蛋白裂解液.doc

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择：全细胞：NP-40或RIPA细胞质（可溶）：Tris-HCl细胞质（细胞骨架）：Tris-Triton细胞膜：NP-40或RIPA细胞核：RIPA线粒体：RIPARIPA裂解液配方1ml RIPA buffer contains 35l proteinase inhibitor and 10l phosphatase inhibitorRIPA buffer最终浓度1M Tris-HCl (pH7.5)5 ml50mMNaCl0.87g0.15 MNa-deoxycholale0.1g（0.1%）0.5M EDTA(pH8.0)0.8mlNaF41 mgNonidet P401 ml（1%）Aprotinin10g/l100l10g/ml加水到 100mlAprotinin 10g/l ；用10mM HEPES-KOH（PH8.0）溶解，备用。l Nonidet P-40简称NP-40，乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。l Na-deoxycholale，脱氧胆酸钠，离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有：裂解细胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很适合做WB，但在Co-IP中使用，需要谨慎。l 亮抑霉肽（Leupeptin）：抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶）和半胱氨酸蛋白酶（包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B）l 抑肽素A（Pepstatin A）抑制各种天门冬氨酸蛋白酶，例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶；l 胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymostatin）抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶（包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶 G）和大多数丝氨酸蛋白酶（包括组织蛋白酶B，H，L） l 抗木瓜蛋白酶（Antipain）抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。l 氟化钠抑制酸性磷酸酶l 正钒酸钠：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶 （tyrosine phosphatase）l 焦磷酸钠 （sodium pyrophosphate）：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶（serinethreonine phosphatase） 。在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠 ，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。 溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇， +25时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。4一周稳定,分成小份冷冻在-20至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶， 激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。pH约7-8的溶液在4可保存1周，分装保存在-20可至少保存6个月。避免反复冻融, pH12.8的碱性环境可使其灭活。分子量：6,512使用：贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度：0.062.0 ug/ml(0.010.3 uM)Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶，肾素，组织蛋白酶D，凝乳酶， 许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml； 可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4稳定一周，分装储存于-20时可保存1个月分子量： 685.9使用：贮存浓度：1mg/ml，使用浓度：0.7 g/ml(1 M)EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4稳定至少6个月分子量: 372.24使用：工作浓度：0.20.5 mg/ml(0.51.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8-9时再加入。磷酸酶抑制剂NaF氟化钠 溶解性：溶于水分子量： 41.99使用： 贮存液：5M 工作浓度：10-20mMNa3VO4 原矾酸钠 分子量：183.91溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)(2).煮至无色(3).室温冷却(4).重调PH至10(5)重复（）（）（）（）直至溶液保持无色，并且稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.使用： 贮存液：100mM 工作浓度：1mMBETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠溶解性：溶于水分子量：306.11使用：贮存液：100mM工作浓度：25mMNa2P2O4 焦磷酸钠溶解性：溶于水分子量：265.9贮存液：100mM, 工作浓度：1-2 mMSDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。Brij Buffer I Tris-HCl (1M, pH 7.5)1millilitre (ml)EDTA (0.5 M)0.4millilitr