CHAPTER 5 原核基因表达调控.ppt

原核基因表达调控Regulationinprokaryotes Chapter5 OUTLINE 5 1原核基因表达调控总论5 2乳糖操纵子的转录调控5 3色氨酸操纵子的转录调控5 4其它操纵子 半乳糖 阿拉伯糖 5 5翻译水平的调控 一 基因表达的概念geneexpression 基因转录及翻译的过程 对这个过程的调节就称为generegulation 注意 rRNA tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达 5 1原核基因表达调控总论 1 组成性表达 constitutiveexpression 指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达 其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的 且较少受环境因素的影响 2 适应性表达 adaptiveexpression 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达 二 基因表达的方式 1 组成性表达 指不大受环境变动而变化的一类基因表达 某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达 通常被称为管家基因 housekeepinggene 管家基因表达水平受环境因素影响较小 而是在个体各个生长阶段的大多数 或几乎全部组织中持续表达 或变化很小 它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响 而不受其他机制调节 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导 induction 这类基因被称为可诱导的基因 induciblegene 相反 随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏 repression 相应的基因被称为可阻遏的基因 repressiblegene 2 适应性表达 诱导作用 指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下 由原来关闭的状态变为工作状态 即在某些物质的诱导下使基因活化 例如 乳糖 乳糖操纵子 半乳糖苷酶 使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖 半乳糖苷透过酶 使乳糖进入细菌细胞内 半乳糖苷乙酰基转移酶 使半乳糖苷第六位碳原子乙酰化 5 1 1诱导和阻遏 阻遏作用 一些基因平时都是开启的 处在蛋白质或酶的工作过程中 由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭 阻遏了基因的表达 例如 色氨酸 色氨酸合成酶 一般情况下细菌自身可以合成色氨酸 但加入色氨酸 细菌因为不需要自身合成色氨酸 因此关闭该操纵子基因 5 1 1诱导和阻遏 原核基因表达调控类型及特点 原核生物的基因调控主要发生在转录水平 1 GeneExpressionisControlledbyRegulatoryProteins 调控蛋白 GeneexpressionisveryoftencontrolledbyExtracellularSignals whicharecommunicatedtogenesbyregulatoryproteins Positiveregulatorsoractivators 激活蛋白 INCREASEthetranscriptionNegativeregulatorsorrepressors 阻遏蛋白 DECREASEorELIMINATEthetranscription 2 Geneexpressioniscontrolledatdifferentstages Thebulkofgeneregulationtakesplaceattheinitiationoftranscription Someinvolvetranscriptionalelongation termination RNAprocessing andtranslationofthemRNAintoprotein 3 Targetingpromoterbinding manypromotersareregulatedbyactivatorsthathelpRNAPbindDNA recruitment andbyrepressorsthatblockthebinding RNAPbindsmanypromotersweakly activatorsthatcontaintwobindingsitestobindaDNAsequenceandRNAPsimultaneouslycanenhancetheRNAPaffinitywiththepromoters andthusincreasesgenetranscription Thisiscalledrecruitmentregulation 招募调控 Onthecontrary Repressorscanbindtotheoperatorinsideofthepromoterregion whichpreventsRNAPbindingandthetranscriptionofthetargetgene 4 Targetingtransitiontotheopencomplex Allosteryregulation 异构调控 aftertheRNAPolymeraseBinding Insomecases RNAPbindsthepromotersefficiently