生物技术概论2.doc

蛋白质工程部分一、名词解释：蛋白质工程：是基于对蛋白质结构和功能关系的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论及实践，是基因工程基础上的延伸，是第二代基因工程。structure motif：结构模体。介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有、和等。折叠病：蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变引起的疾病。如老年性痴呆症、帕金森氏症以及某些肿瘤。嵌合抗体：用DNA重组技术将鼠源单抗的可变区(V区)基因与人免疫球蛋白(Ig)的恒定区(C区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表达,制成嵌合抗体。目前国内外已制备了数十种嵌合抗体。Proteome：蛋白质组。指处于一定发育阶段的有机体、组织、细胞或亚细胞结构在一定的条件下所表达出的全部蛋白质群体。Mass Spectrometry：质谱技术。是将被测物质离子化，离子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依离子的质荷比（M/Z）的不同而变化，从而可以据其差别来判断离子的质量及特性。Peptide mass fingerprinting: 肽质量指纹谱,指蛋白质或肽被特异性的酶切后再用质谱进行肽混合物质量测定，会得到一套具有特征性的肽质量图谱，由于其具有特征性,所以称为指纹谱。通过与数据库中所有的蛋白质的理论酶解的肽质量相匹配来鉴定蛋白质。二、单项选择题1. 蛋白质工程的基本原理是（ C ） A 中心法则 B 热力学第二定律 C 中心法则的逆推 D 模型对比2. 下列不属于蛋白质结构测定的技术是（ D ） A X射线晶体衍射技术 B 核磁共振波谱技术 C 生物信息学预测蛋白质结构 D 缺失突变技术3. 通过增加内氢键数目可以改善蛋白质设计的哪项目标（ A ） A 热稳定性 B对氧化的稳定性 C对重金属的稳定性 D pH稳定性4. “分子病”是由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起的疾病。 下列不属于分子病的是（ D ） A 地中海镰刀状红血球贫血症 B 血友病 C 苯丙酮尿症 D 老年性痴呆症5. 蛋白质微阵列( Protein micro-array) ，将大量蛋白质有规则的固定在某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间相互作用检测分析蛋白质 的技术称为（ A ） A 蛋白质芯片技术 B 蛋白质分子印迹技术 C表面等离子体共振技术 D酶联免疫吸附剂测定三、填空题 1维持蛋白质一级结构的作用力是（ 肽键 ）。 2蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的（修饰）和（合成），对（现有蛋白质）加以定向改造，设计、构建并最终生产出 性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 3. 常用的蛋白表达系统有（ 大肠杆菌表达系统 ）、（ 酵母表达系统 ）、（哺乳动 物细胞表达系统）和（昆虫细胞表达系统） 。 4. 核磁共振（NMR）的优点是可以在 （ 水溶液或有机相 ）中研究生物大分子结构， 研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的特 点。 5. 蛋白质分离纯化方法中根据分子大小的纯化方法有（ 透析和超滤 ），（ 密度梯度离 心）和（ 凝胶层析 ）。 6. 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用（ 蛋白质在等电点时溶解度最低 ）的原 理，可以把蛋白质混合物分开。四、简单题1. 目前有哪些蛋白质工程分子改造的常用方法？答： 基因定点突变技术（小改）：即通过在DNA水平上进行碱基的取代、插入或缺失，达到改变基因，从而改变编码的蛋白质的结构的技术，包括核苷酸引物诱变，盒式诱变，PCR诱变，随机诱变。 基因剪切和融合（中改）：原理：将编码某蛋白的部分基因移植到另种蛋白基因上，经克隆、表达，产生新的融合蛋白。可达到使蛋白易于表达、纯化、细胞定位等，或使蛋白性质改变。 基因全合成（大改）：合成DNA，然后表达出相应蛋白。可以全部由人工控制，便于设计和改造，还适用于同时实现多处突变。2. 蛋白质工程中增加蛋白质热稳定性的基本途径有哪些？答：蛋白质结构与功能研究表明，蛋白质空间构象的稳定性是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，就有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。增加蛋白质热稳定性的基本途径包括：引入二硫桥，增加分子内氢键数目，改善分子内疏水堆积，增加表面盐桥。3. 简述等电聚焦的原理。答：利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，使pH从正极到负极逐渐增加。蛋白质分子在偏离其等电点的pH位置带电，因此在电场中可以移动；当蛋白质移动到pH等于pI位点，其静电荷为0，在电场中不再移动，据此可将不同pI的蛋白质分离。4.简述同位素亲和标签技术（Isotope Coded Affinity Tages，ICAT）原理。