细胞组分的分析 DNA,RNA 碱性磷酸酶 多糖 脂.doc

/forum_view.asp?forum_id=23&view_id=941第二节 细胞组分的分析方法形态学观察与细胞成分分析相结合是当代细胞生物学研究中常常采用的实验方法。它为揭示生物大分子在细胞内的构建相互关系及细胞内的功能方面提供了有力的工具。一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物用低渗匀浆、超声破碎、或研磨等方法可使细胞质膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心是将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的高溶解性的惰性物质（如蔗糖），形成密度梯度溶液的表面。在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数（S值）表示。超离心机可达8104r/min，产生50万倍重力场。在这巨大离心力的作用下，甚至相当小的tRNA（沉降系数4S）和单一的酶都可根据其沉降系数相互分离开。差速离心与密度梯度离心相结合可以达到更精细的分离（图3-10）。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。例如福尔根（Feulgen）反应可以特异显示DNA的分布：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫（Schiff）试剂反应呈紫红色。PAS反应则可确定多糖的存在，其原理同样是利用希夫试剂与醛基之间的反应，这时的醛基来自过碘酸氧化多糖的“1，2-乙二醇”基，使醛基释放。因为多糖类物质都能产生PAS反应，所以可以用不同方式改进其反应特异性。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在。苏丹（深红色）通过扩散进入脂滴中，使脂滴着色。苏丹黑也溶于磷脂和胆固醇中，产生较大的颜色反差。样品中的蛋白质成分也有多种检测方法。在米伦（Millon）反应中，氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应，形成红色沉淀。在重氮反应中，氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸起反应形成有色的复合物。蛋白质中的SH 基可用形成硫醇盐共价键的试剂进行检测。由于大多数固定剂对酶都有钝化作用，所以，在进行细胞中某种酶的定性研究时，样品制备或采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短期固定，以尽量保持酶的活性，然后将样品（细胞或组织切片）与适宜底物共同温育。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞（Gomori）方法，是用甘油磷酸酯作底物，由于酶水解释放的磷酸根，在钙离子存在的情况下转变成不溶性的磷酸钙，进而转变成金属银或硫化铅、硫化钴或其它有颜色的化合物，金属沉淀或颜色的存在部位，即碱性磷酸酶存在的活性部位。图3-10 差速离心结合密度梯度离心分离细胞组分示意图 三、特异蛋白抗原的定位与定性二十世纪70年代以来，免疫学的迅速发展为细胞生物学的研究提供了强有力的手段，特别是在细胞内特异蛋白的定位与定性方面，单克隆抗体与其它一些检测手段相结合发挥了重要作用。免疫荧光与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术，而对蛋白质进行体外分析定性通常则采用免疫印迹（western bloting）和放射免疫沉淀（radioimmuno-precipitation）等技术，这里不再一一介绍。（一）免疫荧光技术前面已经介绍了荧光显微镜技术，其中也提到免疫荧光技术。所谓免疫荧光技术就是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。它主要包括荧光抗体的制备，标本的处理，免疫染色和观察记录等过程。标本处理有多种方法，组织切片、冰冻切片、整装细胞都可应用，其宗旨只有一个，即要尽量完好地保持被检测蛋白的抗原性；免疫染色就是抗原抗体反应的过程，这里要注意设立各种实验对照以检验结果的可靠性。除免疫荧光技术外，还可用免疫酶标记技术，即以酶（如辣根过氧化物酶）代替荧光素与抗体偶联，因此可在普通显微镜下观察。近年来，共焦点激光扫描显微镜的应用使免疫荧光技术在细胞生物学研究中发挥了越来越大的作用。（二）免疫电镜技术免疫荧光技术快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。同样用抗原抗体反应的原理，免疫电镜技术则能有效地提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。免疫电镜技术可分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术与免疫胶体金技术，这也代表了免疫电镜技术的发展过程。目前，免疫铁蛋白技术几乎已无人问津，而免疫胶体金技术则受到越来越多的细胞生物学工作者的青睐。直径在1100nm的胶体金本身具有许多优点，如：金颗粒容易识别，并且具有很高的分辨率；可以制成不同直径大小的金颗粒，用以双重标记或多重标记；既可用于超薄切片，也可以用于整装制备的骨架成分和膜系统蛋白成分的标记。免疫电镜技术中最关键的问题同样是保持样品中蛋白的抗原性，并且要设立严格的对照。此外，在免疫电镜技术中，还必须注意尽量保存样品的精细结构。免疫电镜技术至今已在以下方面得到广泛应用，如：蛋白分泌的研究，通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；一些结构蛋白的研究，包括膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等，图3-11是280kD核骨架蛋白的定位。