butnospontaneousisomerizationoccurstoleadtotheopencomplex resultinginnoorlowtranscription Someactivatorscanbindtotheclosedcomplex inducingconformationalchangeineitherRNAPorDNApromoter whichconvertstheclosedcomplextoopencomplexandthuspromotesthetranscription 5 Targetingpromoterescapebysomerepressors Repressorscanworkinways blockingthepromoterbinding blockingthetransitiontotheopencomplex blockingpromoterescape 6 Cooperativebinding recruitment andallosteryhavemanyrolesingeneregulation Forexample groupofregulatorsoftenbindDNAcooperatively activatorsand orrepressorsinteractwitheachotherandwiththeDNA helpingeachothertobindnearagenetheyregulated producesensitiveswitchestorapidlyturnonageneexpression integratesignals somegenesareactivatedwhenmultiplesignalsarepresent 5 1 2弱化子对基因活性的影响 弱化子 色氨酸 苏氨酸 苯丙氨酸等 当操纵子 是基因表达的协调单位 由启动子 操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成 操纵基因受调节基因产物的控制 被阻遏 RNA合成被终止时 起终止转录信号作用的一段核苷酸 核糖体在基因转录产物上的不同位置 决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构 并由此决定基因能否继续转录 起信号作用的是有特殊负载的氨酰 tRNA的浓度 5 1 3降解物对基因活性的调节 通过提高转录强度来调节基因表达 葡萄糖效应 降解物抑制效应 在有葡萄糖存在的情况下 即使在细菌培养基中加入乳糖 半乳糖 阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物 与其相对应的操纵子也不会启动 不会产生出代谢这些糖的酶来 葡萄糖 抑制腺苷酸环化酶 减少cAMP的合成 与其相结合的环腺苷酸受体蛋白CRP或分解代谢物蛋白CAP 找不到配体而不能形成复合物 5 1 4细菌的应急反应 实施应急反应的信号是鸟苷四磷酸 ppGpp 和鸟苷五磷酸 pppGpp 产生这两种物质的诱导物是空载tRNA 当氨基酸饥饿时 细胞中存在大量空载tRNA 其激活焦磷酸转移酶 使ppGpp大量合成 从而关闭和打开一些基因 1961年操纵子模型的提出 莫洛 Monod 和雅各布 Jacob 获1965年诺贝尔生理学和医学奖是一种负控诱导系统 5 2乳糖操纵子 lactoseoperon 5 2 1酶的诱导 如何发现 乳糖诱导lacmRNA的合成 真正的诱导剂 IPTG 异丙基硫代半乳糖苷 TMG 巯甲基半乳糖苷 发色底物O 硝基半乳糖苷 ONPG 别乳糖和IPTG是Lac操纵子的诱导物 操纵子 operon 阻遏基因 inhibitor I 产生阻遏物repressor 启动子 promoter P 操纵基因 operator O 结构基因 structuralgene Lac操纵子结构 Operon aunitofprokarytoicgeneexpressionandregulationwhichtypicallyincludes 1 Structuralgenesforenzymesinaspecificbiosyntheticpathwaywhoseexpressioniscoordinatelycontrolled 2 Controlelements suchasoperatorsequence 3 Regulatorgene s whoseproductsrecognizethecontrolelements Sometimesareencodedbythegeneunderthecontrolofadifferentpromoter lacY encodesacellmembraneproteincalledlactosepermease 半乳糖苷渗透酶 totransportLactoseacrossthecellwall lacZ encodesfor galactosidase 半乳糖苷酶 forlactosehydrolysis lacA encodesathiogalactosidetransacetylase 硫代半乳糖苷转乙酰酶 togetridofthetoxicthiogalacosides 三种结构基因 ThelacZ lacY lacAgenesaretranscribedintoasinglelacZYAmRNA polycistronicmRNA underthecontrolofasignalpromoterPlac LacZYAtranscriptionunitcontainsanoperatorsiteOlac positionbetweenbases 5and 21atthe3 endofPlac Bindswiththelacrepressor TheLACoperon Z Y A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码 