答：ICAT试剂由3 部分组成: 活性反应基团(碘乙酰胺)，可与细胞蛋白质的半胱氨酸(Cys)反应；连接子(含8 个氘或氢称为重或轻试剂)可引入稳定同位素；亲和标签(生物素)用来分离含Cys 的多肽用具有不同质量的同位素亲和标签(ICATs)标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，ICAT的反应基团会专一与蛋白质中的Cys共价结合，待充分反应后，将二者等量混合，酶解，再通过生物素的亲和层析就可以将标记含Cys 的肽段分离出来，利用串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同MSMS 只鉴定含标记的Cys 肽段,从而大大减小了样品混合物的复杂性。五、论述题1. 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性。将胰岛素B9残基上极性的Ser置换为带电荷Asp，同时把B27极性的Thr置换为带负电荷的Glu，由此可制成速效胰岛素。请阐述其原理。答：已知二聚体形成过程中，两个分子的结合面上Ser B9与链螺旋上的GluB13侧链相靠近，两个分子间的GluB13相靠近，并且侧链上带有相同电荷，它们本身就有互斥作用。如果将临近的SerB9置换为Asp，可在二聚体间形成连续4个带负电的侧链，在六体中这种互斥的接触重复三次，有利于降低胰岛素分子的缔合作用。经过这样的改造，双突变SerB9Asp/ThrB27Glu有效地使二聚体在毫摩尔浓度下解聚为单体，它进入血液的吸收率也比天然胰岛素提高了三倍。核磁共振谱研究表明它也保持了与天然蛋白相同的主要结构特征。酶工程部分一、名词解释：酶的变性与酶的失活：酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏，酶的空间结构也受到破坏，原来有序、完整的结构变成了无序，松散的结构，失去了原有的生理功能。酶的失活则是指酶的自身活性受损（包括辅酶、金属离子受损），失去了与底物结合的能力。别构酶：调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶。固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶。酶分子定向进化：是从一个或多个已经存在的亲本酶出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具体某些特征的进化酶。盐析结晶法：在适当的温度和值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度缓慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。酶反应器：通常将用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。合适的酶反应器可以使酶得到合理的应用，并能提高产品的质量和降低成本。抗体酶：具有催化能力的单克隆抗体，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。酶传感器：是间接型传感器，它不是直接测定待测物质的浓度，而是利用酶的催化作用，在常温常压下将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通过测定与反应有关的物质浓度，进而推出相应的生物物质浓度。二、填空题1. 1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下每（1）分钟内,催化（1mol）的底物转化为产物的酶量为一个国际单位，即1IU。2. 酶的生产方法有（提取法），（发酵法）和（化学合成法）。3. 酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高（酶的活力）、减少（抗原性），增加（稳定性）。4. 决定酶催化活性的因素有两个方面，一是（酶分子结构），二是（反应条件）。5. 模拟酶的两种类型是（半合成）酶和（全合成）酶 。6. 根据在酶促反应中抑制剂对Km值的影响，Km值增加，其抑制剂属于（竞争性）抑制剂，Km不变，其抑制剂属于（非竞争性）抑制剂，Km减小，其抑制剂属于（反竞争性）抑制剂。三、简答题1. 酶的固定化方法主要有哪些？答：将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价键结合法，以及交联法等1.包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。操作简单，可制得较高活力的固定化酶。2.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等.操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不太牢固易脱落3.共价键结合法：酶蛋白侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。4.交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制得固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。制备的固定化酶结合牢固，可长时使用.但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。2. 简述酶结晶的主要方法和原理？答：（1）盐析结晶法：在适当的温度和值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度缓慢降低，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程（）有机溶剂结晶法：在接近饱和的酶液中缓慢增加某种有机溶剂，使酶的溶解度缓慢降低，而析出酶晶体的过程（）透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）酶液要浓缩到一定浓度（）等电点结晶法：通缓慢加入浓酶液的值、使之逐渐达到酶的等电点，而析出酶晶体的过程3. 