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miR-21调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究专业: 口腔临床医学关键词: 舌鳞状细胞癌 miR-21调控 细胞凋亡 颈淋巴转移 miRNA表达 靶向治疗分类号: R739.86 R730.2形态: 共 97 页约 63,535 个字约 3.039 M内容内容摘要舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤，约占口腔恶性肿瘤的43.4%。舌鳞状细胞癌常造成患者的语言、进食等功能障碍及颜面部的畸形，严重影响患者的生存质量。舌鳞癌常常发生早期颈淋巴转移，且转移率较高。近二十年来，尽管临床上舌鳞癌的综合治疗已经很普遍，但以手术为主，放化疗为辅的综合治疗对舌鳞癌生存率的提高并不明显，5年总体生存率仍然较低，徘徊在50%55%左右，并没有显著提高，中晚期患者的5年生存率更低，约为27%，而且这些方法都存在各自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻找更安全有效的治疗途径是提高舌鳞状细胞癌生存率和生存质量所亟待解决的难题。大量的研究已经证实，人类疾病的发生发展直接和间接地与基因密切相关，因此，可以认为人类的疾病都是基因病。所以从本质上来说，舌鳞状细胞癌也是一种基因病，与细胞的生长增殖和凋亡失控等密切相关。从理论上讲，基因治疗有望解决这些问题，所以恶性肿瘤的基因治疗是近十几年来的研究热点。但长期以来人们一直不遗余力地寻找某一基因和某一疾病的对应关系，由于概念与技术的局限，把这种寻找变成了一对一的简单线性关系的研究，有“零敲碎打”之嫌，致使目前基因治疗的效果不尽人意。由于肿瘤的发生发展涉及多个编码基因的改变，只是单纯抑制某个基因的表达，难以有效地起到抑癌作用。可喜的是，人类基因组计划已于2003年4月完成全部序列测定，进入了后基因组时代即功能基因组学时代，基因组科学完成了一次历史性转折，而疾病基因组学也不断取得成果，在观念和技术上，初步实现了由“零敲碎打”向“整体阐明”的转折。舌鳞癌细胞与其它恶性肿瘤一样，其生物学特性取决于其特异表达的基因，而在肿瘤发展过程中必然伴随着不同的基因表达变化。那么，调控舌鳞癌细胞特异的基因表达及其发展过程中基因表达变化的生物学机制是什么？对于这一问题，虽然目前还没有确切的答案，但是，近年非编码RNA(noncodingRNAs)，特别是微小分子RNA(microRNA，miRNA)调控基因表达研究的兴起给回答该问题提供了新的线索。内源性miRNA可调控数十到数百个基因的表达，因此，肿瘤细胞内起到“促癌”和“抑癌”作用的非编码miRNA比编码的癌基因和抑癌基因少得多，可以成为更稳定有效的抗癌靶点。miRNAs的研究分析提示，miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至是肿瘤发生。在众多相关疾病中，恶性肿瘤的miRNA表达异常最受瞩目。根据高通量的miRNA微阵列和实时定量RTPCR(quantitativerealtimePCR，qRTPCR)分析，发现在多种人类恶性肿瘤中，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的miRNA表达谱与它们来源的正常组织存在很大区别，这种区别在低分化和恶性程度高的肿瘤组织表现得更显著些。在某些恶性肿瘤中，miRNA含量比来源的正常组织明显降低，肿瘤分化越差，miRNA的含量也越低，如在乳腺痛组织中，miR-10b、let7、miR-125b和miR-145等的表达明显下调。而某些miRNA在肿瘤组织内的表达却有所上升，如乳腺癌中的miR21和miR-155。恶性肿瘤miRNA表达的变化说明肿瘤细胞基因调控机制发生改变，与cDNA微阵列比较，miRNA表达谱能为癌肿的分子分期和分型提供更准确的信息。随着新的miRNA的不断发现及其功能的逐渐明确，使得miRNA的研究倍受关注，成为当前研究的热点之一。