该mRNA分子的P区位于I与O之间 不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达 5 2 2操纵子模型与影响因子 O区是DNA上的一小段序列 26bp 是阻遏蛋白的结合位点 当阻遏蛋白与O相结合时 lacmRNA的转录起始受到抑制 诱导物通过与阻遏蛋白结合 改变其三维构象 使之不能与O结合 从而激发lacmRNA的合成 5 2 2操纵子模型与影响因子 1 lac操纵子的本底水平表达 两个矛盾 诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合 即需要透过酶来转运诱导物 而透过酶的合成又需要诱导物进行诱导 乳糖 葡萄糖 1 4 半乳糖 并不与阻遏物结合 真正的诱导物是乳糖的异构体 葡萄糖 1 6 半乳糖 而后者是在 半乳糖苷酶的催化下由乳糖生成的 因此乳糖诱导 半乳糖苷酶的合成需要有 半乳糖苷酶的预先存在 对矛盾的解释 在非诱导状态下有少量lacmRNA合成 这种合成称之为本底水平的组成型合成 backgroundlevelconstitutivesynthesis 由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的 即使在它与操纵基因紧密结合时 也会偶尔掉下来 这时启动子的障碍被解除 RNA聚合酶开始转录 即 无需诱导物 阻遏物从操纵基因处掉下 启动子可以启动结构基因表达 1 lac操纵子的本底水平表达 2 大肠杆菌对乳糖的反应 加入乳糖以后 在单个透过酶分子作用下 少量乳糖分子进入细胞 在单个 半乳糖苷酶作用下转变为异构乳糖 异构乳糖与结合在O区的I相结合并使I失活而离开O区 开始lacmRNA的合成 最终结果导致乳糖大量涌入细胞 i p o z y a VerylowleveloflacmRNA Absenceoflactose Active Presenceoflactose Lackofinducer thelacrepressorblockallbutaverylowleveloftrans criptionoflacZYA WhenLactoseispresent thelowbasallevelofpermeaseallowsitsuptake andb galactosidasecatalyzestheconversionofsomelactosetoallolactose Allolactoseactsasaninducer bindingtothelacrepressorandinactivateit Responsetolactose 3 阻遏物lacI基因产物及其功能 lac操纵子阻遏物mRNA 由弱启动子控制组成型合成 该阻遏蛋白有四个相同的亚基 每个亚基含有347个氨基酸残基 并能够与1分子IPTG结合 当I基因由弱启动子突变为强启动子 细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态 整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导 结构基因处在关闭状态 Responsetoglucose cAMP受葡萄糖浓度调节 4 葡萄糖对lac操纵子的影响 代谢物激活蛋白CAP cataboliteactivatorprotein 由Crp基因编码 能与cAMP形成复合物 凡是Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成lacmRNA CRP cAMP CAP cAMP 复合物是独立于阻遏物的正调控因子 5 cAMP与代谢物激活蛋白 CAP结合位点 mRNA启动子内部 cAMP CAP复合物 5 cAMP与代谢物激活蛋白 无葡萄糖 cAMP浓度高时促进转录 有葡萄糖 cAMP浓度低时不促进转录 CAP的正调控 两个区 P区 启动子区 一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5 10bp O区 阻遏物结合区 位于 7 28bp阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率 5 2 3lac操纵子DNA的调控区域 总结一 阻遏蛋白的负性调节 negativecontrolofrepressor 无乳糖 nolactose lac操纵子处于阻遏状态 repression 有乳糖 presenceoflactose lac操纵子即可被诱导 derepression induction 诱导剂 inducer 别乳糖 半乳糖 IPTG 异丙基硫代半乳糖苷 乳糖操纵子 lacoperon 的调控方式 总结二 CAP的正性调节 PositiveControlofCAP CAP cAMP帮助RNA聚合酶有效的结合到lacP位点 加快RNA合成的起始反应 RNA聚合酶与CAP相互足够靠近 直接复合 以蛋白质 蛋白质接触提供额外的能量 大大增强RNA聚合酶的结合能力 CAP的结合可能把位点周围的DNA双螺旋结构转变为一种更容易被RNA聚合酶识别的外形和构象 增加了封闭复合物的形成或者从封闭型复合物转向开放型复合物的速度 CAP以二聚体形式行使功能 二聚体被单个cAMP活化 其上有两个结合位点 cAMP结合位点 DNA结合区 lacP内CAP cAMP结合位点序列具有对称性 lacP的 54 58 65 69是CAP cAMP结合位点 总之 CAP cAMP复合物与DNA的CAP位点结合时 促进RNA聚合酶对 35和 10序列的识别和结合 并形成开放起始复合物 提高了转录效率 总结二 CAP的正性调节 PositiveControlofCAP CAP的正性调节 CAP的正性调节 5 3色氨酸操纵子 