微生物实验考试重点.doc

实验一、培养基制备与消毒灭菌一、培养基：满足微生物生长的营养需要，人工配制的混合营养基质。用途：用于微生物的分离、培养、增殖、保藏及鉴定。牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生细菌的培养）马铃薯糖培养基（常用于培养真菌）高氏一号培养基（用于培养放线菌）二、培养基配制原则1）根据营养不同配制不同培养基；2）注意各种营养物质的浓度及配比；3）调节适宜的pH值；4）考虑加生长因子；5）培养基应物美价廉；6）灭菌处理三、培养基分类1、根据化学组成分类(1)天然培养基 完全用天然物质或其浸出汁配制。成分不确定。如肉汁、豆芽汁、牛乳、土豆汁是天然营养原料。酸奶、饮料酒、腐乳、酱类的发酵生产。优点：配制方便，成本较低，营养丰富。生产上用缺点：成分不确定。（2）合成培养基 全由化学成分已知的物质配制的培养基。成分确定。如：高氏培养基、察氏培养基优点：成分确定，重复性强，宜于科学研究 如菌种选育，遗传分析。实验室用。缺点：费用较高。（3）半合成培养基 由部分天然物质和一些成份已知的化学药品配制而成。如：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。优点：营养成分更全面、均衡 实验室、发酵业用得最多。2、根据物理状态分类（1）固体培养基概念：在液体培养基中加入凝固剂琼脂、明胶、硅胶等。常用的是琼脂（洋菜）。琼脂加入量1.52.0。琼脂的特性：1、成分为多缩半乳糖2、绝大多数微生物不能利用3、融化温度96 ，凝固温度45 4、对微生物无毒性 固体培养基作用：培养菌落进行分离、鉴定、计数、保藏（2）半固体培养基加入凝固剂。琼脂加入量0.20.5%作用：观察细菌的运动状况。（3）液体培养基不加凝固剂 用于发酵业。液体培养。3、按用途差异分类（1）基础培养基 概念：含有微生物生长繁殖所需的基本营养物质。用于普通微生物培养。细菌通用培养基牛肉膏蛋白胨培养基。真菌通用培养基马铃薯蔗糖培养基。（2）加富培养基在普通培养基中加入某些特殊物质或某些生长素，只适于一种或一类微生物的生长。特点：某种微生物富集逐渐淘汰其它各种微生物。（3）选择培养基根据培养微生物的生理特性配制。可促进某种微生物生长，抑制某类微生物生长。如：加青霉素的培养基，分离霉菌和酵母菌。 加1%酚分离放线菌 （4）鉴别培养基概念：用以区别不同微生物种类的培养基。特点：确保所培养的微生物有丰富的营养条件。 显示微生物的某些形态构造或生理代谢上的特点。如：伊红美兰培养基区分大肠杆菌和产气肠杆菌。（5）活体培养基用某些活的动植物体或离体的生活组织细胞作培养基。 病毒培养。四、灭菌消毒：应用理化方法杀灭部分微生物（主要是病原微生物）。灭菌：应用理化方法杀灭物体上所有微生物。一）、加热高温灭菌 1.干热灭菌 火焰烧灼灭菌 热空气灭菌2.湿热灭菌 常压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌 煮沸法灭菌 超高温灭菌二）、紫外线灭菌三）、过滤灭菌四）、化学药剂的消毒与灭菌1.高温灭菌：利用高温使菌体蛋白和核酸变性而失去活力以达到杀菌的目的。2.紫外线灭菌：诱发菌体核酸结构变异，及使空气中氧电离、水氧化而产生杀菌化学物质以杀灭杂菌。3.过滤除菌：将处理的含菌液体或气体通过细菌过滤器，使杂菌被机械截留从而达到除菌。4.化学药剂的消毒和灭菌：杀菌剂（破坏微生物的代谢机能并有致死作用）；消毒剂；防腐剂（抑制微生物的生长繁殖）。干燥热空气箱灭菌 用法：160-170,2小时（利用热空气灭菌 ) 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。高压蒸汽灭菌法:利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，提高温度以达到高温灭菌目的方法。 a 方法： 一般121（1kg/cm2或15磅/英寸2） 20min-30min。b 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。 c 注意事项： 灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。干热灭菌的操作n 包扎。n 装箱（物品不可与灭菌箱内壁接触，且不可摆放过挤）n 灭菌（启动开关，并打开排气孔，待温度升至80-100关闭排气孔，继续升温至160-170 计时，恒温2小时）n 降温，取物（关闭电源，自然降温到60度开箱取物）高压蒸汽灭菌的操作n 灭菌前准备（在锅内加适量水）。n 装放物品（不要过挤，且容器口端不要与物品接触）n 加热放气（打开放气阀，待有大量水汽排出，维持35分钟，锅内空气排尽，关上放气阀）n 升温保压（温度，压力升至灭菌所需时计时，压力1.05Kg/cm2,121.3 ，2030分钟）n 出锅（关闭电源，待指针回零，打开放气阀，稍等一些时间，再取物） 湿热灭菌较干热灭菌效果好1) 特点：温度低、时间短、灭菌效果好。2) 灭菌效果好的原因： k 菌体内含水量越高凝固温度越低。 k 蒸汽冷凝会放出潜热。 k 饱和水蒸汽穿透力强。 3、高压蒸汽灭菌（1）灭菌前的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内 加入适量的水，将内桶放入。（2）装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。（3）加热排气：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，维持3-5min，锅内空气排尽，关上排气阀。