代谢课答案.doc

2. 代谢改造思路和代谢设计原理 代谢改造思路 代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。(1)改变代谢途径方法 l1)加速限速反应 增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。2)改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途径 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理 一、现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流 (1) 增加限速酶编码基因的拷贝数 没有改变代谢流，只是增加了酶的量，提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的反应速率。 (2) 强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率 (3) 提高目标途径激活因子的合成速率(4)灭活目标途径抑制因子的编码基因 (5) 阻断与目标途径相竟争的代谢途径 (6) 改变分支代谢途径流向 提高某一分支途径中的酶活力，从而使该分支途径在竟争中处于有利的地位。(7) 构建代谢旁路 大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。 (8) 改变能量代谢途径 如：将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。二、在现存途径中改变物流的性质 指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到获得新产物的目的。可以通过以下两种方法： (1) 利用酶对前体库分子结构的宽容性 如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。 (2) 通过修饰酶分子以拓展底物识别范围 修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。三、在现存途径基础了扩展代谢途径 在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。3. 微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明） ：核酸的凝胶电泳：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷（电荷密度），因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）染色，由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。 ：核酸的分子杂交技术其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等核酸分子杂交技术主要有以下几种: Southern 杂交 、Northern 杂交 、原位杂交(ISH) 荧光原位杂交(FISH) 、芯片杂交(属于固一液相杂交)在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE） ：细菌的转化：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态。CaCl2处理后细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附，将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。 ：DNA序列分析a. Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链； DNA聚合酶常用Klenow大片段，无53外切酶活性。该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物，DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。b DNA序列分析自动化(分析反应读片过程 ) 用四甲基若丹明作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。 ：基因的定点诱变 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变。如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变（这两段话只要写一段就好，上面一段是老师给的定义，下面一段是我以前学的课件里抠出来的） ：利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究a.凝胶滞缓实验， 又称DNA迁移率变化试验含有放射性的DNA与蛋白质结合后，经过凝胶电泳，由于结合后迁移速率变慢，经过放射自显影中看到一条滞后的条带。b.DNase I 印迹试验主要步骤： 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！ 沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； 进行DNA凝胶分析。如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。 ：PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。 DNA解链（变性）、 引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。 5. 微生物酶的自动调节方式 （举两例说明）微生物酶的自动调节方式主要包括以下几个水平上的调节：1转录水平上的调节 2翻译水平上的调节 3蛋白质水平上的调节 4酶在不同空间的分布 5整个细胞水平上的调节(全局性调节) 6信息传导的响应1. 在转录水平上，存在一种酶的诱导机制，以大肠杆菌乳糖操纵子的调节机制为例：大肠杆菌乳糖操纵子由3个结构基因组成：lacZ,lacy,lacA,这3个结构基因被同一个转录单元lacZYA编码，它有一个启动子Plac , lacZYA转录单元含有一个操纵基因位点Olac ，位于P的5端，该位点可以被一个称作乳糖阻遏物的蛋白质结合，阻止转录的进行。阻遏物由调节基因lacI编码，lacI位于P的上游。当没有诱导物时，调节基因lacI编码的阻遏物与O结合，阻止结构基因的转录；当细胞内诱导物达到一定浓度时，他就与阻遏物结合，使其构象发生变化，失去结合O的功能，使结构基因转录表达。2. 在转录水平上另一个调节机制是终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制，以色氨酸操纵子为例：色氨酸操纵子包括5个结构基因，启动子P，操纵基因位点O及上游的编码色氨酸阻遏物的独立操纵子trpR，它能与O特异性结合。当产物色氨酸与色氨酸阻遏物结合后形成复合物后才能结合到操纵基因上，抑制转录的起始。即色氨酸操纵子编码的酶的终产物色氨酸作为共阻遏物起作用，通过终产物抑制自身的合成。3. 酶的阻遏调节机制：色氨酸操纵子的调节：当培养基中色氨酸含量较高时，色氨酸与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使其与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子失去阻遏。(题目要求的是举例，这部分的例子非常多，大家可以自由发挥。)7微生物育种工业发酵的五字策略,结合实例说明进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；在发酵过程中，一般都希望菌体能迅速达到一定的浓度，因此，就必需选用生长旺盛的菌株，这类菌株吸收营养物质的能力往往也较强。同时要选择适当的容易吸收的培养基，和适宜的培养条件，以促进微生物的生长。为了消除底物在培养过程中的抑制作用，有的还采用流加的培养方法。为了促进微生物的生长和支持目的产物的合成，还要从代谢生理学的角度优化流加条件。 通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；在育种方面，解除对途径中某些酶的反馈调节；在发酵控制方面，诱导这些酶的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢物流（除碳架物流外还包括其他支持生物合成的物流）能够畅通地注入载流路径，汇入代谢主流，流向目的产物。特别是当发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保载流路径畅通，代谢主流优势明显。 节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；采用育种或发酵控制手段，节制载流路径上与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。这里所谓的 “ 节制 ” 是指封闭或削弱以目的产物合成途径的起始底物或各中间产物为起始底物的分支途径。堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；采用育种或发酵控制手段堵塞或削弱目的产物进一步代谢的途径，包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢。如果菌株生产目的产物的途径畅通，但同时目的产物进一步代谢（包括目的产物参与的分解代谢和合成代谢）的途径