木瓜蛋白酶实验指导.doc

实验一 木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。四、实验步骤 1 木瓜乳的采集 选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。2 木瓜蛋白酶的提取用小烧杯称取木瓜乳约0.15g，准确记录其质量M(g)。用量筒量约30mL0.1 mol/L的磷酸缓冲液，用少许磷酸缓冲液将木瓜乳转移至研钵，并研成匀浆，将匀浆液过滤至量筒中，将剩余的磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液与匀浆液一同收集过滤于量筒中。读取量筒中收集到的滤液体积V(mL)，放置备用。3 木瓜蛋白酶活力的测定自定义酶活力单位（U）。本实验木瓜蛋白酶活力的定义为：在当前测定条件下，测定体系在275nm波长下，每增加0.001的吸光度为1个酶活力单位。单位体积酶样的活性：a（U/mL）=OD275nm/(10min0.0010.1mL)木瓜蛋白酶活力的测定步骤见下表：样品测定步骤待加试剂酶液（mL）10%TCA（mL）激活剂（mL）35保温10min1%酪蛋白摇匀35反应10min10%TCA（mL）过滤，测滤液的OD275nm对照管（1管）0.111.910反应管(2管)0.101.9114 蛋白质含量测定采用考马斯亮兰G-250法。具体测定步骤见下表：样品0.1mol/L的磷酸缓冲液（mL）酶液（mL）考马斯亮蓝G-250（mL）摇匀，室温下放置5min，测溶液的OD595nm对照管（1管）0.1 05反应管（2管）00.15根据经验公式计算获得木瓜乳提取液中蛋白质的含量：b(mg/mL)=2*A595nm五、 数据处