细胞生物实验指导.doc

细胞生物学实验指导前 言本实验指导是在龚宁所编细胞生物学实验指导（2003年2月）的基础上修订而成，此次修订是根据实验内容的变化进行的，删除了已经纳入生物技术大实验的内容，增设了微分干涉差显微镜的使用、电子显微镜演示、细胞凋亡等内容。本实验指导编写过程中参考了杨汉民主编细胞生物学实验（1997年7月第二版）、李素文主编细胞生物学实验指导（2001年10月第一版）和中国农业大学生物学院所编细胞生物学实验指导（2000年4月），设置了15个实验，使用时可根据当时的具体情况选作10个。 由于编者的水平有限，本指导中难免错漏之处，恳请使用本指导的师生提出批评和建议，以便及时修改。 编 者2007年1月3日细胞生物学实验指导目录实验一 细胞形态结构的观察及大小测定1实验二 微分干涉差显微镜的使用2实验三 口腔上皮细胞的荧光观察4实验四 叶绿体的提取5实验五 植物材料中DNA的提取6实验六 细胞膜的渗透性8实验七 光镜下植物细胞骨架的制片技术及观察10实验八 线粒体和液泡系的超活染色与观察 11实验九 DNA的细胞化学反应Feulgen反应 13实验十 RNA的细胞化学反应Unna 反应 15实验十一 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察17实验十二 联会复合体的染色与观察18实验十三 去壁低渗法制备植物染色体标本19实验十四 细胞凋亡22实验十五 透射及扫描电镜演示实验23实验一 细胞形态结构的观察及大小测定一、实验目的：1、观察几种细胞的形态结构2、掌屋用测微尺测定细胞大小的原理和方法二、实验原理：测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两者配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃园片，园片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm(10m)。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来标定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= 10m 目微尺格数 例如：目微尺是100格，其对应的物微尺是80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/10010=8m。测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5格，则此细胞横径为85=40m。三、实验用品：普通光学显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 消毒牙签 烧杯 吸管 0.9%生理盐水蒸馏水 吸水纸。四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞；洋葱内表皮；葫芦藓叶片；保存于阿氏液中的鸡血；甜椒五、方法步骤：（一）、细胞形态结构的观察：1、人口腔上皮细胞的观察：1）、在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。2）、用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。3）、把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下。4）、用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。 5）、用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状。2、取洋葱内表皮，同上法制作临时装片（将生理盐水换成蒸馏水），用显微镜观察，可见长条状的洋葱内表皮细胞3、取葫芦藓叶片，制作临时装片（制作方法同洋葱内表皮），用显微镜观察，可见内含许多叶绿体的叶细胞，细胞呈什么形状？4、制作鸡血涂片，用显微镜观察红细胞5、取甜椒一片，用刀片刮去果肉，将表皮制成临时装片，用显微镜观察表皮细胞，能看见胞间连丝吗？（二）、细胞大小的测定：1、将目微尺放于目镜内2、将物微尺放在显微镜的载物台上3、小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处4、记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= 10m 目微尺格数 5、将制作的各种细胞临时装片置于载物台上，测定细胞的大小（包括长径和短径）。