tryptophanoperon Lac操纵子负责营养碳源的分解 平时关闭 只有当需要消耗乳糖时 才通过诱导物使阻遏蛋白失活而开放 是可诱导的负调控基因 另外还存在CAP的正调控 Trp操纵子负责Trp的合成 平时开放 调节基因的产物使其关闭 是可阻遏的负调控 另外还存在翻译与转录耦联的衰减子调控手段 Trp操纵子与lac操纵子的不同 1 Structureofthetrpoperon ED 编码邻氨基苯甲酸合成酶 2 60KD C 编码吲哚甘油磷酸合成酶 45KD BA 编码Trp合成酶 亚基 50KD 和 亚基 29KD La为前导肽和衰减子序列O为控制子 含 10区 P为启动子R为阻遏基因 1 Structureofthetrpoperon 1 trpR和trpABCDE不连锁 2 操纵基因在启动子内 3 有衰减子 attenuator 弱化子 4 启动子和结构基因不直接相连 二者被前导序列 Leader 所隔开 色氨酸操纵子特点 Thetrpoperonencodesfivestructuralgenesrequiredfortryptophan 色氨酸 synthesis Thesegenesareregulatedtoefficientlyexpressonlywhentryptophanislimiting Twolayersofregulationareinvolved 1 transcriptionrepressionbytheTrprepressor initiation 2 attenuation 2 thetrpoperon TrprepressorisencodedbyaseparateoperontrpR andspecificallyinteractswiththeoperatorthatoverlapswiththepromotersequenceTherepressorcanonlybindtotheoperatorwhenitiscomplexedwithtryptophan Therefore Tryisaco repressorandinhibitsitsownsynthesisthroughend productinhibition negativefeed backregulation 3 TheTrprepressor Therepressorreducestranscriptioninitiationbyaround70 fold whichismuchsmallerthanthebindingoflacrepressor TherepressorisadimeroftwosubunitswhichhasastructurewithacentralcoreandtwoflexibleDNA readingheads carboxyl terminalofeachsubunit 3 TheTrprepressor trpoperon TheTRPoperon trp操纵子的阻遏系统 低Trp时 阻遏物不结合操纵基因 高Trp时 阻遏物与Trp结合操纵基因 色氨酸高浓度和低浓度下表达水平相差600倍 而阻遏作用仅使转录降低70倍 aregulationatthetranscriptionterminationstep asecondmechanismtoconfirmthatlittletryptophanisavailable 4 Attenuation 衰减作用 RepressorservesastheprimaryswitchtoregulatetheexpressionofgenesinthetrpoperonAttenuationservesasthefineswitchtodetermineifthegenesneedtobeefficientlyexpressed 4 Attenuation 衰减作用 弱化子 DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列 123 150区 研究引起终止的mRNA碱基序列 发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎 环结构 有典型的终止子特点 结构基因E上游具有 启动子 操纵子基因 前导序列 衰减子区域mRNA5 端162个核苷酸 其中139个构成前导序列 14个氨基酸的前导肽4个互补区段1个衰减子终点 Trp操纵子的前导序列TrpL 前导序列 在trpmRNA5 端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段 某些区段富含GC GC之间容易形成茎环二级结构 接着有8个U构成一个不依赖于 因子的终止信号 由 1 和 2 区序列构成第二个发夹结构 其中 1 区处于14个氨基酸的前导肽序列中 2 和 3 区互补 可以形成发夹结构 与 3 和 4 形成发夹结构竞争 14个氨基酸前导肽中有5个核糖体强结合位点 之后还有一个UGA 前导序列中并列2个色氨酸密码子 前导序列的5个特点 转录的弱化理论 mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的 在前导肽中有两个相邻的色氨酸密码子 所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度敏感 当培养基中Trp浓度很低时 负载有Trp的tRNATrp也就少 翻译通过两个相邻Trp密码子的速度就会很慢 当4区被转录完成时 核糖体才进入1区 或者停留在两个相邻的Trp密码子处 这时2 3配对 不形成3 4配对的终止结构 转录继续 当培养基中Trp浓度高时 核糖体可顺利通过两个相邻的Trp密码子 在4区被转录之前 核糖体就到达2区 这样使2 3不能配对 3 4区形成终止子结构 转录停止 转录弱化作用机理 转录弱化作用机理 