《重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基....doc

重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响通讯作者：王辉工作单位：上海交通大学医学院附属新华医院核医学科；上海控江路1665号 200092O)；背后的故事甲状腺癌是内分泌系统最常见的肿瘤，其发病率的正在逐年上升，其最常见的是分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma,DTCs，约占94%），通过甲状腺全切术+放射性131I治疗+T4抑制治疗，较其它肿瘤，往往预后较好。然而在临床上，有30%的甲状腺癌病人在131I治疗过程中肿瘤灶或转移灶会逐渐失去摄碘能力，即出现失分化，使得RAI治疗无效，亦无其他有效治疗方法，这类病人的预后也较差，生存率极低。因此，深入研究失分化甲状腺癌再分化的治疗措施成为131I治疗面临的首要问题，且对提高患者生存率和生存质量具有重要意义。本单位前期体外研究在培养的FTC-133细胞中证实了131I的辐射促使细胞失分化，并且检测失分化后的FTC-133细胞，其摄碘相关基因（NIS、TSHR、TG、TPO）均下降，且TSHR下降最为显著。同时，我们也成功构建了失分化型滤泡状甲状腺癌细胞株。这提示我们131I的辐射使细胞失分化现象可能与TSH/TSHR的表达变化有关。以往的研究已证实：甲状腺的增殖和分化是主要是由TSH与TSHR结合后激活cAMP经典途径引起的后续生物学效应，最终影响甲状腺摄碘相关基因（例如：NIS、TSHR、TG、TPO）的表达，提高细胞对碘的摄取。近来已有研究表明在失分化型甲状腺癌中TSHR的表达是下降或丧失的，一些学者等将TSHR基因体外稳转染甲状腺癌细胞，可以抑制细胞的粘附、增殖和侵袭及在甲状腺癌小鼠模型体内实验中，TSHR的失表达可以促进肿瘤的发展和转移，进一步证实了TSHR与肿瘤的恶性、分化关系。上个世纪80年代TSHR基因克隆12-15的成功，给失分化型甲状腺癌再分化的基因治疗奠定了理论基础。因此，综上所述，我们提出分化型甲状腺癌在131I治疗后出现失分化现象，摄碘功能障碍的机制可能与131I辐射作用使TSHR表达改变有关，TSHR表达的下降和功能缺失会引起下游NIS、TPO和Tg蛋白下降。因此，我们试图将hTSHR基因转染失分化型甲状腺癌细胞株，观察hTSHR对摄碘相关基因的表达及细胞摄碘能力的影响，寻找使失分化甲状腺癌再分化的一种的方法。通过本次研究，我们发现转染hTSHR基因可以上调摄碘相关基因的表达及摄碘功能。但在本研究中，脂质体转染FTC-133细胞条件的优化和125I在转染细胞内滞留时间短是最棘手的问题，研究发现，要取得最佳转染效率，脂质体Lipofectamine 2000用量、转染后换液时间、质粒DNA用量都需优化否侧会产生明显的细胞毒性；但也要考虑到实验需要的细胞密度、转染前细胞状态、及检测时限来具体选择，否则得不到可重复性的高转染效率。关于125I在转染细胞内滞留时间短，20min已经排出一半，这可能与TPO和TG基因表达水平不足，以及转染事件可能影响一系列碘排出系统如：pendrin蛋白介导的排泄系统有关，我们将进一步优化转染条件，比如改良转染试剂以及细胞培养条件。本研究同时也引起了我们对放射性碘致死肿瘤细胞的时间和剂量问题的兴趣，在本研究中125I在转染细胞内滞留时间短，但目前关于131I致死肿瘤细胞的时间的长短和剂大小尚无定论，有待于进一步的研究，增进学科发展。文章摘要重组质粒hTSHR转染低分化甲状腺癌细胞株后对摄碘能力及特异性基因表达的影响【摘要】 目的 探讨重组真核表达质粒pcDNA3.1/人TSH受体(hTSHR) 体外转染TSHR表达下降的低分化滤泡状甲状腺癌细胞株后,细胞摄取放射性碘功能以及甲状腺癌相关基因mRNA表达的变化。方法 pcDNA3.1/hTSHR转化DH5感受态菌,进行扩增,酶切,再以核苷酸测序方法鉴定。体外转染pcDNA3.1/hTSHR,通过免疫荧光检测THSR表达产物,井型计数仪检测摄碘率,相对定量实时荧光PCR验证其表达的TSHR蛋白功能和特性。采用SPSS 13.0软件,计量资料采用t检验。 结果 pcDNA3.1/hTSHR经PCR扩增hTSHR-cDNA片段约113 kb,Kpn和Xba双酶切:hTSHR-cDNA的片段约2.3 kb, pcDNA3.1(+)的片段约5.5 kb,均同预期片段大小相符;核苷酸测序方法鉴定测序结果与GenBank中收录的hTSHR全长序列一致,表明真核表达质粒构建正确。在hTSH刺激下,转染pcDNA3.1/hTSHR细胞与转染pcDNA3.1(+)细胞比较:(1)在甲状腺肿瘤细胞胞质、胞膜有增强的绿色荧光,(2)125I摄取率是后者的2.9倍(t=28.63,P0.01),(3)甲状腺碘摄取相关基因TSHR、钠碘转运体(NIS)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)的mRNA的表达分别升高1.74倍(t=5.959,P0.01)、7.2倍(t=3.807,P0.05)、2.88倍(t=4.769,P0.01)和2.67倍(t= 6.388,P0.01)。结论 pcDNA3.1/hTSHR体外转染甲状腺癌肿瘤细胞后,可有效提高碘的摄取;这可为放射性碘治疗失分化甲状腺癌提供新的实验依据。关键词 甲状腺肿瘤；肿瘤细胞；培养的；质粒；受体；促甲状腺激素； 转染；碘放射性同位素The effects of TSH receptor gene transfection on iodide uptake and the thyroid-specific gene expression in poorly differentiated thyroid carcinoma cell line Abstract Objective To investigate the changes of iodide uptake capability and the expression of t thyroid-specific genes in poorly differentiated follicular thyroid carcinoma (FTC) cells after transfection of human TSH receptor(hTSHR) gene in vitro. Methods The recombinant expression plasmid pcDNA3.1/hTSHR-cDNA was transformed into DH5 bacterial for amplification and then the recombinan plasmid was extracted. The recombinan was identified with PCR amplifying, restriction enzyme digestion analysis and DNA sequencing. The recombinant plasmid pcDNA3.1/hTSHR was transfected into FTC-133 cell line by Lipofectin method in vitro. Immunofluorescence, iodide uptake studies and realtime-PCR were aplied to detect target protein expression. Statistical analyses was performed by t-test analysis using SPSS 13.0 software,Results Kpn and Xba restriction enzyme digestion,PCR amplifying and DNA sequencing confirmed that pcDNA3.1/hTSHR had constructed successfully. After transfection of a recombinant plasmid pcDNA3.1/hTSHRcDNA, immunofluorescence analysis confirmed the expression of the hTSHR protein in the tumor cells,and it was localized at the cell surface and cytoplasm. The capability of iodine uptake was 2.9 times higher(t=28.63,P0.01) than that of control group;The levels of TSHR, NIS, TPO and Tg mRNA also significantly elevated by 1.74 times(t=5.959,P0.01),7.2 times(t=3.807,P0.05),2.88 times(t=4.769,P0.01),2.67 times (t= 6.388,P0.01)respectively comparison with control group. Conclusion The study demonstrates that iodide uptake ma