9 吴旭杰 大肠杆菌生长曲线测定.doc

大肠杆菌生长曲线测定1、 实验简介 大多数细菌的繁殖速度很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下培养所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。 本实验用分光光度计进行光电比浊测定。当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过率降低，在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成（OD值）正比。因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘制出该菌在一定条件的生长曲线。2、 实验试剂与材料1、菌种：大肠杆菌2、培养基：LB培养基（蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、PH 7.07.2）70ml， 分装2支大试管（5ml/支），剩余60ml装入250ml三角烧瓶中进行 灭菌。3、 仪器及器具：分光光度计、比色杯、水浴恒温摇床、接种环、无菌吸管、三 角瓶、无菌水、无菌操作台、酒精灯。三、实验过程和步骤1、种子液制备：在无菌操作台上用灭菌的接种环以无菌操作挑取大肠杆菌菌种放入灭过菌的无菌三角烧瓶中，并用无菌水稀释50倍。放在无菌条件下静置一段时间作种子悬液。注：挑取菌落时必须对大肠杆菌菌落的形态特点进行深入了解以便挑取同一菌落菌种，从而避免对后面的比浊产生影响。2、 大肠杆菌形态学观察：取菌悬液将其涂布在1cm2的载玻片的面积上自然烘干，然后进行革兰氏染色（涂片晾干固定结晶紫染色水洗媒染水洗脱色复染水洗晒干镜检），对其进行形态学观察。3、接种培养：用无菌吸管取1ml菌悬液加入到经灭菌24h静置后无杂菌感染的LB培养基的锥形瓶中，混匀，此时记为0h，在37摄氏度水浴恒温摇床上培养。 注：所用LB培养基必须经灭菌后在培养箱中培养24h，观察培养基是否染菌。接种时必须在无菌操作台上进行4、生长量测定：将未接种的LB培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照。并对不同时间培养液从0h起依次测定1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、5.5h、6.5h、7.5h、8.5h的OD值。注：对浓度大的菌悬液测定时须将其用无菌水稀释一定倍数后测定，使其OD值在0.10.3以内，经稀释后测定得到的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。实验时必须严格控制培养时间。本操作步骤也可用简便的方法代替：1用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有35ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37继续振荡培养。2分别在培养0、1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、7.5、8.5时，取出培养物按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。四、实验分析与检测1、 形态学特点：大肠杆菌 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛能运动，无芽孢。 在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。2、测定的OD值 培养 时间/h01.52.53.54.56.57.58.5OD值0.2700.6330.6851.0301.2201.2151.2151.1553、绘制大肠杆菌生长曲线 将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。 衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。5、 实验存在的问题及建议1、 实验数据过少，延迟期和衰亡期曲线不明显。 建议：须将实验间隔压缩。在实验初期20min对菌悬液进行一次测定。实验中期每小时测一次，后期12小时测定一次，依次持续到20小时后。2、 光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