cell打印机.doc

视频条建立瞬态细胞膜毛孔用一个标准喷墨印表机亚历山大b Owczarczak,史蒂芬o . Shuford,斯科特t木,桑德拉Deitch,Delphine迪恩生物工程部门,克莱姆森大学通讯:Delphine 迪安URL:/video/3681/ 土井:10.3791/3681 关键词:生物工程、发行61,bioprinting、喷墨、细胞、肌动蛋白、荧光、transfection, 出版日期:3/16/2012 编目:Owczarczak,还是,Shuford,S.O.、木材、s.t。,Deitch,年代。,迪恩,D。建立瞬态细胞膜用一个标准喷墨孔打印机。j .秒。经验。(61),e3681、土井:2012(10.3791/3681)。文摘Bioprinting已经得到了广泛的应用和意义,包括组织工程,应用直接细胞疗法,和生物传感器等微细加工。1 - 10 最近,热喷墨打印也被用于基因transfection。8、9 热喷墨打印结果表明过程暂时破坏细胞膜不影响细胞之可行性。瞬态孔隙中膜可用于介绍分子, 是太大,否则我们就会通过膜,进入细胞胞浆。8、9、11 这里的应用被证明是使用热喷墨打印的一体化的g-actin单体荧细胞活力光标记细胞。利用热的优势喷墨打印到细胞注射分子,这项技术是相对温和的细胞。印刷后已被证明是类似的标准单元的电镀方法1,8。此外，喷墨印刷可以处理成千上万的细胞分钟，这是比手动显微注射快。印刷所创建的毛孔已被证明约两小时内关闭。然而，有一个创建（10 nm）的印刷技术，这限制了该技术为细胞注入孔的大小限制小的蛋白质和/或颗粒。8,9,11一个标准的HP DeskJet500打印机进行了修改，允许细胞印刷。3，5，8打印机盖被拆除和纸机制是使用机械杠杆绕过。创建一个阶段是直接允许放置显微镜载玻片和盖玻片打印头下。打开墨盒，墨水被拆除和清理之前使用细胞。印花图案创建使用标准的绘图软件，然后通过一个简单的打印命令的打印机控制。 3T3成纤维细胞生长水溶性荧光标记的G-肌动蛋白单体的汇合点，胰酶消化，然后磷酸悬浮缓冲液。在细胞悬浮液吸管墨盒和印到玻璃显微镜盖玻片的细胞系。活细胞成像使用荧光显微镜和肌动蛋白被发现在整个细胞质中。进入细胞内的肌动蛋白荧光团可成像短的时间骨架动力学和广泛的应用范围非常有用。13-15视频链接1。转换的HP DeskJet 500应当指出，这种技术应与许多商用喷墨打印机。然而，旧的打印机往往更好的工作，因为他们使用墨盒，直径较大的喷嘴，不堵塞一样容易。此外，老式打印机倾向于使用机械进纸传感器更容易绕过。光学传感器的打印机可以被欺骗，但使用的打印机的远缘小片纸，在每一个周期，但比机械系统的“猫腻”多一点困难。目前市面上的打印机工作最好有低分辨率（DPI）。更高分辨率的打印机往往更容易堵塞。惠普Deskjet 500的分辨率为300 dpi。有许多市售打印机（HP Deskjet系列和其他人），有一个600 dpi的分辨率。这种类型的打印机可以使用只是一个小喷嘴增加堵塞可缓解（第3）仔细清洗的问题。2012年3月| 61 | e3681 |第1 6可视化实验版权所有20121。解锁从底座打印机的几个塑料夹，慢慢抬起顶部关闭删除打印机顶部的塑料外壳。2。松开按钮/显示打印机顶部的光面板，离开它连接到打印机的主板。3。清洁打印机内部，尤其是地区的地方在于墨盒和印刷发生。4。找到电缆供电纸机制，并从主板上拔下。1。在HP DeskJet 500，这些被发现略低于朝着左前方的纸盒。5。找到纸张检测机制。绕过字符串或线环作为手动拉手追究机制。1。中的HP DeskJet 500，纸张检测机制是一个灰色的塑料杆，发现上面和后面的印刷/纸机制。6。