Importanceofattenuation Atypicalnegativefeed backregulationUseofbothrepressionandattenuationallowsafinetuningoftheleveloftheintracellulartryptophan Attenuationalonecanproviderobustregulation otheraminoacidsoperonslikehisandleuhavenorepressorsandrelyentirelyonattenuationfortheirregulation Providesanexampleofregulationwithouttheuseofaregulatoryprotein butusingRNAstructureinstead 半乳糖操纵子阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答二组分调控系统和信号转导多启动子调控的操纵子 5 4其它操纵子 结构基因 使半乳糖变为葡萄糖 1 磷酸 galE 异构酶galT 半乳糖 磷酸尿嘧啶核苷转移酶galK 半乳糖激酶调节基因galR 两个启动子 可以从两个不同的起始点转录 两个操纵区O 一个在P区上游 67 73 一个在galE内部 5 4 1半乳糖操纵子 galactoseoperon gal操纵子的特点 它有两个启动子 其mRNA可从两个不同的起始点开始转录 它有两个O区 一个在P区上游 另一个在结构基因galE内部 gal操纵子P O区有两个相距仅5bp的启动子 每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2 cAMP CRP对起始的转录有不同的作用 从S1起始的转录 无葡萄糖 RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖 CRP和cAMP 从S2起始的转录 完全依赖葡萄糖 高水平的cAMP CRP抑制转录 5 4 1半乳糖操纵子 galactoseoperon 半乳糖具有双重功能 作为唯一碳源 作为合成尿苷二磷酸半乳糖UDPgal形成细胞壁的前体 在没有外源半乳糖的情况下 细胞通过半乳糖差向异构酶由UDP 葡萄糖合成UDPgal 只需本底水平表达即可 如果只有S1 依赖于cAMP CRP 一个启动子 当有葡萄糖时就不能合成异构酶 只有S2 不依赖于cAMP CRP 那么半乳糖使操纵子处于充分诱导状态 最终 一个不依赖cAMP CRP的S2进行本底水平的表达 一个依赖于cAMP CRP的S1对高水平合成进行调节 双启动子的生理功能 阿拉伯糖降解基因 构成基因簇araBAD araB 编码核酮糖激酶araA L 阿拉伯糖异构酶araD L 核酮糖 5磷酸 4 差向异构酶araE 膜蛋白araF 阿拉伯糖结合蛋白 5 4 2阿拉伯糖操纵子arabinoseoperon 与araBAD相邻的是 一个复合启动子区域 两个操纵区 O1和O2 一个调节基因araC araBAD基因簇从启动子开始向左转录 而araC向右转录 AraC蛋白既是ara操纵子的正调节蛋白 起始转录还需要cAMP CRP的共同参与 又是其负调节蛋白 AraC蛋白的两种形式Pr和Pi Pr是起阻遏作用的形式 与类操纵区位点结合 Pi是起诱导作用的形式 通过与PBAD启动子结合进行调节 5 4 2阿拉伯糖操纵子arabinoseoperon 低阿拉伯糖水平负调控 高阿拉伯糖水平正调控 1 AraCandcontrolofthearaBADoperonbyanti activation ThepromoterofthearaBADoperonfromE coliisactivatedinthepresenceofarabinoseandtheabsenceofglucoseanddirectsexpressionofgenesencodingenzymesrequiredforarabinosemetabolism ThisisverysimilartotheLacoperon BecausethemagnitudeofinductionofthearaBADpromoterbyarabinoseisverylarge thepromoterisoftenusedinexpressionvector IffusingagenetothearaBADpromoter theexpressionofthegenecanbeeasilycontrolledbyadditionofarabinose Whatisanexpressionvector 1 AraCandcontrolofthearaBADoperonbyanti activation araC表达受到AraC的自身调控 AraC既是ara操纵子的正调节蛋白 需cAMP CRP的共同参与 起始转录 又是其负调节蛋白 这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的 Pi和Pr ara操纵子的调控有两个特点 当细菌DNA遭到破坏时 细菌会启动SOS的诱导型DNA修复系统 参与SOSDNA修复系统的基因受LexA阻遏蛋白的抑制 当DNA严重受损时 DNA复制被中断 单链DNA缺口数量增加 RecA蛋白与缺口处单链DNA相结合 被激活成为蛋白酶 将LexA蛋白切割为没有阻遏和操纵区DNA结合活性的两个片段 导致SOS体系高效表达 DNA得到修复 5 4 3阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答 SOS反应的机理 由RecA蛋白和LexA阻遏物的相互作用引起的 LexA阻遏物 是SOSDNA修复系统所有基因的阻遏物 RecA蛋白 是SOS反应的最初的发动因子