植物细胞工程.doc

植物细胞中药物的产品化制造植物中提取药物意义人类从植物中得到药物已有很长的历史。利用植物细胞培养可大量生产经济价值较高的植物有效成分,也可生产人活性因子、疫苗等重组DNA产品。植物细胞培养不受地理和气候条件的影响,次级代谢产物含量很高。如人参皂苷在组织培养中含量占干重的27%,全株中只有4.5%;紫草素在细胞培养物中占12%,而全株只有1.5%。药用植物三七、人参等的培养已进行了系统研究,并优化了培养条件。人参细胞培养物的化学成分和药理活性分析表明与种植人参无明显差异。一些植物的细胞培养已达到商业化生产应用,如在日本植物细胞培养反应器的规模已达 4000L 20000L,美国Phyto公司已达到75000L紫杉醇的生产规模。随着植物细胞培养、植物基因工程等生物技术的发展, 它被赋予了新的内容和广阔的发展前景。从药用植物中直接提取药有效成分是生产药物的一种主要方法。现许多中成药都是通过这种方法进行生产的。通过对药用植物的化学组成成分分析, 找出所含的可能有效成分, 经过生物学、药理药效验证, 确定出真正的有效成分,还可通过质谱分析、核磁共振等分析, 进一步确定此成分的分子结构和光学特征。提取工艺过程可按所取物质的各种化学物理特性进行分析设计。提取分离技术传统的有过滤、离心、淬取、蒸馏、各式色谱、电泳等方法。从植物中提取药物虽然简单, 但只适宜易栽培、繁殖快的植物, 而对生长周期长、不易栽培、含量少的植物, 如红豆杉, 用直接提取来生产紫杉醇会造成对红豆杉树种毁灭性的破坏。特别如今环境资源日益匮乏,环保意识日益深入, 此法也受到越来越大的限制。大规模植物细胞培养生产药用成分 植物细胞的大量培养是利用植物细胞体系, 通过现代生物工程手段进行工业规模生产, 以获得各种产品的一门新兴的跨学科技术。首次提出从植物细胞培养物中合成天然药物的是1956 年美国的Routier 和Nickell, 1967 年Kaul 和Staba 采用多升发酵罐对小阿米( Ammi visnaga) 进行了细胞大量培养的研究, 并首次用此方法得到了药用成分呋喃色酮( Visnagin) 。七八十年代, 植物组织培养、植物原生质体培养等各种植物培养技术与植物细胞培养技术共同发展, 在培养基配方、环境条件控制、悬浮培养技术等研究方面相互借鉴、相互促进; 而大规模培养技术方面, 得益于微生物发酵技术的飞速发展, 各种各样的反应器如气升式、气泡柱式、模式等反应器相继得到应用, 使得植物细胞大量培养的研究迅速得到借鉴发展。这些年来植物细胞培养技术主要致力于高产细胞株选育方法、悬浮培养技术、多级培养和固定化细胞技术、培养工艺优化控制、生物反应器研制、下游纯化技术等方面的研究, 并取得了较大进展。 近几年有些技术用于植物细胞培养对提高产物含量, 降低成本有一定的作用。这些技术有: ( 1) 发状根培养技术和冠瘿组织细胞培养技术。发状根( Hairy root ) 和冠瘿组织( Crown gall t issue) 在离体培养时都具有激素自主、增殖较常规细胞培养快、次生代谢物含量一般比悬浮培养细胞高、且能合成某些悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物以及能引入外源基因表达等特点, 从而引起人们利用它们生产药用次生代谢物的重视。如利用桔味薄荷( Mentha citrata) 冠瘿细胞生产萜烯, 洋地黄( Digitalis) 冠瘿细胞生产强心甙,丹参冠瘿细胞生产丹参酮, 长春花冠瘿细胞生产吲哚生物碱 , 人参发状根培养生产人参皂甙, 长春花发状根培养生产长春碱, 青蒿发状根培养生产青蒿素 , 萝芙木发状根培养生产生物碱等等。( 2) 两相培养技术 。两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物, 或者是具有吸附作用的多聚化合物( 如大孔树脂等) , 使培养体系形成上、下两相, 细胞在水相中生长与合成次生物质, 然后分泌出来转移到有机相中。这样不仅减少了产物的反馈抑制作用, 使产物含量提高, 而且通过有机相的不断回收及循环使用, 有可能实现植物细胞的连续培养, 使成本降低。