六、注意事项：1、制作临时装片时避免产生气泡2、用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况，这一数值会随物镜的放大率而改变，因此，在什么放大倍数物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测定细胞的大小。七、作业：1、绘出你所观察到的洋葱表皮细胞和葫芦藓叶细胞图，指出各部分的名称。2、列表说明你所测出的几种细胞的大小。实验二 微分干涉差显微镜的使用用微分干涉差显微镜观察口腔上皮细胞一、实验目的：1.了解微分干涉差显微镜观察活细胞的原理2.了解微分干涉差显微镜的特殊组件和位置3.掌握微分干涉差显微镜的基本操作步骤二、实验原理：微分干涉差显微镜是根据通过物体内只分开1um或者更短距离的2束相干的光之间的相位差设计的，使标本内邻近2点的光程差被显微镜中特殊的光学系统转变为振幅（光强度）的变化。从而可以观察到标本内细微的结构，所以称为微分干涉差显微镜。根据照明方式，微分干涉差显微镜分为落射式和透视式2种，生物学和医学观察中多采用透射式微分干涉差显微镜。微分干涉差显微镜包含2块正交的偏光镜：一块靠近光源，称为起偏镜：另一块靠近目镜，称为检偏镜。在起偏镜和聚光镜之间放置第一块渥氏棱镜，在物镜和检偏镜之间放置第二块渥氏棱镜，这就是微分干涉差显微镜的基本结构。其基本原理是：来自光源的自然光经过起偏镜后成为线偏振光，以45度方位角（入射光偏振方向与晶体光轴之间的夹角）垂直入射到第一块渥氏棱镜，这时入射偏光分解为振动方向互相垂直、传播方向一致的O光和E光，穿过第一块渥氏棱镜的中心点后，由于晶体光轴方向的改变，O光和E光从中心点散发开一个很小的角度，经过聚光镜后产生出间隔只有1um甚至更短些的平行光，穿过样品的2个点。由于光线通过标本的2个点的光程长度不同，2束光线的相位都发生了变化，带有标本2个邻近点的相位差信息的这2束线偏振光通过物镜后，会聚在第2块渥氏棱镜的中心点，组合在一起的这2束线偏振光相位差不同，偏振方向互相垂直，不能直接干涉成像。当它们通过检偏镜后成为振动面相同、频率相同且具有一定相位差的相干光束，因而在中间像平面上形成干涉的物像。三、实验用品：微分干涉差显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 消毒牙签 烧杯 吸管 0.9%生理盐水 吸水纸。四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：（一）、制作人的口腔上皮细胞的临时装片1.在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。2.用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下。3.把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下。4.用镊子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地盖在水滴上。（二）、用微分干涉差显微镜观察人的口腔上皮细胞1.将10微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即N1。调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞的结构。2.将40微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即N 2。调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞结构。六、注意事项：1.选取的载玻片的厚度在1mm左右，不要太厚；要清洗干净。2.样品制备时，防止产生气泡。七、作业:1.根据所观察到的细胞，画一个口腔上皮细胞图，并且注出各部分的名称.实验三、口腔上皮细胞的荧光观察一、实验目的：1、初步了解荧光显微镜的基本组件、位置和基本光路。2、初步掌握荧光显微镜的基本调节步骤。3、通过在荧光显微镜下观察口腔上皮细胞的细胞核和线粒体，了解荧光探针与细胞成分的结合特性和光谱特性。二、实验原理：本实验用的2种活细胞荧光探针分别为Hoechst 33342（Ho.33342）和罗丹明123（Rho-damine 123）。Hoechst 33342（Ho.33342）是双苯并咪唑类的一种衍生物,是一种亲脂性物质,能跨膜进入活细胞,在低浓度下毒性较弱.是一种能与DNA特异性结合的荧光探针,该探针的特点是既能与死细胞又能与活细胞的DNA特异性结合,因此被大量地应用于活细胞观察与定量的科学研究工作中。它的激发光波长约350nm，发射光波长约461nm。罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光探针，也能穿过活细胞的膜。实验证实，罗丹明123被线粒体吸收与电性吸引有关。线粒体内膜本身因富含负电性的糖蛋白而带负电荷，内膜外有大量质子积累造成外正内负的跨膜电位差。