在进纸机制，以便将美联储从纸张和沉积前创建一个阶段带来所需的打印幻灯片墨盒打印头正下方的水平。2。转换为股票的惠普墨盒（HP 26黑色墨盒）3。清洁墨盒4。细胞悬液 - “Bioink”5。 BioprintingNew! Click the words above to view alternate translations. Dismiss2012年3月| 61 | e3681 |第2 6可视化实验版权所有20121。对于我们的实验中，用泡沫航运持有15 mL离心管显微镜在录音在几个幻灯片打印区域带来的幻灯片的最后一级所需的高度。7。要保持无菌技术，打印机可以被放置在一个标准的生物危害柜或桌面层流罩。8。重要的是要注意，修改市售喷墨打印机通常会打印机制造商的保修失效。1。从包装中取出墨盒，留下暂时覆盖打印机的接触和打印头的保护胶带。2。要么与一个夹子或老虎钳（只是牢牢攥在手墨盒通常工作稳定身体墨盒（黑色部分）井），留下绿色的顶端清除任何障碍。3。用钳子或活动扳手，把握绿色墨盒的顶部和扭动，来回几次，直到它打破了自由。1。这是不应该花太多的力量，但不再需要的顶端，所以它是好的，如果它打破取出时。4。用螺丝刀撬开现在暴露的透明塑料片。1。再次，这不应该花太多的力量，但它不会需要，因此它是好的，如果它在搬迁过程中打破。5。清空任何其余水库。6。取下塑料覆盖打印机的接触和打印头的保护胶带。7。水库的水彻底冲洗。1。使用吸管或注射器推水通过渠道。2。在此过程中，水从打印头可能会泄漏，这是可以接受的，不会造成任何损害的功能墨盒。8。当水运行明确，使墨盒晾干。1。为了保持一个干净的印刷环境，使用前后应清洗墨盒。1。这也有助于避免结晶盐和其他生物材料的墨盒可能会导致堵塞。2。完全淹没在去离子水的烧杯墨盒，超声15分钟之前和之后，印刷。3。超声波处理后，取出墨盒从水中，摇出多余的水分。4。 70的乙醇喷入墨盒，以创造更多的无菌环境。1。确保乙醇加入bioink印刷解决方案之前，干燥。1。培养细胞，直到准备到通过。1。对于3T3成纤维细胞：种子细胞，对T-75瓶约1.3x104细胞/厘米2Dulbeccos改性老鹰培养基（DMEM培养基）10胎牛血清（FBS），。两天孵化器培养细胞在37C和5的二氧化碳。2。使G-肌动蛋白的荧光浓度原液在磷酸盐缓冲液（PBS）的50微克/毫升。3。传代细胞。1。 3T3成纤维细胞：从烧瓶中取出的媒体，用PBS冲洗两次。覆盖用5毫升0.25胰蛋白酶+ EDTA，并培育5细胞分钟。2。新鲜培养基中加入5毫升到15毫升锥形离心管中，并在5分钟1000转离心吸取细胞悬液。抽吸介质花。4。荧光G-肌动蛋白原液创建bioink PBS重悬细胞。1。 bioink应该有10微克/毫升最终G-肌动蛋白的浓度和细胞浓度1105细胞/毫升。这个浓度已经优化，以限制每一滴水和打印头堵塞的细胞量。82。请注意，250l的bioink的打印模式如图2所示的三个盖玻片。1。电源和让打印机热身。2。地方所需的印刷面（在这里，我们使用22毫米22毫米盖玻片）在步骤1.6准备阶段的中心。3。创建一个印刷图案文件。1。打开Microsoft Word（或任何其他的绘图软件），并绘制所需的图案。2。挑选一个细胞中的预制文件印刷所需的打印模式。4。加载所需的细胞悬液的制备墨盒。1。移液器悬挂墨盒舱底部的小圆形。使用约100-120微升的溶液。 “打印墨滴大小大约是130皮升。85。惠普Deskjet 500打印机打印文件。1。为了达到最佳效果，打印小图案（5）多次，通过改变在文字处理程序所需的副本数量。6。打印机将再次热身，然后墨盒会移动到“准备位置”。7。当墨盒移动到准备位置（稍远低于左侧的墨水滴，并在那里停留），拉纸机制电线，印刷应该开始。1。对于多个副本的印刷，纸机制将每个周期或页打印后公布。