动物冻存及复苏.doc

中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 细胞工程实验 题目： 细胞冻存及复苏培养 一 .实验目的1、掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存的试验方法。2、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的试验方法。二 .实验原理1、细胞冻存的原理（1）当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规通用技术。这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会；而且防止了再多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。液氮温度可达-196，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。为培养工作提供了极大的方便。（2）在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变、pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生。甘油和二甲基砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有保护作用。保护剂的使用浓度一般在5%15%。2、细胞复苏原理为保持细胞最大存活率，复苏细胞与冻存细胞要求相反，应采用快速融化的手段，这样可以保证细胞外的结晶在很短的时间内即融化，使细胞迅速通过最易受损的-50温度段，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成包内再结晶对细胞造成的损害。三 .主要仪器试剂1、冻存所需仪器试剂冰箱及低温冰箱 超净工作台 吸管 细胞冻存管 液氮罐0.25%胰蛋白酶液 MEM培养液 PR液 二甲亚砜（DMSO）冻存液II：MEM:小牛血清：二甲亚砜（DMSO）=4:5:12、 细胞复苏实验所需试剂超净工作台 恒温水浴离心管 细胞培养瓶 吸管MEM+10%小牛血清培养液四.实验操作步骤1、冻存（1）取对数生长期的细胞，在冻存前24小时换培养液一次。（2）按传代培养步骤15制成细胞悬液。1 在细胞悬液中加入2ml冻存液II，吹吸数次使细胞均匀悬浮2 取0.50.8ml分装入细胞冻存管内，密封，在管上做好标记，用布袋包装3 放入45冷藏箱中3045分钟，使冷冻保护剂充分渗入细胞内，与细胞达到平衡4 放入-75，一天5 快速放入液氮罐的试管托内，沉入液氮中【注意事项】操作时应带好眼镜和手套，以免液氮溅出伤人。仔细检查细胞冻存管是否密封，以免复苏时因受热发生爆炸伤人。2、 复苏1 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入3637恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在4060秒内尽快解冻。操作者应带手套。2 将解冻后的细胞悬液倒入培养瓶中，快速加入3ml25的MEM血清培养液，吹吸混匀后静置3 30分钟后经常在显微镜下检查细胞贴壁情况4 待细胞大部分贴壁后，轻轻从培养瓶侧面吸出培养液（内含冻存保护剂）5 从培养瓶侧面加入3mlMEM血清培养液，置20培养箱中培养。次日更换一次培养液，继续培养，一周后观察。【注意事项】细胞冻存悬液一旦溶解后，应尽快弃除冻存保护液，因二甲亚砜在常温下对细胞会产生毒性。一般细胞冻存密度为106107 个/ml，在复苏培养时可做10倍或20倍的稀释，调节接种密度在5105个/ml。实验操作人员在复苏细胞过程中，要有自我保护意识，避免被液氮冻伤。5. 思考题1、1.8 ml的冻存管中为什么只分装了0.5-0.8 ml的细胞悬液? 冻存后，液体变固体，体积变大，易充满冻存管。同时，少量细胞悬液可加速融化，减少二甲亚砜常温下对细胞的毒性伤害。2、为什么要选择对数生长期的细胞进行冻存？ 由于对数生长期细胞数量多，生长速度快，健康状态良好。3、冻存的细胞为什么要在4停留至少30 分钟？ 为了使冷冻保护剂充分渗入细胞内，与细胞达到平衡，减少冰晶损伤、溶质损伤。4、如何提高冻存细胞的复苏速度？ 1.8