3pH值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响.doc

pH值对聚谷氨酸发酵液粘度及聚合物结构的影响摘 要 生产中聚谷氨酸的发酵液非常黏稠(粘度达171Pas)，这使除茵体提取聚谷氨酸非常困难。通过加酸或碱调节发酵液pH8可明显降低发酵液的粘度(其中pH35时粘度仅为pH65时的1 60左右)。将pH35的发酵液离心除茵(10 000 g，10 min)后超滤浓缩(滤膜孔径045,um，平均压力008 Mpa)1倍，再加入95 乙醇提取7-PGA，与pH 中性时相比，可减少50 以上的能量消耗及40 的溶剂，但聚谷氨酸损失约10 。加酸或加碱处理可使发酵液中7-PGA 的分子结构发生改变，分子质量降低，这对生产高分子质量的聚谷氨酸不利，但对生产低分子质量产物是适宜的。关键词 聚 一谷氨酸，提纯，乙醇沉淀，枯草芽孢杆菌聚7一谷氨酸(7一PGA)是一些芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌等)荚膜结构的主要成分，是一种生物自然合成的聚酰胺原料_8 J。由于7一PGA可完全生物降解，对人体无毒，因此被认为是一种良好的生物可降解聚合物材料，可广泛地应用于食品、医药、环保、化妆品及农业等领域 ， ， 。在发酵法生产7-PGA方面，国内外已经有几个研究小组在探索，但在7一PGA的提取方面，研究的人比较少。在芽孢杆菌生长过程中，7一PGA从细胞壁中分泌出来形成菌体的荚膜结构，也可溶解在培养液中。由于7一PGA 属于高分子聚合物，分子质量一般在100 0001000 000 u之间，因此生产上发酵液变得非常粘稠，这一方面影响通风供氧，增加搅拌阻力，另外也给发酵结束后除菌体提取7一PGA带来很大困难。从7一PGA分子单体的结构来看，分子中有游离的羧基，其等电点为347 J，在7一PGA生产中由于发酵液的pH值接近中性，7一PGA荚膜结构带负电荷，在培养液中很稳定，不易沉降。产荚膜细胞的这种较高的稳定性及发酵液的高粘度，是细胞分离和7一PGA提取中存在的突出问题。降低产荚膜细胞的稳定性及发酵液的粘度是解决问题的关键所在。1 材料和方法11 材料111 菌 种枯草芽孢杆菌B53，从瓜汁中分离得到并进行了鉴定。112 培养基和培养条件(1)种子培养基：胰蛋白胨10 gL，酵母提取物5gL，NaCI 10 gL，葡萄糖1 gL ，蒸馏水配制，调pH72，01 MPa灭菌20 min。(2)发酵培养基：LGlu 20gL，CTA 986 gL，Glycerol 8036 gL，(NH4)2S04 7 gL，MgSO4。7H2O05 gL，FeC13 6H20 002 gL，K2HPO4 089 gL，CaCI2 003 gL，MnSO4 H2O 03 gL，蒸馏水配制，用NaOH调pH65，01 MPa灭菌20 min。基本发酵条件：采用300 mL三角瓶装液量50mL，种子液24 h，接种量4 (V、厂)，摇瓶转速150 rmin，37 振荡培养96 h。此条件下可生产2025 gL的7一PGA。12 方法121 7一PGA 的提取及测定方法7-PGA含量的测定参考文献1。122 发酵液动力粘度的测定发酵液经离心除菌后(离心转速20 000g，20min)，采用SNB一1数字式粘度计测定上清液粘度。选用3号转子，转速12 rmin，25下测定。123 发酵液pH值的测定酸度计法。124 超滤方法采用配备02 m、045 m 滤膜的小型超滤系统，2025 ，压力005010 MPa。125 SDS-PAGE 电泳方法采用DYC 23B型电泳仪(北京六一仪器厂)，分离胶10，浓缩胶5，电泳条件为操作电压80V，稳压3h，标准蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，PGA用阿利新兰8GX染色，其他参考文献9 3进行。