墨盒然后将返回到“准备就绪”的位置，进纸机制电线应再次提出。6。代表结果整个转换过程中的一个标准的，现成的惠普Deskjet 500的代表性成果，标准HP 26系列墨盒创建一个打印机与如前所述印刷多种类型的细胞分析解决方案的能力。转换完成后的打印机如图3所示，放置在显微镜的盖玻片上印刷阶段。打印机可以在许多领域的分析是有用的，包括但不仅限于：单细胞力学，组织工程，基因转染，缩微传感器，和直接的细胞疗法。1-10，16-22在这个例子中的HP Deskjet 500打印机和惠普26系列墨盒被为bioprinting修改。这台打印机设置与bioink使用组成了一个G-肌动蛋白单体溶液中的成纤维细胞悬液，细胞印到玻璃显微镜的盖玻片。图1说明印刷成纤维细胞，这表明成立荧光的肌动蛋白单体的代表性成果。结果在受控无菌的环境，使细胞被打印成定制的模式。在这个例子中使用的模式是建立在Microsoft Word中（图2）。这种模式创造了连续线横跨印刷解决方案大多数的显微镜幻灯片。图4显示了直线的bioink和细胞相互存放。应当指出，后，立即打印，有背景荧光的增加，因为bioink解决方案，在该细胞被暂停，包含免费的多余荧光的肌动蛋白单体。此背景荧光显着下降 后，除了对生长介质细胞（图1），洗去多余的基板单体。图1。 3T3成纤维细胞3小时后，使用修改后的喷墨打印机打印的代表图像。细胞内部显示纳入荧光标记的肌动蛋白单体。标尺代表50微米。图2。设计中使用打印bioink。图3。打印机后与泡沫塑料阶段转换。在中间的橙色线绕过纸杆传感器。2012年3月| 61 | e3681 | 3 6可视化实验版权所有20128。打印机将打印到盖玻片上的印刷阶段的中心放置在步骤5.2（见图2）。讨论图4。代表的形象印在本地化印刷区3T3成纤维细胞。 5分钟后，在20倍印刷所采取的显微镜图像放大倍率。图5。荧光图像（40倍放大倍率）印刷后呈现出成纤维细胞与内在荧光的肌动蛋白单体3个小时。比例尺代表50微米。图6。印刷15分钟后，采取了细胞的荧光显微镜（20倍放大）。图像显示两个G-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。从左至右依次为：G-肌动蛋白的Alexa Fluor 488，细胞核用DAPI，两者的叠加。图7。荧光显微镜显示在3小时后，印刷生产线模式的成纤维细胞。左边的图像显示荧光标记的肌动蛋白单元格单体内。右边的图片是一个荧光通道与背景图像的叠加显示，虽然有可能一些碎片上的幻灯片（左下角），它不会发出荧光。标尺代表50微米大小，如果不表示最右边是一个控制组非印刷细胞孵育3小时，荧光标记单体。此控件是为了表明，单体无法穿透细胞膜无细胞印刷膜的通透性。也不是特别困难的过程转换为bioprinting一个标准的喷墨桌面打印机。最具挑战性的一步是确定如何旁路送纸机制，这是取决于打印机的品牌和模型。然而，这是相对简单的纸张时此处所述的饲料传感器是机械。对于饲料用光学传感器的型号，其他技术可能需要采用欺骗打印机以为它正在使用的纸张，例如，可以运行，而它在显微镜幻灯片打印一张纸通过打印机的小块。旁路送纸机制是不同型号的打印机在应用这些程序可能是最困难的一步。2012年3月| 61 | e3681 |第4页6可视化实验版权所有2012在建设阶段举行印刷盖玻片，它是重要的，以确保正确的路线和高度。该阶段应允许盖玻片被放置在中间的印刷面积。此外，它应该在适当的高度放置盖玻片允许放行打印墨盒通过幻灯片，而不破坏它。该阶段的确切高度将取决于打印机型号。，以确保印刷细胞没有得到冲走，幻灯片印刷后立即放置在一个孵化约30添加分钟前允许其他细胞的生长介质，细胞附着。由于细胞被印在一个解决方案，包括PBS的细胞大量未干，仍然是可行的。