图3-11 体外培养的BHK-21细胞经选择性抽提后用抗280kD核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果IF： 中间纤维； g： 金颗粒； N： 核区。（焦仁杰，吴冬兰）四、细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸（DNA或RNA）序列的定性与定位通常采用原位杂交技术（in situ hybridization）。用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交。原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的，放射性同位素标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位；或用荧光素标记的探针进行杂交，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸存在部位。近年来，随着免疫胶体金技术在细胞生物学研究中的应用，电镜原位杂交技术得到了发展。电镜原位杂交能将特异核苷酸序列的定位与细胞的超微结构结合起来，其基本原理与光镜原位杂交类似，只是探针标记物不同，以生物素等一些生物小分子代替同位素或荧光素标记探针，杂交反应的检测是通过与抗生物素抗体相连的胶体金颗粒显示出来的。原位杂交技术在显微与亚显微水平上研究基因定位、特异mRNA表达等问题的研究中起重要作用。五、利用同位素技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或 AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪（pulse-chase）是这一技术的独具特征。放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。经常应用于生物学研究的同位素及其性质如表3-3，根据实验要求可选择合适的同位素。表3-3 常用放射性同位素的基本特点（用射线） 同位素 放射性粒子 在乳胶内的射程 半衰期32P 硬 数 mm 14.2天14C 中等能量 平均10m 5760年3H 软 0.8m 12.3年35S 中等能量 10m1mm 87 天131I 中等能量 10m1mm 8 天研究DNA合成时通常是用氚（3H）标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR），研究RNA合成时是用氚标记的尿嘧啶核苷（3H-U）；在研究含硫蛋白分子代谢时，可用35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸，3H或14C标记的蛋氨酸、亮氨酸等也是常用于蛋白分子合成的前体。同位素标记的前体物掺入细胞即标记，标记后可用自显影方法追踪被标记物在细胞中的位置与代谢速率。专门用于放射自显影的乳胶称为核子乳胶，其成分与普通感光乳胶相似，乳胶中卤化银晶体颗粒的大小与密度均有严格的要求，以提高分辨率与灵敏度。显微放射自显影的基本实验步骤如下：首先用合适的放射性前体分子标记机体或细胞，根据实验的需要，按标记的持续时间分为持续标记和脉冲标记。标记后的组织与细胞可按常规方法制片，在暗室中向样品表面均匀地敷一层厚约310m的乳胶，然后在暗盒中曝光（或称自显影）数天，再经显影、定影后于显微镜下观察。细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。电镜放射自显影技术的基本原理与显微自显影相同，实验操作过程亦相似。与显微自显影不同之点是样品制备与敷乳胶的要求更为严格，尽量在超薄切片上敷涂一层卤化银单晶体层的乳胶。曝光时间一般长达数月。图3-12是电镜放射自显影图片，显示细胞核内RNA的合成部位。六定量细胞化学分析技术前面介绍了细胞内不同成分的细胞化学定性与定位方法，然而蛋白或核酸等生物大分子在某个细胞中或细胞群体中的含量分析对了解该物质的生物学功能是十分重要的。下面介绍二种细胞化学的定量分析方法。（一）显微分光光度测定技术细胞显微分光光度术（microspectrophotometry）是利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，用来测定这些物质如核酸与蛋白质等在每一个细胞内的含量的一种实验技术，如DNA对紫外线最高吸收波长是260nm。也可经过特异的染色反应，如DNA经Feulgen染色反应后就可以吸收波长为546nm的可见光波段，与分光光度仪测定溶液成分的方法相比，这种技术不仅可以定位，而且可以灵敏地测出一个细胞内某种成分的含量。图3-12 鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞24小时后，用3H尿嘧啶核苷脉冲标记10分钟的电镜放射自显影图片。在病毒大量复制与装配的宿主细胞中，核仁（Nu）依然存在，并保持其转录功能SG： 银颗粒； N： 细胞核； Nu： 核仁； C： 细胞质。细胞显微分光光度测定法可分为紫外光显微分光光度测定法与可见光显微分光光度测定法。前者是利用细胞内某些物质对紫外光某波段特有的吸收曲线来检定相应物质的含量；后者则是根据某种物质特异的染色反应，然后再测定其对可见光某特定波段的吸收能力来进行对该物质的定量测定。（二）流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometry）可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分