大量研究发现在癌细胞中表达异常的miRNA的靶基因属于癌基因或者抑癌基因，这些靶基因都与细胞的增殖、凋亡或分化密切相关。正是因为miRNA具有调节癌基因或者抑癌基因表达的功能，故其自身也充当着“抑癌基因”和“癌基因”的角色。然而在头颈肿瘤，特别是以舌鳞癌为代表的口腔鳞状细胞癌中相关miRNA及其功能的研究未见报道。本研究采用高通量的miRNA微阵列筛选出不同分期的舌鳞癌组织和癌旁正常组织中差异表达的内源性miRNA，获得舌鳞癌细胞的miRNA表达谱；选取在早期和中晚期舌鳞癌中都显著高表达的miR-21为进一步研究对象，通过qRT-PCR验证其在50例不同分期舌鳞癌组织中的差异表达；同时采用免疫组织化学方法检测miR-21靶基因原肌球蛋白1(tropomyosin-1，TPM-1)在同样50例舌鳞癌组织中的表达，并用Tunel凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，结合患者的临床资料统计分析相关指标之间的关系。在此基础上，建立体外培养舌鳞癌细胞模型，检测miR-21在细胞中的表达，并通过转染miR-21拮抗物和TPM-1siRNA对其调控功能进行分析研究。为阐明miRNA调控舌鳞癌细胞增殖、分化和凋亡的生物学机制提供新线索，以期为研制靶向舌鳞癌细胞的miRNA或其靶基因的新型基因药物提供实验依据。第一部分舌鳞癌组织和癌旁正常组织miRNA差异表达分析 目前研究miRNA表达的方法有克隆测序、RNA印迹以及RNA酶保护分析(RNAaseprotectionassay，RPA)。但对于肿瘤研究，非常需要大规模比较肿瘤组织和正常组织中的miRNAs表达谱差异，以上的方法耗时耗力，检测的通量不高。而基于荧光标记的基因芯片技术(Microarraytechnology)提供了大量检测多种miRNAs表达的平台。这一技术可以有效快捷地同时比较大量miRNAs表达变化情况，已在诸多实验室被用于miRNAs的研究。RNA印迹和RT-PCR技术虽然是低通量的检测技术，但芯片检测的结果仍需要它们进行验证。检测成熟miRNA的PCR方法是最近才发展起来的方法，它是验证miRNA芯片数据或检测单个miRNA表达的高灵敏度的方法。本部分研究应用miRNA微阵列技术，初步分析舌鳞癌组织和癌旁正常组织miRNA表达谱的差异和不同分期的舌鳞癌miRNA表达谱变化。选取在早期和中晚期舌鳞癌中都显著高表达的miR-21为进一步研究对象，通过qRT-PCR验证其在50例不同分期舌鳞癌组织中的差异表达。研究结果显示：1.舌鳞癌组织和癌旁正常舌黏膜组织中存在差异表达的miRNA分子。从总体上看，晚期舌鳞癌组miRNA分子表达差异较大，早期组差异相对较小。2.在早期舌鳞癌组中，与正常舌黏膜相比具有表达变化的miRNA分子有25个，其中上调表达的有10个(miR-16，miR21，miR31，)，下调表达的有15个(miR26b，miR-148a，miR-198，). 3.在晚期舌鳞癌组中，与正常舌黏膜相比具有表达变化的miRNA分子有28个，其中上调表达的有26个，下调表达的有2个(miR23a，miR26a)。第二部分miR21、TPM-1和细胞凋亡的相互关系及临床意义 一些实验和临床研究证据都显示，miRNAs可以作为一类新的肿瘤癌基因或者肿瘤抑制基因。当这些miRNAs的表达在肿瘤中增高的时候，就被看作癌基因，它们通过促进肿瘤增殖或者抑制肿瘤抑制基因，调控肿瘤细胞的分化和凋亡。目前研究已经发现很多miRNAs在不同的肿瘤中过度表达，它们都作为原癌基因促进肿瘤增殖，但是只有其中少数部分的功能研究得比较清楚。有学者对多种肿瘤中都表达升高的miRNAs进行归纳，发现miR21在几种肿瘤中都是表达升高的。近年来，许多学者对TPM-1的组成结构及与多种肿瘤的关系进行了研究，普遍认为TPM-1作为一个抑癌基因有可能成为一种新的肿瘤标记物。国外的一项研究提示TPM-1是miR21的一个靶基因，下调miR21可提高TPM-1的表达，促进乳腺癌细胞的凋亡。