细胞成像用荧光显微镜可视化分布标签G-肌动蛋白在细胞内的单体（图1，5-7）。 3T3成纤维细胞打印时，图5显示了一个有代表性的结果，造成的肌动蛋白细胞发出荧光，但展示增加亮度线。 G-肌动蛋白荧光标记注册细胞骨架是细胞骨架动力学和细胞力学的研究有用。12-15这种技术的局限性在于它只有适用于直径小于约10纳米的分子和蛋白质，。，以确保细胞实际上被转换打印机处理的DAPI（在PBS 1:5000）被添加到一半的地方bioink体积纯PBS。荧光染色的DAPI结合氨基酸丰富的DNA位于细胞核中的部分。因此的DAPI是一个有用的污点在印刷细胞荧光成像原子核。图6显示了一个单元的形象代表，显示双方的Alexa Fluor 488（肌动蛋白）和两者的叠加图像的DAPI荧光（核）。图7还说明了如何细胞会发出荧光，一旦G-肌动蛋白单体有被列入非生物材料已进入样品存放不会因为缺乏G-肌动蛋白荧光单体。一个重要的考虑因素bioprinting，是被用于bioink的水介质。结果发现，使用标准的细胞的生长介质血清中产生不一致的结果。这很可能是由于血清蛋白的打印头喷嘴堵塞。 PBS的使用增加印刷图案的一致性和沉积细胞的数量。用PBS的一个缺点是，不应留在细胞长时间的暂停。然而，在这些例子中的成纤维细胞能够承受至少一个小时的bioink条件无细胞活力的变化。这是与前几个结果，报告说，通过热喷墨机制印刷的细胞有一致被证明具有高生存能力率。2-8此修改打印机设置，可用于细胞印刷以外的应用程序。16-22基质蛋白，如胶原蛋白或纤维连接蛋白，可以很容易地窗体顶端印刷基板上使用了这种技术，它可以是有用的细胞图案的。例如，我把线条图案印刷型胶原会导致在排列的胶原蛋白可以在体外细胞培养的研究中使用的基板。17除了基质蛋白，其他的分子，其中包括增长因素的影响，可以可靠地定位于基底细胞研究和潜在的治疗应用。18在上述步骤中所述的设计的一个主要限制是，这台打印机是不能够在多个维度打印。这限制了如脚手架印刷图案的应用潜力。为了让3D印刷，需要使用一个专门的阶段。舞台需要有增量调整高度层层沉积bioink。bioprinting显示效率和成本效益的方法，组织工程，基因转染，缩微和芯片的承诺制造。1-12，16-22许多这种类型的设备在未来的应用，包括：建立控制和图案蜂窝微环境，细胞的细胞质纳入大分子，细胞沉积到支架和结构不发生自然或有效。披露我们什么都没有透露。致谢笔者想承认博士托马斯博兰细胞印刷使用HP DeskJet打印机的想法。为这个项目提供资金从NSF RII-EPS 0903795和NIH K25中HL0922280。参考文献2012年3月| 61 | e3681 | 5 6可视化实验版权所有20121。卡尔弗特研究材料科学。印刷细胞。科学。 318（5848），208-209（2007）。2。米罗诺夫，五，李嘉欣，与德比，B.审查：Bioprinting：一个开端。组织工程。12（4），631-634（2006）。3。辣椒，ME，Parzel，伯格，吨，博兰研究，伯格，KJL，groff的，重新两三维喷墨bioprinter的一个设计和实施。PROC。 IEEE工程。 MED。生物学。 SOC。 3-6，6001-6005（2009）。4。坎贝尔，P.魏斯，组织工程研究与喷墨打印机的援助。专家OPIN。生物学。TH。 7（8），1123年至1127年（2007年）。5。博兰，T.，许，T.，达蒙，B，与崔十喷墨打印组织工程中的应用。生物工程。研究1（9），910-917（2006）。6。米罗诺夫，五，普雷斯特维奇，G。，与Forgacs，G. 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