分子诊断重点.doc

1、 基因 DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。2、 基因组：广义：一物种的全部遗传物质及其携带的遗传信息。狭义：单倍体细胞中的全套染色体（人：22条常染色体 + X，Y + 线粒体DNA）3、 断裂基因：基因的编码序列在DNA上不是连续的，而是被不编码的序列隔开。4、 重叠基因：基因组DNA中某些序列被两个或两个以上的基因所共用。基因重叠现象在病毒基因组中普遍存在。5、 跳跃基因：即转座子，在哺乳动物体内一般含有几十万个跳跃基因DNA；6、 基因家族指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因7、 假基因（pseudogene): 在多基因家族中有的成员并不能表达出有功能的产物，用表示。8、 SNP：单核苷酸多态性指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态9、 质粒：细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子10、 转座因子又称转座元件（transposable element），是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列11、 微卫星：广泛分布在原核和真核生物基因组中，常出现在基因的非编码区和染色体末端，重复序列长度仅为16bp，呈串联重复排列。12、 黏性末端:对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为粘性末端13、 原核生物基因组的特点1.原核生物基因组：DNA原核生物基因组DNA较小,基因数目较少原核生物基因组中只有一个DNA复制起点;2原核生物的操纵子结构;操纵子结构是原核生物基因组的功能单位, 原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上;3.原核生物的结构基因多数是单拷贝基因，只有编码rRNA和tRNA的基因有多个拷贝;4原核生物结构基因的编码顺序一般不重叠;5.具有编码同工酶的不同基因6.GC含量差异大7.非编码区内主要是一些调控序列;8.具有可移动的DNA序列第三章 分子克隆1、分子克隆：按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，此过程称为分子克隆，也称基因克隆或DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 2、质粒：是细菌染色体以外具有自主复制能力的小型双链环状DNA分子，能自我复制并表达其所携带的遗传信息3、限制性核酸内切酶：RE是一类能识别和切割双链DNA 特定核苷酸序列的核酸内切水解酶4、分子克隆的基本步骤：1、目的基因的制备；2、载体的选择和制备；3、目的基因与载体连接；4、重组DNA导入受体细胞；5、目的基因的筛选与坚定插入失活的原理：一般情况下选用含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。蓝白斑实验：许多载体都带有一个编码-半乳糖苷酶基因的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。当这种载体转入的宿主细胞是含有-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补，产生具有酶活性的蛋白质，从而使宿主细菌在IPTG/X-gal的培养基上呈蓝色，当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。载体的概念及应具备的特征.载体：是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为DNA。特征：在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利与体外重组操作具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体配备与宿主相适应的调控元件。第四章 核酸分子杂交技术1、核酸分子杂交的基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。2、核酸探针的概念：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子3、核酸探针的种类：基因组DNA探针；cDNA探针；RNA探针；寡核苷酸探针4、变性：DNA变性是指在物理或化学因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双链DNA分子变成两条单链DNA的过程。5、复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链通过碱基互补配对原则重新缔合，形成双链的过程（又称杂交）6、随机引物标记法的原理：随机引物是人工合成的由6个核苷酸残基构成的寡核苷酸片段的混合物。对于任一变性后的单链DNA分子，随机引物中总会有一些片段与之互补结合，充当DNA合成的引物，在Klenow酶的作用下，以互补的单链为模板，以dNTP为原料，从而合成与探针模板DNA单链互补的具有放射活性的单链。7、DNA缺口平移法进行探针标记的原理：首先利用适量DNase在Mg2+的存在下，将DNA双链随机切割产生多个单链切口，切口处产生的3-OH末端可作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的53聚合酶活性催化下，以互补的单链为模板，以dNTP为原料，在切口3-OH末端逐个加入新的dNTP；同时大肠杆菌DNA聚合酶发挥其53核酸外切酶活性，将切口5端的核苷酸逐个切除，从而合成与两条模板DNA单链互补的具有放射活性的单链，并且原来特定的核苷酸残基被标记的同种核苷酸残基所取代。8、Southern印迹的原理+基本过程：是指将电泳分离、原位变性的单链DNA片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测DNA的方法。基本过程用适当的限制性内切酶消化待测的DNA 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段将电泳后的DNA变性，并转印到固相支持物上预杂交杂交洗膜杂交结果的检测9、原位杂交的原理：标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法第五章 核酸扩增技术1、 PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。