为了解miR21、TPM-1表达与舌鳞癌细胞凋亡的相关性，本实验采用免疫组织化学方法检测miR21靶基因TPM-1在同样50例舌鳞癌组织中的表达，并用Tunel凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡指数(apoptosisindex，AI)，结合患者的临床资料统计分析相关指标之间的关系。第三部分miR21对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控 随着越来越多的miRNAs不断被发现，人们的研究焦点转移到miRNAs的功能研究。miR21作为人类细胞或组织中发现较早的、存在较为广泛的miRNA，在人类miRNAs的功能研究中发挥了不容忽视的作用。目前有多种研究miRNAs与所预测靶基因关系的方法得到了大家的认可，如采用报告基因载体法，通过对报告基因表达水平的检测估计miRNA与靶序列的结合情况，另一个重要的方法是功能缺失试验，即用2羟基甲基化的反义寡核苷酸(ASO)阻断miRNA的功能。最为直接的证据仍然是借助于ASO的功能缺失试验。本实验通过建立体外培养舌鳞癌细胞模型，检测miR21在舌鳞癌细胞株SCC-15和CAL27中的表达，并通过转染miR21ASO和TPM-1siRNA对其调控功能进行分析研究。为阐明miRNA调控舌鳞癌细胞增殖、分化和凋亡的生物学机制提供新线索，并为研制靶向舌鳞癌细胞的miRNA新型基因药物提供实验依据。我们认为，舌鳞癌和癌旁正常舌黏膜组织中存在差异表达的miRNA分子，其中miR-21显著高表达，在舌鳞癌的发生发展中扮演了促癌基因的角色，TPM-1为miR-21的靶基因，通过抑制miR-21可增加TPM-1的表达，促进舌鳞癌的凋亡.-全文目录文摘英文文摘论文说明：英文缩略词表前 言第一部分 ：舌鳞癌组织和癌旁正常组织miRNA差异表达分析材料和方法结 果讨 论小 结第二部分 miR-21、TPM-1和细胞凋亡的相互关系及临床意义材料和方法结 果讨 论小 结第三部分 miR-21对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的调控材料和方法结 果讨 论小 结全文总结问题与展望参考文献综 述 MicroRNA对恶性肿瘤生物学特性的调控作用-相似论文1. 芪蓝颗粒干预大鼠舌黏膜癌变模型中的Survivin、Bcl-2及p53的表达和相关性研究,45页,R739.86 2. CN舌鳞癌颈部淋巴结隐匿性微转移与预后的研究,35页,R739.86 3. 舌癌患者半侧舌体切除术后汉语元音共振峰频谱分析,47页,R739.86 4. 舌鳞癌前哨淋巴结的临床研究,32页,R739.86 5. siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-2，-9及TIMP-1，-2蛋白表达的影响,63页,R739.86 6. VEGFsiRNA对人舌癌Tca8113细胞移植瘤生长影响的研究,48页,R739.86 7. 诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子-C在舌癌淋巴转移中的表达及相关性研究,35页,R739.86 8. 舌鳞癌原发病灶与淋巴结转移的临床及病理研究,38页,R739.86 9. Notch1在人舌鳞癌中的作用及其与表皮生长因子受体信号的交互作用,121页,R739.86 10. 靶向hTERT反义寡核苷酸对人舌鳞癌细胞增殖和端粒酶的抑制作用,107页,R739.8 R730.5 11. 同源异型盒基因与人涎腺腺样囊性癌发生、发展及诱导分化的研究,108页,R739.87 12. HIF-1与VEGF在涎腺腺样囊性癌中的表达和相关性研究,36页,R739.87 13. RNA干扰iNOS基因对舌鳞癌细胞增殖活性及VEGF表达抑制的实验研究,50页,R739.86 14. Ki-67、p16与腮腺多形性腺瘤术后复发的相关性研究,43页,R739.87 R730.7 15. 超声，CT，MR在面颈部神经鞘瘤诊断中的病理基础和临床价值,36