（4）升温保压： 压力为1.05kg/cm2（121.3）,20-30min（5） 出锅：隔断热源，自然降温，待压力表指针回到零，打开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。实验二 油镜的使用及细菌 基本形态观察一、油镜比低倍镜、高倍镜观察物体更清晰。原因：1） 油镜分辨率高于低倍镜、高倍镜2） 油镜汇聚光线的能力大于低倍镜、高倍镜 分辨率是指显微镜能够分辨的最小距离即鉴别限度（R） R=（2NA） (为入射光波波长； NA为显微镜数值孔径)为标本、物镜之间介质的折射率。为光轴上物点发出的光线与物镜有效直径两端最大夹角角度的一半。 二、染色荚膜染色: 主要成分多为糖类，无色透明且不易着色常用负染色观察。负染色是将细菌细胞和背景着色，从而把无色透明、不着色的荚膜结构衬托显现出来。芽孢染色:细菌芽孢壁厚而致密，透性低，难于染色，但一旦被染色又难于脱色。因此先用强着色力的染料（孔雀绿）处理，并同时加热，使菌体以及芽孢均着色，后使菌体脱色，而芽孢保留原色，经复染（蕃红），菌体与芽孢分别以不同颜色显现。三、油镜使用主要步骤观察前准备 ：显微镜的准备和调试视野明亮低倍镜观察高倍镜观察（此步可以省略）油镜观察：加香柏油，油镜头浸入香柏油中后调焦显微镜油镜头的清洗和归位（二甲苯清洗）实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、简单染色的原理1、 细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。2、 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式。3、 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。 简单染色操作步骤1涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、无菌操作、均匀的薄层2干燥：3固定：加热固定4染色： 结晶紫染1min，或石炭酸复红染1min。5水洗：6 干燥：7镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。 二、革兰氏染色原理革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁 阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 G- 菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。操作步骤1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。2初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。3媒染：滴加碘液染色1-2min，后用水冲洗，甩尽残余水4脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），然后立即用水冲洗。5复染：用石炭酸复红覆盖涂片进行复染，石炭酸复红染1min。水洗，晾干。6镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察。注意事项：1、 选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。2、 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。3、 脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。关键步骤：酒精脱色实验四 放线菌、真菌形态观察及各类微生物菌落特征观察区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别之。特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质地等。细菌菌落特征：凝胶状、表面较光滑湿润、与培养基结合不紧密，易挑取，正反颜色一致。放线菌特征：致密坚硬、多皱、不易用针挑起，不透明。孢子成熟后，表面粉末状，干燥。酵母菌菌落特征：与细菌相似比细菌大而厚，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，易用针挑起。多呈乳白色。霉菌的菌落特征：比细菌菌落大，由菌丝组成疏松的绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有的无固定大小，延至整个培养基中，产色素，使菌落显色。1、印片法操作步骤:1 用拨针将平板上的菌落培养基切割成小方块，并用拨针挑起一块菌落培养基（注意无菌操作），用火焰微加热的洁净载玻片，以生长的菌落面朝向载玻片，在载玻片上不同部位印压。2 将印片加热固定。3 用蕃红染色2-3min，水洗风干。4 镜检：先用低倍镜观察，后换用油镜观察气生菌丝、孢子丝孢子等结构。注意事项：用力要轻，且不要错动，染色水洗时水流要缓，以免破坏孢子丝形态。2、水浸片法操作步骤：（1）在载玻片上滴加一滴碘液，用接种环以无菌操作方式挑取少许啤酒酵母，在碘液中充分混匀，盖上盖玻片。