2PCR技术加入4种物质及PCR体系的主要成分）物质作为模板的DNA序列；与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互补的DNA引物TaqDNA聚合酶dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。主要成分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶、缓冲液（含Mg离子）3DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）: 94C95C退火（annealing） : 40C70C 延伸（extension） : 72C4、引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。7、实时定量PCR技术的原理：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析8、荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 9、Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数10、Ct值与模板起始量的关系：1）模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小；2）Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小 。11、荧光染料法的原理：在PCR反应体系中，加入过量的荧光染料，荧光染料掺入DNA双链后发射荧光信号；当DNA变性时荧光染料又释放出来，反应体系的荧光强度急剧减少；在引物退火后的聚合延伸过程中，随着PCR产物的形成，荧光染料与双链产物结合，反应体系的荧光强度又急剧增加，荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。12、荧光探针法的原理：利用Taq酶的5外切酶活性，当引物延伸至被荧光探针结合的模板处，Taq酶即从5-3方向降解并释放荧光探针5端的核苷酸。由于探针的两端均有一个荧光分子标记，其中3端的荧光分子能够吸收5端荧光分子的荧光信号，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号正好被淬灭基团吸收，因此就检测不到荧光信号；当Taq酶将探针5端带有报告荧光基团的核苷酸降解下来时，破坏了两荧光分子间的荧光共振能量转移，从而发出荧光，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光分子数与PCR数量成比例，从而实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。13、分子信标：分子信标是一段荧光素标记的单链寡核苷酸探针，由两部分组成，一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，另一部分是分别在5末端和3末端标记荧光报告集团和荧光淬灭基团第七章 蛋白质组学研究技术1.蛋白质组：由一个基因组或一个细胞、一种基因表达的所有蛋白质2.双向凝胶电泳技术第一向电泳IPG等电聚焦电泳在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的ph梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向负极运动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所处净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带。第二向电泳SDS-PAGE蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的复合物，所带负电荷大大超过原有电荷，消除了不同分子间原有电荷的差异，所有的复合物均呈长椭圆棒状。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于蛋白质的分子量大小。3.质谱的原理在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后通过测定这些粒子的质荷比和强度来进行定性和定量4.酵母双杂交技术概念：利用酵母细胞内的真和表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。5.噬菌体展示技术利用大肠杆菌丝状噬菌体作为载体，将外源蛋白或多肽的基因克隆到噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白表达融合，展示在噬菌体颗粒的表面。第8章 生物芯片技术1、生物芯片：它是指通过微加工和微电子技术，在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列，以实现对组织、细胞、核酸、蛋白质及其他生物分子进行高效、准确、高通量的检测。2、生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片以及缩微芯片实验室等。3、生物芯片发展的最终目标：是把生物和化学领域所涉及的样品制备、生物化学反应和检测分析的整个过程集成化，并微缩到一张芯片上自动完成，形成缩微芯片实验室。4、根据生物芯片的结构和机制分为微阵列芯片和微流体芯片两大类。5、基因芯片的原理：其原理是经过标记的待测样本DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后，经激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过检测杂交信号强度来获取样品分子的数量和序列信息，用计算机软件进行数据比较和分析，从而对基因序列及功能进行大规模高通量的研究。6、将探针固定在载体表面的方法包括两种类型：一是合成点样法；二是原位合成法，此法目前应用的主要有原位光刻合成法、喷印合成法和分子印章原位合成法。7、蛋白质芯片技术在生物分子间相互作用的研究（简答题）： 1抗原抗体相互作用 2蛋白质蛋白质相互作用 3小分子蛋白质相互作用 4蛋白质核酸相互作用 5酶底物相互作用8、 缩微芯片实验室：生物芯片发展的最终目标是把生物和化学领域所涉及的样品制备、生物化学反应和检测分析的整个过程集成化，并微缩到一张芯片上自动完成，形成所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。第九章 用于分子诊断的其他技术第一节 毛细管电泳技术（一） 高效毛细管电泳的概念高效毛细管电泳（HPCE）:HPCE泛指以高压高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。