不少植物培养细胞已成功地建立了两相培养系统, 如Payne 等在培养的长春花细胞中加入XAD- 7 大孔吸附树脂, 可以使吲哚生物碱的含量提高; 在培养的花菱草悬浮细胞中加入一种液体硅胶, 可使血根碱的含量大大提高。大规模植物细胞培养技术经过几十年的努力研究, 已取得很大的进展, 有些药用植物种类已实现工业化生产, 如从希腊毛地黄( Digitalis lanata) 细胞培养物通过生物转化生产地高辛( Digoxin) 、从日本黄连( Coptis japonica ) 细胞培养物中生产黄连碱( Copt isine) 、从人参根细胞中生产人参皂甙等; 相当种类的药用植物细胞大量培养已达到中试水平, 如长春花生产吲哚生物碱、丹参生产丹参酮、青蒿生产青蒿素、红豆杉生产紫杉醇、紫草生产萘醌、三七生产皂甙等等。实例一：自70年代以来, 各国学者研究尝试开发了各种有机溶剂的提取方法, 如云南药物研究所的“ 溶剂汽油法” , 此法简练, 工艺流程短, 操作方便, 但收率不理想,小试仅为0.3%, 工业生产小于0.2%, 且大量消耗汽油, 不太安全山东中药研究所的“ 丙酮一硅胶柱层析法” , 首先将中草药青篙的叶子和花蕾用丙酮浸泡次, 每次10- 12h, 合并滤出液,常压回收丙酮至小体积, 然后再进行脱蜡, 即加入乙醇(95%)于小体积的丙酮提取液中, 在一以下搅拌混匀, 使其基本溶解后, 在40- 50以下放置,用纱布过滤。所得乙醇滤液进行层析分离, 可得到青篙素。低沸汽油超短粗型球状扩孔硅胶过滤层吸法, 采用低沸点汽油为溶剂, 反复热回流浸提青篙干碎叶, 热回流时间至少10h, 反复至少4次, 将提取液通过装有球形扩孔硅胶的超短粗柱, 进行选择性过滤。采用异丙醇或醋酸乙酷同低沸点汽油的混合液为洗脱液通过柱体进行洗脱, 然后浓缩流出液, 即得到青篙素粗品四川中药研究所的“ 稀醇法而。Pamiego的新鲜组织甲苯提取法, 将新鲜的组织培养产物破碎后, 用甲苯提取, 过滤后减压,浓缩物用甲醇溶解, 再用0.2%NaON在50溶解30min,接着用醋酸中和Vonwiller等人的“ 甲醇一乙醇一乙醚” 提取法等。学者们为提高青篙素的产率, 充分利用天然资源, 又进行了许多深入的研究。Jain dharma chand等人改进了正己烷萃取青篙素的提取工艺,在乙睛提取物脱水后再用苯一正己烷对乙睛提取物进行萃取分配。蒸发苯一正己烷萃取物中溶剂, 再溶于5%氯仿中用的萃取3次, 经酸中和后再用氯仿萃取结晶可得到青篙酸重要的青篙素合成前体物质。乙睛相则浓缩, 洗提后得到青篙素。实例二：紫草有效成分提取方法有石油醚渗漉 、石油醚索氏提取 、醋酸乙酯索氏提取 、氯仿索氏提取、乙醇浸提、乙醇回流法、CO2 超临界萃取 的研究报道。考虑热、光对紫草稳定性的影响、以及成本、环保、安全等问题, 一般选用乙醇为溶剂, 采用低温或室温条件下进行有效成分提取, 即通过低温回流、超声法、渗漉法对紫草进行提取方法筛选, 并对选出的提取方法进行正交实验优选工艺参数, 目的在于探索有利于环保、工业化安全生产的紫草有效成分提取方法和工艺参数。乙醇回流提取(1 ) 紫草碾碎, 取10 目粗粉50. 00 g , 95%乙醇60 回流2 次, 第一次6 倍量,第二次4 倍量, 回流2 h 和1 h, 过滤, 回收乙醇, 冷冻干燥, 得干膏。(2) 超声提取 紫草碾碎, 取10 目粗粉50. 00g, 95% 乙醇超声2 次, 第一次6 倍量, 第二次4 倍量, 各超声30 min, 回收乙醇, 冷冻干燥, 得干膏。(3) 渗漉提取法 紫草碾碎, 取10 目粗粉50. 00g, 95% 乙醇10 倍量浸泡过夜, 以1 mLmin- 1 流速进行渗漉, 回收乙醇, 冷冻干燥, 得干膏。植物细胞大规模培养前景 目前大多数植物细胞大规模培养生产药物距商业化生产还有一定差距, 主要是由于: ( 1) 植物细胞的生长周期长, 易污染。( 2) 植物细胞对生物反应器的设计装置要求较高。( 3) 高产细胞株较难获得 。目前据报道只有20 多种植物的细胞培养物, 其次生产物含量超过原植物, 原因被认为是培养细胞的形态分化受到抑制,