方发酵效价高但成分较复杂 菌体总核酸较大 菌丝生长不符合静息的要求 说明天然万分虽能提高效价 但菌体也增加 一般不采用 3配方发酵效价较5低 在促进SISO合成能力方面不理想 4 6由于缺乏Mg2 合成产物能力较差 说明Mg2 与合成产物的酶类的活性有关 并与细胞的通透性有关 Mg2 的存在有利于产物分泌 5为成分完全已知的较为理想的静息细胞培养基 之后工作 以5培养基为基础 选择不同种龄 26 42小时 均在34 培养20小时后测其生物效价 确定40小时种龄的菌丝为静息培养系统的种子 之后又以此为条件 摸索最佳pH 得出pH7 0 7 2时对SISO合成最有利 之后又固定其它条件 确定最佳培养时间为20小时 最后原作者又采取类似方法 来摸索影响SISO合成的条件 最佳条件的摸索都是先固定其他条件 然后比较某一因素的不同水平的取值 选择最大的所对应的水平为最适的水平 这样依次确定的最适条件为 甲硫氨酸浓度为0 1 磷酸盐浓度为0 03 开始合成SISO的时间是培养后30小时 辨析与释疑 原作者目的有两个 筛选出建立静息细胞培养系统的最优实验条件另一个是在此培养系统的基础上进一步找出合成SISO的最适条件 原文涉及因素较多 但只做了6批试验 充其量这只能算作预试验 典型单因素设计取代多因素设计 辨析与释疑 实验设计之前最好结合专业知识进行一定规模的预试验 确定实验所需要的因素及各因素不同水平的具体取值 通过完善的实验设计 可节省人力物力 通过较少的实验得到较为可靠的结果 本试验可选择正交或先用均匀设计或分试析因设计后再进行正交设计或析因设计 实验设计三要素方面存在的问题 不能正确区分因素与水平盲目选用受试对象盲目选用观测指标 不能正确区分因素与水平 许多人喜欢用 组别 这个词作为实验分组的总称 无论实验中涉及多少个组 他们总把这个 组别 理解为是 一个因素 很自然地将其下的各组理解为该因素的各个水平 因素 是指 同质的实验条件 而 水平 则是在 量 上有一些差异的该同质实验条件的具体表现 开胃理脾口服液对脾虚小鼠胃肠功能的影响 例二 取70只小白鼠随机分为7组 每组10只 第一组为空白组 给等容生理盐水 其余各组给100 大黄水煎液一周 造成脾虚模型 停食24小时后 第一 二组静脉点滴含10 炭末的冷开水 第三至五组给含10 的炭末开胃理脾口服液 第六组给含10 炭末的开胃理脾丸剂 第七组给含有10 炭末的儿康宁 给药30分钟后处死小鼠 打开腹腔 剪取小肠 分别测量小肠总长度和炭末有肠内推进的距离 推进距离除以小肠总长度计算炭末推进百分率 对各组数据进行成组t检验处理 各组对小鼠小肠运动的影响 与模型组比较 P 0 05 P 0 01 与空白组比较 P 0 05 P 0 01 与丸剂比较 P 0 05 辨析与释疑 症结就在于混淆 因素与水平 之间的关系 本例中有些组之间是 甲因素的某个水平 与 乙因素的某个水平 之间的关系 而有些组之间却是同一个因素内部各水平之间的关系 空白组 与 口服液低剂量组 之间的关系 实际上是 非模型 非用药 组与 模型 含10 的炭末及低剂量的开胃理脾口服液 组之间的关系 这两组之间进行比较 若其差别有统计学意义 其效应不能完全归功于 含10 的炭末及低剂量的开胃理脾口服液 因为在这两组之间 还包含有 脾虚与否 之差别 故对这两组之间进行比较 就违背了均衡原则 温度 与 剂量 问题 若温度是某一实验的一个重要因素 则在实验中所采用的一系列具体温度就叫做 温度 这个因素的水平 若在 温度 基础上加上某药剂量 则要注意是否完全组合 例三 盲目选用受试对象 根据研究目的和具体情况 应结合专业知识选择合适的受试对象 从统计学角度 更多场合下是应当结合具体问题制定出 纳入和剔除 受试对象的标准 以减少或消除重要非实验因素对实验结果的干扰和影响 若是药物的临床试验 还必须考虑到 伦理道德 尊重人权 和 