而罗丹明123具有正电荷，由于电性相吸，特异地标记上线粒体。它的激发光波长约507nm，发射光波长约为529nm。可用蓝光激发，被标记的线粒体发出绿色荧光。三、实验用品：1、 药品：含5-10ug/ml Ho.33342的PBS(pH74)；含10ug/ml 罗丹明 123的PBS(pH74)2、 仪器和用具:荧光显微镜、温箱、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、镊子、滴管等四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：1、 用牙签刮取口腔上皮黏膜细胞，分别涂于2张载玻片上。2、 在2张载玻片的涂细胞处分别滴加Ho33342染液和罗丹明染液各一滴，在37暗处孵育20-30min。3、 加盖玻片（注意防止气泡），用滤纸条吸掉盖玻片周围多余的水分。4、 荧光观察细胞核：先关闭激发光，将滴加Ho33342染液的装片至于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为紫外光（UV）、发射兰色荧光的滤片组合块下观察细胞核。先用10荧光物镜观察，再换用40荧光物镜观察。5、 荧光观察线粒体：先关闭紫外激发光，将滴加罗丹明123的载玻片置于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为兰光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。先用10荧光物镜观察，再换用40荧光物镜观察。六、注意事项：1.盖片时防止产生气泡2.滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察3.注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存4.荧光探针都有一定的毒性，操作时防止污染皮肤和环境七、作业：根据观察实验结果，填表细胞核线粒体荧光探针激发光发射光形态（画出）实验四、叶绿体的提取一、实验目的：通过本实验掌握分离叶绿体的技术，并了解制备细胞器的一般程序。二、实验原理：细胞器的分离一般采用差速离心法，细胞经过破碎后，在适当的介质中进行差速离心，利用细胞各组分质量大小不同，在不同离心力的作用下，即可得到所需的组分。三、实验用品：1、介质的配制：A：配制0.5M的蔗糖水溶液B：磷酸钾缓冲液:将KH2PO4(分析纯)溶于A液中,使其浓度为0.1M,PH调至7.4C：完全介质:将EDTA-Na2溶于B液中,使其浓度为10mM,PH调至7.42 、低速大容量离心机3、研钵一付4、尼龙织物或纱布5、台秤；塑料杯2个（平衡时用）6、玻璃漏斗7、烧杯(200ml)2个；滴管1支；50ml量筒1个8、显微镜；擦镜纸9、盖玻片和载玻片10、吸水纸四.实验材料: 菠菜叶或玉米叶五.方法步骤:1、将材料洗净吸干后,称取鲜重10g,剪成1-2cm2小块.2、加入20ml完全介质,在研钵中充分研碎（介质可分步加入）3、用双层尼龙织物或双层纱布过滤4、汁液在1000rpm下离心5分钟,弃去沉淀5、上清在2000rpm下离心12分钟6、将沉淀悬浮于15mlA液中,再以2000rpm离心12分钟,所得沉淀即为纯化的叶绿体7、将沉淀悬浮于约3mlA液中。8、制片，在高倍镜下观察9、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光（兰光作激发光，叶绿体发出火红色荧光）。六、注意事项：1、离心前要先平衡2、研磨时可先加部分介质，待研磨成匀浆后再加入剩余介质，介质过多不便研磨六、作业:绘制所观察到的叶绿体实验五、植物材料中DNA的提取一、实验目的: 通过本实验了解用氯仿-异戊醇提取DNA的方法及原理二、实验原理：细胞经过破碎后，加入适当介质配合离心以脱除各种杂质，再用乙醇沉淀，DNA便以纤维状沉淀析出。三、实验用品:1、药品：1）研磨缓冲液含0.45M NaCl, 0.045M柠檬酸三钠,0.1M EDTA, 1%SDS(十二烷基硫酸钠)PH7.02）5M高氯酸钠溶液3）氯仿4）异戊醇5）95%预冷乙醇6）0.1xSSC溶液(0.015M氯化钠,0.0015M柠檬酸三钠,PH7.0)7）10xSSC溶液(1.5M氯化钠,0.15M柠檬酸三钠,PH7.0)8）RNA酶溶液:RNA酶在0.15M绿化钠溶液(PH5.0)中溶解,并在80oC水浴中保温10分钟,以灭活可能染的DNA酶.