（2）镜检：先低倍镜观察，后换用高倍镜观察细胞形态注意事项：1、 用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。2、 滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。3、 盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。实验五 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数一、镜台测微尺及目镜测微尺 测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺进行。测微尺可分为目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（100等分），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。镜台测微尺为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总长度为1mm(100等分)，每小格长0.01mm (10um) 。目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定，以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。 1、放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放在目镜镜筒的中间隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目镜，并插入镜筒。2、放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。3、标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度，转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移动台尺使目尺与台尺某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，通过如下公式计算：目尺每小格长度（um）= 两对重合刻度线之间台尺所占格数10 两对重合刻度线之间目尺所占格数 菌类大小表示方法：（微米）细菌：球菌：测直径 如：0、52、0um 杆菌和螺旋菌：测宽和长 如：宽*长（um） 0、5*1、02、0（um）放线菌：测分支管状的直径 如：0、5um二、血球计数板利用血球计数板在显微镜下直接计数，是将菌悬液放入血球计数板与盖玻片之间的计数室中，然后在显微镜下计数，因为计数室容积一定，所以可根据测定值推算出菌悬液单位体积所含微生物的总数量它是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。中间平台比两边平台低0.1mm。每一方格网可分为九个大方格，中央大方格就是计数室。大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。每个大方格共含有400个小方格。计数室大方格边长为1mm，底面积为1mm2，高0.1mm,所以每个计数室固定容积为0.1mm3。 计数室每个小方格容积为： 0.110-3400（14）106(ml)计算公式：每ml菌液含菌数 = N K d N：每个小方格含菌数平均值；d：菌液稀释倍数；K = 4106 三、实验方法步骤1 镜检计数室：对计数室进行镜检，若内有污物，清洗后才能计 数。2 加样液：先在血球计数板两个计数室部位加盖玻片，再用无菌 玻棒或滴管沾取待测菌悬液稀释液（已摇匀），从盖玻片边缘 滴加，使菌液沿缝隙靠毛细作用自行进入计数室内。静置5min。3 显微镜计数：将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜观察，后 换高倍镜观察计数。位于格线上菌体只计上边线和左边线上的， 如果出芽酵母芽体大小达到母细胞一半时，可计作两个菌体。选 择五个视野，在每个视野内任意选择五个小方格计数，求出小方 格菌体数量平均值。4 根据公式计算每ml菌液含菌数。5 测量完毕后，取下盖玻片用水冲洗血球计数板（严禁用硬物刷 洗），晾干，放入盒内保存。注意事项（1）取待测稀释菌悬液向血球计数板加样前，须将菌悬液充分摇匀。（2）加样过程中，应避免将菌液滴在盖玻片上。（3）由于菌体在计数室中处于不同空间位置，须在不同焦距下才能观察到，故观察时须不断调节微调，计数菌液中全部菌体，尽量避免遗漏。 实验六 环境因素对微生物生长的影响 紫外线对微生物有诱发突变和致死作用，因紫外线照射剂量不同而异，低剂量用于微生物诱变育种，高剂量用于实验室或工作间消毒杀菌。紫外线照射剂量与照射光强、距离以及照射时间相关。 某些化学药剂（消毒剂）抑制或杀灭微生物，其效应强弱与试剂类型、浓度、作用时间以及作用对象有关 ，有些药剂在浓度极低的情况下仍然有较强的作用。微生物之间存在拮抗。微生物产生的次生代谢产物如青霉素等抗生素可以选择性抑制或杀死其他微生物。不同微生物的抗菌谱不同。青霉素仅对革兰氏阳性菌起作用。实验七 土壤微生物分离纯化及测数 实验八 微生物生理生化特性检测一、 糖发酵的原理 不同细菌对糖的分解利用能力存在较大差异，且产物不同，是常用的鉴别微生物的生化方法。有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体；有些细菌只产酸不产气。若产酸，可根据培养基