126 显微观察采用显微摄像系统(Motic B SeriesPanasonic)。2 结果与讨论21 pH值对PGA发酵液动力粘度及产物回收的影响取发酵液280 mL，分装8个三角瓶中，用6 molL HCI或6 molL NaOH分别调pH值为30、35、40、50、60、70、80和90，然后在25 及45 下分别测定动力粘度(如图1)。取上述不同pH值的无细胞培养液各10 mL，分别加入95乙醇25 mL，振荡后离心15 min(10 000g)，称量沉淀物湿重(一次提纯)，再将沉淀物各加5 mL去离子水溶解，再分别加入15 mL 95的乙醇，振荡后离心15 min(10 000g)，再称量沉淀物湿重(二次提纯)。结果如图2所由试验结果看出，pH值与温度对发酵液的粘度有较大的影响。在pH4时，温度对粘度的影响是明显的，而pH7时，随pH值的升高，发酵液的粘度也逐步下降，但下降幅度没有酸性状态明显。将pH35的发酵液离心除菌(10 000g，10 min)后超滤浓缩(孑L径045 m，00MPa)1倍，再加入95乙醇提取了 PGA，这与pH 中性时相比可减少50 以上的能量消耗及40 的溶剂，只是7一PGA损失增加约10。试验中还发现，如果将pH72的发酵液逐步加酸调至pH30，再加碱中和至pH60，发酵液粘度急剧下降后并没有恢复(如图1)，说明加酸处理使聚合物的性质已经发生不可逆的变化。从对不同pH值的发酵液按溶剂法(加253倍体积的95乙醇)经一次沉淀和二次沉淀提取7一PGA的效果(图2)来看，在pH中性条件下了一PGA的提取收率较高，酸性和碱性环境下提取收率明显下降，并且二次沉淀后7一PGA的损失明显增加。22 pH值对PGA发酵液中菌体分散状态的影响对上述不同pH值的发酵液涂片观察后发现(如图3所示)，在pH中性的培养液里，菌体细胞比较分散，但在加酸处理后(pH35)细胞发生聚集，JinHwan Do等0认为加酸使菌体细胞表面的负电荷减少，引起细胞表面的电位(包围细胞的荚膜携带的电荷产生的)降低，从而减弱细胞表面电场的排斥力，使稳定性降低而发生聚集，造成发酵液粘度下降。但后面的研究表明，加酸处理使发酵液粘度大幅度下降的主要原因并非菌体聚积，而是了一PGA在酸性环境中分子结构发生变化所致。23 pH值对PGA发酵液中聚合物表观结构的影响取丫一PGA发酵液，分别加酸、碱及对加酸样品中和处理，得到不同pH值的PGA样品，取样进行显微观察及电泳测定。图4说明在pH 中性和近中性的较宽的范围内(pH58)，7-PGA 的表观分子结构比较规则，呈树枝状，有主干，分枝较多，随着pH 值的降低或升高，分子结构的规则性遭到破坏，由长链结构断裂成短片段或三角形态；而由酸性溶液中和至DH中性后，呈碎片状的7-PGA不能恢复到中性状态时的长链状规则结构。Idelson等 J证明7-PGA溶液的粘度与其分子量大小呈正相关，因此pH值改变引起7-PGA降解呈低分子质量片段是-PGA溶液粘度降低的直接原因。24 pH值对YPGA分子量的影响从不同pH值的发酵液中提取7一PGA，并进行逐步纯化，用SDSPAGE检测，结果如图5所示。从电泳结果可以看出，在pH65及pH80条件下提取的了一PGA的分子量比较大，分布的范围比较窄，而在pH95及pH50、pH35、pH30条件下提取的了一PGA的分子量分布范围比较宽，尤其在pH3035条件下，可以得到不同分子质量大小的7-PGA(大约在66967ku之间)。如果要生产不同分子质量或低分子质量(例如用作药物载体)的7-PGA，加酸处理是一种比较简洁的工艺操作，易于实现；如果需要生产高分子量(例如用作保水材料)的7-PGA，那么通过加酸降低发酵液粘度来离心除菌体及依靠膜浓缩处理来减少溶剂用量的工艺操作，都不宜采用。3 结 论利用乙醇沉淀法从高粘度发酵液中提取了PGA时，可以通过调节发酵液pH值的方法显著降低溶液的粘度，以降低离心