然后冷却,在低温下保存备用.2、用具：1）磨口三角瓶2）离心机3）细口吸管、烧杯、量筒等4）恒温水浴锅5）研钵四、实验材料: 韭菜、玉米幼苗或豌豆幼苗 五、方法步骤:1、将材料洗净吸干,称取20g,剪碎后放入研钵,加入30ml研磨缓冲液,然后剧烈研磨,使之成为浆状物2、将浆状物倒人磨口三角瓶内,加等体积的氯仿-异戊醇(24:1v/v)混合液,加上瓶塞,剧烈摇晃30秒钟,以脱除组织蛋白质3、在室温下离心(4000rpm)5分钟,这时混合物会形成三层,用细口吸管小心地吸取上层含有核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿4、将收集的水溶液倒入一个在70oC水浴中预热的三角瓶中,并在70oC下继续保温3-4分钟(不要超过4分钟),以灭活组织内DNA酶,然后讯速取出三角瓶,放在冰水浴中冷却到室温5、加入5M高氯酸钠溶液（4：1v/v），使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1M6、再次加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1v/v）混合液，并在带塞的三角瓶内摇晃30秒钟。7、将此乳浊液在室温下离心（4000rpm）5分钟后，收集上层含核酸的水溶液。8、将收集的水溶液置于烧杯内，然后用滴管慢慢地加入二倍体积的95%预冷过的乙醇于水溶液表面上，用玻璃棒轻轻搅动，此时核酸将讯速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。9、 将核酸沉淀物在烧杯壁上轻轻挤压以除去乙醇，然后溶解在适量的01SSC溶液中。待完全溶解后，加入此溶液十分之一体积的10SSC溶液，使之最终成为1SSC溶液。10、按照（8）的步骤，再次用乙醇沉淀核酸，并按照（9）的步骤将核酸溶解，即得DNA粗制品。11、加入RNA酶溶液使其最后作用的浓度为50-75ug/ml，并在37保温30分钟，以除去RNA。12、加入等体积的氯仿-异戊醇溶液（24：1v/v），在三角瓶内摇晃30秒，再次除去残留蛋白质及所加的RNA酶。然后，按照（7）的方法离心并收集上层水溶液。13、 按照（8）再次沉淀DNA，并按照（9）的步骤将其溶解，即可得到纯化的DNA溶液。六、注意事项： 1、水浴保温时，三角瓶不要加盖，否则加热过程中可能将瓶盖冲出2、用玻棒搅动时宜慢不宜快，否则DNA会断裂七、作业：1、实验中加入氯仿-异戊醇起什么作用？2、实验中加入高氯酸钠溶液又起什么作用？实验六、细胞膜的渗透性 一、 实验目的：了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、 实验原理：红细胞放置在数种等渗溶液中，根据红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可进入，有的溶质不能进入，进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入红细胞，引起溶血。由于溶质透人速度不同，溶血时间也不同。三、 实验用品：1、 器材：50ml烧杯、滴管、试管、试管架2、 试剂：017mol/L氯化钠 017mol/L氯化铵017mol/L醋酸铵 017mol/L硝酸钠012mol/L草酸铵 012mol/L硫酸钠032mol/L葡萄糖 032mol/L甘油032mol/L乙醇 09%生理盐水阿氏液：葡萄糖202g，氯化钠042g，柠檬酸钠080g，柠檬酸0055g，蒸馏水加到100ml，灭菌，0-4保存两周四、实验材料： 鸡血五、方法步骤：1、 鸡红细胞的制备：2、 制备流程如下：鸡血（一份鸡血加两份阿氏液）混匀，离心（2000rpm）10 弃上清 取沉淀 加09%生理盐水， 离心（2000rpm）10，重复2-3次弃上清 取沉淀，制成 3%鸡红细胞备用（用生理盐水稀释）3、 溶血现象的观察：取试管一支，加入5ml蒸馏水，再加入0.5ml制备好的鸡血，注意观察 溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清。红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。4、 红细胞的渗透性（1）取试管一支，加入017mol/L氯化钠溶液5ml，再加入0.5ml制备的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？是否有溶血现象？为什么？（2）分别在下列几种等渗溶液中进行实验，步骤同（1）017mol/L氯化铵 017mol/L醋酸铵 017mol/L硝酸钠 012mol/L草酸铵 012mol/L硫酸钠 032mol/L葡萄糖 032mol/L甘油 032mol/L乙醇 六、注意事项：1.鸡红细胞的稀释要用0.9%生理盐水，加入的生理盐水体积与第一步取的鸡血的体积相等。2.离心机使用时，要将配平后的离心管对称放置在离心机内，禁止未配平就放入离心机和非对称放置离心管。七、作业：1、溶液的渗透压主要与哪些因素有关?对简单盐溶液如何粗略计算出其渗透压? 2、记录观察到的现象，并进行分析和比较。