提高受试者依从性 等问题 盲目选用观测指标 实验效应是通过具体的观测指标来体现的 即观测指标是用来反映实验因素作用强弱的重要 尺子 必须结合实验因素的性质和特点 仪器 试剂和技术水平等多方面综合考虑 找出 特异性强 灵敏度高 准确 可靠 的观测指标 以 客观指标 为主 以 半客观和主观指标 为辅 易出错在进行疾病与某些基因之间关系的研究时 对照原则实施中存在的问题 对照过剩假对照对照不全缺乏必要的对照组 例四 研究某药驱铅效果 结论有明显驱铅作用 30名铅中毒工人脱离现场后住院治疗的结果 与治疗前比 P 0 05 例五 辨析与释疑 典型的假对照原研究利用患者脱离现场 前 后对照 但患者脱离现场后即使不治疗变有尿铅排出 k种不同药物 可将全部患者随机分成k组 分别用k种不同药物治疗 数据处理时最好采用 具有一个重复测量的两因素设计定量资料方差分析 或以治疗前的数据为协变量的值 采用单因素k水平设计资料的协方差分析 有人研究某杀虫剂对粮食污染的严重程度 用某种动物作为受试对象 实验分组如下 用污染米作饲料 用污染带糠皮米作饲料 用未污染米作饲料 将全部受试对象完全随机地分入三个实验组中去 每组均有足够多受试对象 实验一段时间后 测定动物体内某些定量指标 以反映本地区粮食污染程度 例六 辨析与释疑 问题可能是 若结局是 与 之间的差别无统计学意义 而 与 之间的差别有统计学意义时 就判断不出是因污染引起的 还是食用了带糠皮米造成营养不良所引起 本实验涉及两个实验因素 他们各取两个水平 即因素A为 饲料污染与否 它的两个水平分别是 污染和未污染 因素B为 饲料类型 它的两个水平分别是 米和带糠皮米 他们共有4种水平组合 应设立一个组 即用未污染带糠皮米作饲料 进行数据分析时不应将其视为单因素4水平设计 而应是 两因素析因设计 若资料满足 正态性和方差齐性 则应采用析因设计资料的方差分析 某人为了研究活血化瘀配伍补肾中药978 1对小鼠放射性脑损伤的作用及分子机制 以20Gy电磁线照射小鼠全脑建立动物模型 将150只清洁开昆明鼠随机分为 中药 照射组 单纯照射组 对照组 采用跳台法测定小鼠第一次受电击的潜伏期 并在9个不同时间点上对各组鼠进行9次重复测量 得出的结论为 活血化瘀配伍补肾中药978 1具在防止学习记忆力放射性损伤的作用 例七 鼠全脑照射后平均受电击潜伏期的比较 辨析及释疑 实验因素 照射剂量 用中药与否 观测时间 第一 二因素有两个水平 0Gy 20Gy 不用中药 用中药 第三个因素有9个水平 该实验为 不平衡的具有一个重复测量的三因素设计 银屑病发病与血型的关系探讨 原作者对64例银屑病患者进行血型观察 其中O型30例 A型17例 B型17例 AB型0例 没有进行统计分析 仅凭数字大小 认为银屑病的发病与血型有明显的关系 同时也证实了遗传致病的决定意义 例八 辨析与释疑 根据常识 正常人群中和血型构成存在较大的差异 AB型所占比例就小 正确的做法应建立正常对照组 调查正常人群的血型分布情况 运用统计学方法将正常人的血型分布与银屑病人的血型分布进行比较 THP在恶性肿瘤联合化疗方案中的疗效 采用国内外常用方案加以改良 即以THP代替ADM或EPI治疗各种恶性肿瘤90例 其中初治43例 复治47例 按治疗结果细分为 CR7例 PR41例 ND32例 PD10例 总有效率为53 3 主要毒副作用为骨髓抑制 结论 与ADM或EPI比较 THP疗效高 副作用低 例九 辨析与释疑 未提及其他疗法的疗效和毒副作用 无比较基础 应设立必要的对照组 ADM或EPI治疗组 保证各组在重要的非实验因素 如病种 病程等 方面达到均衡 肝炎灵联合丹参注射液治疗慢性乙型肝炎60例 慢性乙型肝炎病人随机分为两组 治疗组60例 接受肝炎灵与丹参注射液联合治疗 对照组44例 接受肌苷 维生素C的治疗 两组在性别 年龄 病程 病情方面的差异均无统计学意义 