英文名称及细胞培养.doc

1. 异甘草素 isoliquiritigenin; 2,4,4-trihydroxychalcone 分子式C15H12O4 分子量： 2562. 羟基红花黄色素A Hydroxysafflor yellow A 化学分子式：C27H32O16 分子量：612.533. 红花黄色素A safflor yellow A 4. 丹酚酸B Salvianolic Acid B 分子式：C36H30O16 分子量：718.6145. 丹参素钠 Sodium Danshensu 分子式： C9H9O5Na 分子量： 220.166. 20(S)-原人参二醇 20(S)-Protopanaxadiol 7. 千金藤素 Cepharanthine 分子式：C37H38N2O6 分子量：606.728. 人参皂苷Rb3 Ginsenoside-Rb3 分子式: C53H90O22 分子量: 1079.279. 20(S)-人参二醇 20(S)-panaxadiol10. 20(S)-人参三醇 20(S)-panaxatriol11. 人参皂苷MC ginsenoside-MC12. 人参皂苷CK ginsenoside-CK1. 如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基 293 成纤维细胞 人胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清 3T6 成纤维细胞 小鼠胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清 A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清 AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy5A, 10% 胎牛血清 BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清 CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清 Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10% 胎牛血清 Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM, 10% 胎牛血清 CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清 D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清 HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清 HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 HeLa 上皮细胞 人子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM) HEp-2 上皮细胞 人喉癌 MEM, 10% 胎牛血清 HL-60 成淋巴细胞 人早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清 HT-1080 上皮细胞 人纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA HT-29 上皮细胞 人结肠腺癌 McCoys 5A, 10% 胎牛血清 HUVEC 内皮细胞 人脐带 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml I-10 上皮细胞 小鼠睾丸癌 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清 Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoys 5A, 5% 胎牛血清 Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清 KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清 L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清 L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM, 10% 胎牛血清 LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 马血清 McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清 MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素 WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清 WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清 WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清 WS1 人 胚胎皮肤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 2.为什么要热灭活血清？ 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3.L谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的氨基用L丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L谷氨酰胺几乎完全降解。 5.为什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 6.如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 7.如何消除组织培养的污染？当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6 重复步骤4。7 在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。 8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？ GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免反复冻融。 10.目录上说，Hanks 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液（HBS）和Earles平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别? Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测 激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测 12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 13.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？ 是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100l OPTI-MEM中，稀释DNA在100l OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800l）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。 14.我使用SF900 时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？ 如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1），让血清给蛋白酶提供作用底物。 5.如何检测内毒素(热源)水平？ LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。） 16.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？ 如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。 17.20下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？ 对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10时，PH值的变化情况例如 20下配制PH7.4 Tris缓冲液,40时PH值为 7.4-（2x0.310）6.78缓冲系统 pKa/20 DeltapKa/10 Mes 6.15 -0.110 Ada 6.60 -0.110 Pipes 6.80 -0.085 Aces 6.90 -0.200 Bes 7.15 -0.160 Mops 7.20 -0.013 Tes 7.50 -0.200 Hepes 7.55 -0.140 Tricine 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Bicine 8.35 -0.180 Glycylglycine 8.40 -0.280 18.室温下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？ 缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同的PH值。4 25 37 8.1 7.5 7.2 8.2 7.6 7.3 8.3 7.7 7.4 8.4 7.8 7.5 8.5 7.9 7.6 8.6 8.0 7.7 8.7 8.1 7.8 8.8 8.2 7.9 8.9 8.3 8.0 9.0 8.4 8.1 9.1 8.5 8.2 9.2 8.6 8.3 9.3 8.7 8.4 9.4 8.8 8.5 19.昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？ 生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.06.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。 20.High Five细胞有任何其它名称吗？ High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别？ PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。 22.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 23.High Five细胞用多大的密度冻存？ 3.0x10E6 cells/ml 24.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？ 可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 25.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1. 去除培养基。2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4. 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 26.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 27.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？ 使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。28.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ 通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 -现在只能查到这些，先给您发过去，我再查查，查到后发过去！你好！我买的是HMEM/F-12粉，在配置培养基时说明上让加入2克多的NAHCO3，培养基本身不含有HEPES,我是否可以加入一些？如果可以量是多少？与NAHCO3有没有冲突？（有的书上写着如果培养基中含有HEPES,则NAHCO3不能超过一定量，是不是这样呢）。可以根据PH值加入HEPES，因为它本身就是起稳定PH值的 作用。而NAHCO3 也起缓冲PH值的作用。所以无论怎样规定，都是为了培养液的PH稳定。没有什么硬性冲突或规定。当然要按照说明书操作，而不是某某细胞冻存的步骤一般是这样的：1，细胞用胰酶消化，注意消化的程度，消化过头或者消化不够都不利于细胞保存2，吹打后用1500转离心3-5分钟3，弃去上清液，加冻存液，一般冻存管是1.5ML的，所以估计一下你要装几支，加相应的冻存液，吹打4，分装到冻存管内，注意不要加满，因为液体变固体后会膨胀5，-4度保存半小时，-20度保存2小时，-80度过夜，然后放入液氮罐就可以拉流式细胞技术在细胞定量检测方面是最先进检测技术,流式细胞仪在临床和科研领域得到广泛运用。关键词流式细胞技术细胞检测概述:分析细胞学是细胞定量分析的学科,流式细胞技术(,)是分析细胞中的一个重要领域,该技术为细胞学研究手段之一,能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个染色体的分析,而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式)测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较,具有速度快,精度高,准确性好的特点,可以说是目前最先进的细胞定量分析技术。该仪器在医学和基础生命科学中得到广泛应用。也就是说流式细胞术已应用于免疫学,生物学等临床医学和基础医学研究领域。下面做一简单介绍。细胞凋亡是当前研究的热点之一,检测凋亡有多种方法,的优点是1)能快速客观高灵敏度地进行多参数地测定样本细胞中的生物学变化。(2)定量测定凋亡指数,可同时测定凋亡细胞与细胞周围的关系。(3)同时测定细胞增殖率与死亡率,从而可了解肿瘤的增长速度。(4)测定单细胞为基础的凋亡相关基因蛋白的变化以探讨凋亡分子机制与细胞周期的关系。(5)从治疗过程中肿瘤细胞死亡速率可早期了解药物的疗效。随着凋亡检测方法的敏感性和特异性不断的提高,有望做到更客观地反映凋亡这一复杂的现象。血液学研究的主要内容是血液和骨髓,而这两者均为天然的单细胞悬液,并且易于反复采集,这正符合的标本要求。细胞流式术在这里起的作用是1)对细胞内部参量的检测,利用细胞对光的散射,可获得有关细胞大小(与前向角散射有关)和粒度的信息(与侧向角散射有关)。(2)细胞外部参量的检测。待测细胞经荧光染成标记后,主要检测:含量,含量,总蛋白含量,细胞原构成,酶活性及定位小细胞钙离子,细胞内细胞膜定位,细胞膜流动性或微粘度等。(3)细胞分选内部参量或外部参量的不同。可将某一特定亚群从细胞总体分选出来,以待做进一步的研究,这一功能在克隆方面有重要的意义。细胞抗原表型分析,这是在血液病学中应用最广泛的领域。流式细胞术在该领域里显示出其快速大量检测细胞和多色标记的优点,使免疫表型分析更加快速、客观、准确。用技术分析和分选标本染色体是分子生物学,遗传学研究的一个非常有效的方法。采用双激光的方法,研究者可进行核型分析和鉴定,分离纯化某号染色体并构建染色体特异性文库。后者在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥重要作用。其实流式细胞术在生物学中的发展,主要得益于克隆抗体技术的发展,这两者的发展是相辅相成的。流式细胞仪主要部件及其作用:光源:光源有相干光源和非相干光源。非相干光源一般来自灯和汞灯。此类弧光灯的发光是电流经过气体时,造成气体电离所产生的。它能提供最佳的激发波长。选择汞灯和灯的原则是能提供最大的荧光激光能量。但弧光灯在单一谱线上能量较弱且功率不稳,己逐步被激光光源代替。相干光源常用+激光,及染料激光,其中氩离子激光器在紫外范围也可激发染料,适合分析和使用特殊荧光染料情况。因此成为流式细胞仪中使用最广泛的激光源。它在488时呈兰色激光。此光源能提供极高的照射光强,稳定性高,发射散角小,能聚焦到细胞大小的线度范围内。常用的还有激光器(633),用于光散色的测量。由于染料激光器的波长能连续调6 13, 5细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度196，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cytogenetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。（二）悬浮型；见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。三、培养细胞的生长和增殖过程体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传3050代，相当于150300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。对此以后将详述。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：1原代培养（Primary Culture）期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系（Established Cell Line），现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。（二）组织培养细胞一代生存期所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：1潜伏期（Latent Phase）：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2指数增生期（Logarithmic growth Phase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。3停滞期（Stagnate Phase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。 建立细胞系或细胞株 各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。一、体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。（五）遗传缺陷细胞从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。（六）肿瘤细胞系或株这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今别举以下几种代表性的细胞名称供参考：HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地