（列表，按溶血快慢排列）编号溶液种类是否溶血溶血所需时间结果分析12345678910实验七、光镜下植物细胞骨架 的制片技术及观察一、实验目的：初步掌握在光镜下植物细胞骨架标本的制作方法。二、实验原理：用适当浓度的Tritonx-100处理植物细胞时，可将细胞内的蛋白质破坏，但却可以保留细胞骨架系统的蛋白质。后者用考马斯亮蓝染色，在光镜下可观察到细胞骨架的网状结构。三、实验用品：（一）药品1、 M缓冲液：50mM咪唑，05mM氯化镁，1mM EGTA乙二醇双（a-氨基乙苯）醚四乙酸，01mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mM DTT（二硫苏糖醇）2、 6mM PH65磷酸缓冲液（内含5mM KCl）3、 1%Tritonx-100（用1液配制）4、 3%戊二醛5、 02%考马斯亮兰R250，用少许无水酒精溶解，然后用125%三氯醋酸定溶，装入滴瓶备用。（二）用具：50ml烧杯、剪刀、镊子、手术刀、玻璃滴管、称量瓶（或青霉素小瓶）、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸（或卫生纸）、温箱等。四、实验材料：新鲜、幼嫩的洋葱鳞茎内表皮五、方法步骤：1、用镊子撕取洋葱鳞茎的内表皮（取材时注意不要用靠近边缘的内表皮），剪成05-1cm大小，放入10ml，6mM，PH65的磷酸缓冲液中。2、将材料取出，用1%Tritonx-100处理05-1小时，（28oC温箱），然后用M缓冲液洗3-5次，每次5分钟。3、用3%戊二醛固定一小时（28oC温箱）。4、用6mM，PH65的磷酸缓冲液洗3-5次，每次10分钟。5、用02%考马斯亮兰R250染色15min-0.5h（在载玻片上进行）。6、材料染色后用蒸馏水冲洗。7、制片，在高倍镜或油镜下观察，可见到与核联系的细胞骨架及靠近细胞壁的网状结构。六、注意事项：1、 用Tritonx-100处理时，材料应浸泡入溶液2、 染色时注意勿稀释药液七、作业：绘制洋葱鳞茎内表皮细胞的细胞骨架图。实验八、线粒体和液泡系的超活染色与观察一、 实验目的：1、 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。2、 学习一些细胞器的超活染色技术。二、 实验原理： 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。三、 实验用品：1、 器材：显微镜、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、10ml量筒、吸管、牙签、吸水纸（或卫生纸）等。2、 试剂：1） Ringer溶液（装入滴瓶）氯化钠 085g（变温动物用065g）氯化钾 025g氯化钙 003g蒸馏水 100ml2） 1%、1/3000中性红溶液（装入棕色滴瓶）称取05g中性红溶于50mlRinger液，稍加热（30-40）使之很快溶解，用滤纸过滤，装于棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。3） 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液（装入棕色滴瓶） 称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中，稍加热（30-40），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。四、 实验材料：1、人口腔上皮细胞2、洋葱鳞茎内表皮细胞3、小麦或黄豆幼根根尖五、 方法步骤：（一）、线粒体的超活染色与观察：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。1、 人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色观察1）、取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴两滴1/5000詹纳斯绿B染液。2）、实验者用牙签宽头在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放入载玻片的染液滴中，染色1015分钟（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。3）、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。2、 洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察1） 用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色1015分钟。2） 用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。