比较两组肝功能指标恢复正常率 得出结论 两药联合应用治疗慢性乙型肝炎有良好的协同作用 例十 辨析与释疑 从文中可以看出 原作者的目的是想通过两药合用看是否能增加单药的疗效 但对照组却选择了不相干的肌苷和维生素C治疗 所设立的对照组与实验设计的目的不符 并没有单用肝炎灵作为对照 采用双盲法 可较好地消除偏移 随机原则实施中存在的问题 按进入研究的时间顺序分组最常见的是先来的n名患者入对照组 中间的入A药 最后的入B药 严重违背 均衡原则 用随意取代随机闭眼从笼子中抓获动物 随意不是随机 HDMTX静滴后CF解救方案的探讨 两种方案 HDMTX静滴12小时后 CF解救HDMTX静滴24小时后 CF解救17例患儿 13例第一疗程接受方案I 以后再进行2个疗程采用方案II 计26例次 另4例患儿只接受方案II1次 比较时将所有接受方案I的患儿 n 13 的药物浓度与所有接受方案II n 30 的患儿的药物浓度进行比较 例十一 辨析与释疑 重复测自13个患儿的26个实验数据被看成测自26个患儿的独立数据 影响因素多且混乱 宜采用交叉设计 一个实验因素是治疗方案 另外两个重要的非实验因素是受试对象和测定顺序 重复原则实施中存在的问题 三层含义样本含量n 1 重复的三层含义 重复取样 从同一个样品中多次取样 测量某定量指标的数值 重复测量 对接受某种处理的个体 随着时间的推移 对其进行多次观测 重复实验 这是实验设计中所讲的重复原则 即在相同的实验条件下 做两次或两次以上的独立实验 这里独立是指要用不同的个体或样品做实验 而不是在同一个体或样品上做多次实验 整个实验设计所包括的各组内重复实验次数之和 称为样本大小或样本含量 有人为了说明某两台仪器测定的结果之间的差别没有统计学意义 选择一个健康人作为受试对象 先用A B两台仪器分别对该人重复测4次 一个月后 再用A B两台仪器分别对该人重复测4次 测定的定量指标有3个 其中有一个指标是 二尖瓣前叶EC幅度 每一个指标共获得16个数据 然后对这些数据进行方差分析和t检验 得出两台仪器测定的结果之间的差别无统计学意义的结果 其专业结论是可用 自制的廉价仪器A 取代 进口的昂贵仪器B 例十二 辨析与释疑 重复取样 重复测量与独立重复实验混为一谈 重复取样其数据反映的是测定者技术熟练程度 重复测量则是考察受试者接受某种处理后 随着时间推移 受试者体内某些指标的动态变化趋势 真正样本n 1 即独立的受试对象的个数 这种以 个案 推广到 一般 的做法 严重违背了实验设计 重复原则 为了观察甲紫注入小型猪正常腮腺后组织病理变化情况 有人选择6月龄 体重20 25kg的中国实验用小型猪15只 雄性9只 雌性6只 每只动物任选一侧腮腺为实验侧 另一侧作为正常对照 以消除个体差异及增龄对实验结果的影响 按注入甲紫后1周 2周 1个月 3个月及6个月将15只动物随机分为5组 每组3只 每个组的3只动物分别随机注入0 6ml 1 0ml 4 0ml1 甲紫溶液 然后观察组织病理变化情况 试问 此项实验研究中违背了实验设计什么原则 例十三 辨析与释疑 实验因素有两个 甲紫作用时间有5个水平 甲紫剂量有3个水平 其组合15种情况 n 1 各小组究竟应该用几只动物合适 严格地说 需要根据预试验或文献资料提供的信息 结合研究者对试验精确度的要求 并根据拟采用的实验设计类型 按样本大小的相应公式计算为宜 一般情况下 各小组动物数不少于10只为宜 大型动物不少于5只 维甲类化合物Rol3 7410对HL 60细胞凋亡及分化诱导作用 原作者的设计如下 将HL 60细胞制成浓度为1 105 ml的细胞悬液 加入不同浓度 10 6 10 7 10 8 10 9mol L 药物Rol3 7410 于给药后不同时间点 0 1 2 3 4 5天 染色后行活细胞计数 并做空白对照 得到30个数据 未作统计分析 仅根据数据的大小得出结论 