（二） 高效毛细管电泳的原理1、 在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下以不同的速度定向迁移的现象叫电泳。2、 在高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。HPCE所用的石英毛细管柱，在pH3的情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。各种粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。阳离子运动方向和电渗方向一致，故运动速度最快，最先流出；中性粒子的电泳速度为零，故其迁移的速度相当于电渗流的速度；阴离子运动方向和电渗流方向相反，但由于电渗流速度一般大于电泳速度，故是在中性粒子之后流出。最终导致带正电荷、中性电荷、负电荷的组分一次通过检测器而实现分离。（三） HPCE的检测器有紫外、荧光、电化学、电导等。第三节 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）（一） 原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开。（二） GC夹板在DNA片段的一端加入一段长度为3050个碱基且富含GC夹子的DNA片段形成一个人工高温解链区，称为“GC夹板技术”。含有GC夹子的DNA在GC夹子处解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能北区分开。 第十章 感染性疾病的分子诊断1、感染性疾病：是指感染了某种病原体所引起的一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体和螺旋体等。2、乙型肝炎病毒基因组结构：不完全双链环状结构长链（L）与病毒mRNA互补，定为负链；短链（S）为正链HBV基因组L链上至少有4个ORF，分别为S、C、P和X，编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。3、HBV DNA检测 PCR：引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。4、HBV耐药性检测主要是针对HBV DNA聚合酶P基因的检测，鉴别野生型（YMDD）及耐药突变型（YVDD、YIDD）。临床意义：HBV感染的早期诊断监测治疗效果判断病情，指导制定合理的治疗方案其他方面，根据耐药性和基因分型检测结果指导临床用药，监测病情和进行分子流行病学调查。5、人乳头瘤病毒是一组无包膜的小DNA病毒。HPV基因组的一个共同特点是所有的ORF均位于同一条DNA链上，只有一条DNA链可作为转录模板。 含ORF的编码DNA连大致可分为3个区域，即早期蛋白编码区（ER）、晚期蛋白编码区（LR）和上游调控区（URR）。第十一章 单基因遗传性疾病的分子诊断单基因病是指一种遗传病的发生只收一对等位基因的控制，他们的遗传方式遵循孟德尔分离定律。他们通常呈现特征性家系遗传格局，散发病例罕见。分类：制疾病的遗传方式不同，可以将人类单基因病分为三种：常染色体遗传包括常染色体显性遗传和隐性遗传X连锁遗传包括X连锁显性遗传和隐性遗传线粒体遗传第一节 血红蛋白病血红蛋白病分类：1、由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病2、由于珠蛋白多肽链的组成比例改变和珠蛋白含量降低所导致的地中海贫血血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，其中珠蛋白多肽链有7种：、G、A、。成年人血红蛋白中血红蛋白A由两条珠蛋白肽链和两条珠蛋白肽链组成。链状细胞贫血的分子机制：镰状细胞贫血是第一个在分子水平得以解释的人类疾病，该病由于珠蛋白基因中第6位密码子的序列由原来的GAG改变成GTG，结果珠蛋白肽链的第6位氨基酸残基由原来的谷氨酸改变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称为镰状血红蛋白（HbS）。HbS能聚集成高分子丝状物，这种异常血红蛋白结晶使红细胞膜发生镰变。镰变红细胞的弹性几乎丧失，变形能力降低，通过直径比红细胞小的毛细管时容易引起溶血。镰变红细胞是血液的黏度增加，阻塞微循环，引起组织缺血坏死，心、肺、肾脏等器官严重损伤。镰状细胞贫血的分子诊断方法:针对珠蛋白基因的第5、6、7位密码子进行PCR扩增，扩增产物用Mst限制性内切酶进行酶切，通过对酶切片段电泳分析或southern杂交，可以做出正确判断。珠蛋白基因的第5、6密码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。地中海贫血的分子诊断： 地中海贫血是由于组成血红蛋白的某种肽链的合成速率降低，而另一种珠蛋白链的合成相对过剩，导致该类红细胞中的血红蛋白四聚体组成和结构发生改变，进而引起的溶血性贫血。以地中海、东南亚和中亚地区多见，我国的南方地区是地中海贫血的高发区。地中海贫血分类：地贫、地贫、地贫、地贫、地贫、地贫，其中临床上最常见的是地贫和地贫。各种表型的地贫基因型表型基因型合成含量正常人100%静止性地贫，基本无症状75%标准型地贫50%Hb H病25%Hb barts0%基因突变导致的地贫：1、点突变2、移码突变3、无义突变4、mRNA加尾信号突变5、终止密码子突变地中海贫血是由于珠蛋白基因突变或缺失所导致的一类遗传性溶血性疾病。地贫表现为红细胞珠蛋白内的亚基缺乏，我国地贫检出率为0.665%，广东省的发病率居全国首位。PCR检测和点突变基因检测技术为地贫基因诊断的主要手段。十二章 复杂基因疾病的分子诊断 血淋巴瘤中染色体异常的发病机制主要有两种情况：1、易位是一种癌基因与另一种基因融合，形成一种新的杂合基因（嵌合性基因）。染色体之间的重组发生在受累基因的内含子中，致使形成新的融合性转录物，并产生具有新的生物学特性的蛋白质产物。2、由易位引起前癌基因激活，并将一个不表达或低水平表达的基因易位到编码抗原受体的基因位点，以致其转录失去调控，使该正常静止的基因被激活，发生转录，并导致其转化。白血病和淋巴瘤的分子诊断方法:荧光原位杂交技术、PCR 、实时定量PCR乳腺癌的易感基因：1、 雌激素受体ER 2、孕激素受体PR 3、人表皮生长因子受体-2 c-erB-2/neu结直肠癌的易感基因1、 p53基因（抑癌基因） 2、DCC基因（抑癌基因） 3、Ras基因（癌基因） 4、APC基因（抑癌基因）第十三章 分子诊断的其他应用第一节 分子诊断在移植配型中的应用器官移植：是指将活的健康的细胞、器官、或组织从供着一直到受者体内，代偿已丧失的器官功能。器官移植分为四种类型：1、自体移植2、同质移植3、同种异体移植4、异种移植。HLA配型:人类夫人主要组织相容性抗原称为人类白细胞抗原HLA。HLA主要有血清学分型和DNA分型。其中DNA分型可分为：1.DNA测序分型2.PCR-RFLP分型3.PCR-SSP 4.PCR-SSO