3） 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。（二）、液泡系的超活染色与观察中性红为弱减性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。1、 小麦或黄豆根尖细胞液泡系的中性红染色与观察1） 实验前，将小麦或黄豆种子培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根伸长到1cm以上。2） 取初生的小麦或黄豆幼苗根尖（约12cm长）,置于载波片上,滴一滴Ringer液，用镊子或刀片小心将根尖压成一薄片，吸去Ringer液，在材料上滴一滴1/3000中性红染液，染色510分钟。3） 吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。4） 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。2、洋葱表皮细胞液泡系的活体染色与观察：1） 撕取洋葱鳞茎内表皮2） 置于加有一滴1/3000的中性红染液的载玻片中，染色510分钟3） 用吸水纸吸去染液，换上Ringer液，盖上盖玻片4） 显微镜下观察，可见被染成砖红色的中央大液泡 六、注意事项： 1、在对口腔上皮细胞进行染色时不可使染液干燥，可适当补加染液。2、在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。七、作业：1、 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布2、 绘小麦或黄豆根尖细胞示液泡系形态与分布实验九、DNA的细胞化学反应Feulgen反应一、实验目的：通过根尖压片法，掌握Feulgen反应显示DNA的基本原理和主要操作环节二、实验原理：Feulgen反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck开创的。这一反应的原理是：DNA在一定的温度（60）下，被酸水解，打开嘌呤碱与脱氧核糖连接的键。在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，醛基与Schiff试剂（脱色碱性品红）结合，形成紫红色化合物。所以，凡有DNA的部位，会呈现紫红色阳性反应，可以作为定性研究DNA的一种简便方法。三、实验用品：（一）、药品：1、Schiff试剂：称1g碱性品红，溶于200ml已煮沸的蒸馏水中（要漫漫加入，不可一下全部倒入），继续煮沸5分钟（搅动），然后使其冷却至50，过滤于棕色磨口瓶中，加入20ml1N HCl（取比重为119的HCl 325ml，加蒸馏水至1000ml即成），继续冷却至25时加入1g偏亚硫酸钾（KHSO3）或偏亚硫酸钠（NaHSO3），将瓶塞盖严，置于暗处24小时，溶液应为无色，可保持在1-4冰箱中备用。如果红色不退可加入2g活性炭粉末，搅动数分钟后静置数小时，再过滤即可脱去红色。2、1N HCl：取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。3、45%醋酸4、亚硫酸水溶液：在200ml自来水中，加入10ml 10%的偏亚硫酸钠（或偏亚硫酸钾）溶液，或加入10ml 30%的偏重亚硫酸钠溶液，再加入1N HCl 10ml即成，盖紧瓶塞。此液要现配现用。5、Carnoy固定液：95%酒精3份，冰醋酸1份混合即可。6、50%酒精、30%酒精。7、5%三氯醋酸（二）、用具：显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、青霉素小瓶、吸水纸等四、实验材料：大蒜、洋葱或蚕豆根尖五、方法步骤：1、取05-1cm的根尖，在carnoy固定液中固定2-24小时。固定时以冰箱中进行为宜。2、取出固定材料，用50%酒精、30%酒精、蒸馏水各冲洗5分钟，以除掉材料上的醋酸。准备两张切片，其中一张作对照。3、水解：用1N的冷HCl过洗材料一次，然后放入温度稳定在60的1N HCl中，水解10-14分钟，取出材料后再用1N冷HCl过一次。4、染色：将水解后的材料放入Schiff试剂中染色1小时左右，此时根尖部分会出现紫红色。5、用亚硫酸水漂洗三次，每次5分钟，使细胞质的紫红色退掉，再流水冲洗515分钟，洗后的材料放入蒸馏水中。8、用45%的醋酸压片。9、镜检。与对照装片比较。10、对照切片的制做：进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片可用下面两种方法制作：不经水解直接放入schiff试剂内染色。 材料固定后用5%三氯醋酸于90处理15min，用蒸馏水冲洗，以后步骤同实验组。六、注意事项：1、Feulgen反应的染色深浅与材料、水解时的温度和时间都有关系。