10 8 10 9mol LRol3 7410可明显抑制HL 60细胞增殖 例十四 维甲类化合物Rol3 7410对HL 60细胞凋亡及分化诱导作用 辨析与释疑 实验因素2个 浓度5个水平 时间6个水平 30个实验点 N 1由于测得的30个数据来自同一细胞群 且在两因素不同水平的组合条件下测得 具有一定的相关性 因而将此实验视为具有两个重复测量的两因素设计比较妥当 需要增大实验批次 每个实验点最少安排两批实验 采用与此设计对应的方差分析方法处理数据 不仅可以消除数据之间相关性的影响 还可以全面分析各因素及因素之间可能存在的交互作用的效应 可以降低实验误差 提高检验效能 得出的结论更稳定可靠 均衡原则实施中存在的问题 均衡原则的含义对照组与实验组基线不可比提高均衡原则的策略 均衡原则的含义 就是在实验设计时 要确保各组之间除了要考察的实验因素取不同水平以外 其他一切可能的干扰和影响因素对各组产生的效应处于相等的水平 例如 比较两药对某病的疗效 全部某病患者被完全随机地均分入两组中 这两组患者在病情 病程 年龄 性别和职业构成 生活习惯 各种可能危险因素的接触水平 吸烟史 饮酒史 各种有益因素的接触水平 适度锻炼 心理调适等 等方面都应尽可能一致 设计了如下的实验 经血乳酸为主要观察指标 用20名连队的战士按训练方案进行耐力训练 以机关同龄的20名战士为对照 对照组进行日常活动 观察经4周训练后 两组战士进行一定量的运动时血乳酸的变化 结论是 按此方案训练能够降低运动时血乳酸的蓄积 提高战士的耐力 耐力训练与提高战士体质的关系 例十五 辨析与释疑 对照组选择不合理 针对这一实验 应研究不同训练方案对提高战士体质之间的差别有无统计学意义 以探索最大限度的提高战士体质的最佳方案 另外 分组时 连队战士和机关战士都应随机抽取 然后将各自的总样本含量的一半随机侵入实验组和对照组 提高均衡原则的策略 研究设计者本身应具有较丰富的专业知识和统计学知识 对拟研究的课题的基本情况有较为全面地掌握 对相关的文献资料比较熟悉 对相关的实验技术 难点和可能出现的异常现象比较了解 并有一定的把握 实验设计方案初稿制定出来以后 研究者不仅自己要反复修改 还应请几位同行专家帮助修改 以弥补个别人在某些专业知识方面的不足 从专业角度使实验设计方案进一步完善 一般来说 经过同行专家审阅后的实验设计方案 从专业角度看是不会有太大问题的 但这并不能保证它在统计学方面是无可置疑的 因此 请一两位对统计学研究得较深入的统计学工作者严把实验设计方案的质量关是很有必要的 多因素实验研究中存在的问题 用单因素设计取代多因素设计的含义及其不良后果 用单因素设计取代多因素设计实例看似多因素设计实际仍为单因素设计实验因素各水平组合不完全 用单因素设计取代多因素设计的含义及其不良后果 最常见问题例如 A B C三个实验因素 常见错误是先固定BC 找出最优A 然后永远固定A 依次找出最优B 最优C 错误原因 将A B C之间简单地认为不存在交互作用 事实上所有实验相关因素都存在交互作用 有些只是专业知识的缺陷假象 某研究者在进行 伊利蒙菌发酵研究 的实验研究中 分别对培养基含水量 培养基起始PH值 温度和光线强度对产物的影响作了研究 其实验过程和结果大致如下 由此得出这4个因素各自的最佳水平 最适培养基含水量为55 65 最适培养基起始PH6 5 7 5 最适温度为28 最适光线强度为避光培养 例十六 辨析与释疑 本实验有4个实验因素 其中3个6水平 一个2水平 主观认为这4个因素无交互作用 最大问题 可用正交设计 但尚无相应的正交表 可考虑将前3个因素均取4个水平 第4个因素仍取2个水平 可选用混合水平正交表L16 43 26 有人在进行某项研究时 需要将3种酶两两组合进行试验 其中有一个方案为 HindIII PSTI两种酶组合 盐浓度 中 反应温度 37 其他