水解时间的长短要根据固定液和材料来进行选择，时间太短则游离的醛基量少而染色不深，时间太长会因醛基进一步变成其它物质，染色也不深。水解时的温度要严格控制。2、未经水解的对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。 3、Schiff试剂的作用 ：Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。七、作业：1、绘图表示Feulgen反应的染色结果, 并验交Feulgen反应的压片1张。 2、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。3、Feulgen反应的实验原理是什么？ 4、在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水洗片？实验十、RNA的细胞化学反应Unna反应一、实验目的：掌握显示细胞内RNA和DNA的主要细胞化学方法以及了解RNA和DNA在细胞内的一般分布状况。二、实验原理： 1989年Pappenheim首创了甲基绿-派洛宁染色法。1902年Unna对这一方法进行了改良。1940年Brachet研究证明甲基绿和派洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果。这是一种利用碱性染料显示细胞内RNA的标准方法之一。其原理是：利用DNA和RNA对碱性染料的亲合力有差异，而进行选择性染色，即RNA被Unna试剂中的派洛宁染成红色，DNA被Unna试剂中的甲基绿染成绿色。三、实验用品：（一）、药品：1、 Unna试剂：甲液：5%的派洛宁水溶液2ml；2%的甲基绿水溶液6ml；蒸馏水16ml乙液：1M PH48的醋酸盐缓冲液。配制方法为：A液：6ml冰醋酸+100ml蒸馏水B液：135g醋酸钠+100ml蒸馏水取A液40ml加B液60ml即为乙液。乙液以现配为好。 甲液和乙液分别保存在4冰箱中备用。用时甲、乙两液混匀即成Unna试剂。2、丙酮3、正丁醇4、二甲苯5、加拿大树胶6、明胶粘片剂：明胶1g，蒸馏水100ml，苯酚2g，甘油15ml。配法：将蒸馏水加热至36，再依次加入明胶、苯酚、甘油（可在36水浴锅中进行，明胶在36溶解度最大），待充分溶解后，过滤，贮存于有玻璃塞的瓶中备用。注意配好后不要放在冰箱中。7、70%酒精、95%酒精、无水酒精。8、Carnoy固定液（配法同实验九）9、5%三氯醋酸（二）、用具：显微镜、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、酒精灯、滤纸、染色缸（8个/组）、吸水纸等四、实验材料：洋葱表皮五、方法步骤：1、在干净的载玻片上涂以一极薄的明胶粘片剂，滴一滴蒸馏水，用镊子撕下小片洋葱表皮置于蒸馏水之上，使之展开。2、片子置于酒精灯火焰上烘烤，待蒸馏水蒸发后，洋葱表皮即粘在载玻片上。3、立即将片子放入carnoy固定液中固定15分钟。4、取出固定材料，用无水酒精将片子上的醋酸冲洗干净，然后将片子经95%、70%酒精（各5分钟），然后移入蒸馏水中。将装片分为实验组和对照组。5、对照组用5%三氯醋酸于90处理15min，用蒸馏水冲洗5min。6、将实验组和对照组装片均浸入Unna试剂中染色30分钟。7、用蒸馏水冲洗数秒钟，以洗去多余的染液，但冲洗时间不宜过长，否则派洛宁会被洗掉，然后用吸水纸将片子上的水分吸干。8、片子浸入纯丙酮中分色3-20秒。9、蒸馏水洗片刻，镜检10、将制作较好的装片移入正丁醇和二甲苯混合液（1：1）中10-30秒。11、在纯二甲苯中透明5-15分钟12、用加拿大树胶封片，即成永久装片。13、镜检。实验步骤简示如下：六、注意事项：商品甲基绿常混有甲基紫，会影响染色效果，应该用氯仿将甲基绿中的甲基紫成分洗脱干净。方法是将市售甲基绿泡入氯仿中，用力振摇，静置后过滤，反复多次直到氯仿中无甲基紫色出现为止。洗去甲基紫后干燥备用。七、作业1、用彩色笔绘出反应结果的细胞图，并注明不同颜色的部位表示有什么物质存在2、验交永久装片一张实验十一、小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察一、实验目的：通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义。二、实验原理巨噬细胞起源于骨髓，经血液进入组织中而成，分布于全身各处。当机体受到某些损伤因素时（如微生物或其它病原体或异物侵入），能招引巨噬细胞，同时巨噬细胞有趋化性，主动向病原体或异物游走，在接触到病原体或异物时，细胞膜凹陷伸出伪足包围异物，并发生胞吞作用形成吞噬泡，继而细胞质中的溶酶体与吞噬泡融合，消化分解异物。含台盼蓝的淀粉肉汤，可使腹腔中有较多的吞噬细胞，以供观察吞噬活动。三、实验用品1、材料：小白鼠、1%鸡红细胞悬液、10%羊红细胞悬液。2、试剂：6%的淀粉肉汤（含台盼蓝），0.9%生理盐水。3、仪器设备：显微镜、注射器、注射针头、吸管、试管架、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片、记号笔。四、实验材料：1、小白鼠2、1%鸡红细胞悬液五、方法步骤取一只注射过淀粉肉汤的小白鼠，腹腔注射1%鸡红细胞悬液1ml，25分钟30分钟后再向腹腔注射0.9%生理盐水1ml，并用手轻揉小鼠腹部，有利于悬液分散。3分钟后，用颈椎脱臼方法处死小鼠（一手捏着鼠头、颈连接处，一手捏住鼠尾，分别向两端用力牵拉，直到拉死为止），迅速剖开腹腔，用不带针头的注射器贴腹腔背壁处直接抽取腹腔液，滴片，制备一张临时装片，盖上盖玻片。放置2分钟3分钟后在显微镜下观察。在高倍镜下，可见到圆形或形状不规则的巨噬细胞，其胞质中含有数量不等的蓝色颗粒（为吞入的含台盼蓝的淀粉肉汤形成的吞噬泡），还可见少量淡黄色椭圆形有核的鸡红细胞。慢慢移动玻片标本，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程：有的鸡红细胞（一个至多个）紧贴于巨噬细胞表面；有的巨噬细胞已将一至数个鸡红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入了一个或几个红细胞，形成了椭圆形吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬泡已与溶酶体融合正在被消化，体积缩小呈圆形。将所见到的处在不同吞噬阶段的巨噬细胞动态地联系起来，想一想吞噬作用的全过程。六、注意事项：剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避免剪破腹腔血管，腹腔液应是无色的液体。七、作业：将所见到的处在不同吞噬阶段的巨噬细胞动态地联系起来，说一说吞噬作用的全过程。实验十二、联会复合体的染色与观察 一、实验目的： 学习光学显微镜显示联会复合体技术，观察光镜下联会复合体的形态结构二、实验原理：1977年Moses证明使用光镜可以检查联会复合体，其后发展了许多用于明视野显微镜观察的方法，依靠光镜显示联会复合体，不仅对SC 的构造、功能的研究有用，而且在临床细胞遗传学中对研究染色体异常现象也是有用的，它大大加快了SC的研究特别是X、Y染色体配对行为的研究，并导致了X染色体上一种特殊夹状结构的发现。联会复合体是指在减数分裂前期，同源染色体的配对行为所形成的一种特殊结构，由侧线、横线和中央轴三部分组成，在前期的粗线期时结构较典型，它是动植物同源染色体联会时相当普遍的一种结构。三、实验用品：1、器材：离心机、显微镜、水浴（65）、培养皿（直径16cm）、镊子、剪刀、吸管、烧杯、量筒、离心管（10ml）、酒精灯、刻度吸管、镜油、擦镜纸、载玻片、台秤。2、试剂： 0.7%柠檬酸钠溶液。 3%中性福尔马林溶液；8.3ml福尔马林溶液，醋酸钠1.1克，加蒸镏水91.7ml。 50%硝酸银溶液 2.0%明胶；称取2克明胶粉末，溶解于99ml蒸镏水中，加1ml甲酸。 甲醇、冰醋酸四、实验材料：小白鼠（雄）五、方法步骤：1脱颈处死动物，取出睾丸，放入盛有1ml 0.7%柠檬酸钠培养器中。2分离并剪碎精小管，用吸管轻轻吹打，使精小管内容物释放出。3移至刻度离心管中，加4ml0.7%柠檬酸钠溶液制成细胞悬浮液，室温下低渗45-60分钟。4在低渗终止前10分钟，加3%中性福尔马林液0.15ml，最终浓度0.1%，混匀。5常规离心（1000rpm，10分钟），弃去上清液。6加入甲醇和冰醋酸（3：1）混合液（临用时配制）5ml，固定10min。7以1000rpm离心5min，弃去上清液。8重复6-7步一次。9加入1ml新鲜固定液，混匀。10.取细胞悬浮液，滴2-3滴于湿冷的载玻片上，置酒精灯上略加烘烤（或将载玻片置于热至80的电热板上）。11.银染：加4滴50%AgNO3和2滴明胶液于载玻片细胞面上，混匀，覆以擦镜纸，置酒精灯上烘烤（或将载玻片置于热至80的电热板上），至玻片标本呈褐黑色为止。一般为3-4min。12.移去擦镜纸，以蒸馏水快速漂洗，晾干。13.镜检。六：注意事项：制片的关键是长时间的低渗液处理和添加福尔马林溶液七、作业绘图表示光镜下联会复合体的形态。实验十三、去壁低渗法制备植物染色体标本一、实验目的：1、掌屋植物染色体标本的去壁低渗方法2、了解中期染色体的形态结构二、实验原理：植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。陈瑞阳等（1979，1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗法，并在多种植物上得到广泛应用，成为当前植物染色体研究中的重要方法。三、实验用品：（一）器材：显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青霉素小瓶（二）药品：1、0