提高酶产量的措施有哪些？答：1.添加诱导物：酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物。酶的反应产物：如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。酶的底物类似物：如异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍2.降低阻遏物浓度：微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，如在-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。3.添加表面活性剂（产酶促进剂）：改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。4. 为什么需要对某些天然酶类进行固定化？固定化酶具有什么特点？答：天然酶在应用中的一些缺陷:1、酶稳定性差，易变性失活2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化。固定化酶特点：1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。5.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？答：（1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样（2）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶（3）来源广泛，价格便宜（4）微生物易得，生长周期短（5）可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高（6）可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种。6. 在生产实践中，对产酶菌有何要求？答：一般必须符合下列条件（1)不应当是致病菌，在系统发育上最好是与病原菌无关（2)能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高（3)菌种不易变异退化，不易感染噬菌体（4)最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高（5)在食品和医药工业上应用，安全问题更显得重要。四、论述题1. 如何检查一种酶的制剂是否达到了纯的制剂？试用所学过的知识加以论述。答：要检测酶的制剂是否达到纯的制剂（即不含杂质及杂质酶），可以有以下几种方法：（1） 层析法：包括纸层析、凝胶层析、柱层析及亲和层析（2） 电泳法：包括SDS凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（3） 超离心法：不同的酶分子大小不同，在重力场中具有不同的沉降系数，从而可以通过超离心方法分离目的酶与杂质酶。（4） 免疫反应法：由于酶分子可作为一种抗原物质，而抗原与抗体之间具有专一的亲和力，故可选用目的酶的抗体与酶制剂进行免疫扩散或免疫电泳，从而判断酶的制剂是否纯净。（5） 氨基酸序列分析法：采用特定的化学物质从酶的N末端将氨基酸残基逐个水解下来，最终可获知该酶的氨基酸序列，从而也可以判断出酶制剂是否纯净。发酵工程部分一、名词解释：诱变育种：诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。自然选育：自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离，自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。初级代谢产物和次级代谢产物：初级代谢产物是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来,产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，三高峰几乎同时出现。二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。生理性酸性物质和生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的营养物叫生理酸性物质，若菌体代谢后能产生碱性物质的营养物称为生理碱性物质。固态发酵：固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。二、填空题1. 常用的物理诱变剂有（紫外线）、（x射线）、（射线）、等离子、快中子、射线、射线、超声波等。2. 常用的化学诱变剂有（碱基类似物）、（烷化剂）、羟胺、吖定类化合物等。3. 发酵培养基中常用碳源包括（糖类）、（油脂）、（有机酸）、（低碳醇）。4. 根据微生物在培养过程对氧的需要状况可将发酵过程分为（厌氧）发酵和（好氧）发酵 两类。5. 发酵工程中常用的微生物包括（细菌）、（霉菌）和（酵母菌）三大类。6. 发酵的操作方式包括（间歇发酵）、（连续发酵）和（补料发酵）。三、简答题1. 工业化菌种的要求是什么？答：1. 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物2. 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强3. 遗传性能要相对稳定4. 不易感染它种微生物或噬菌体5. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）6. 生产特性要符合工艺要求2. 什么是培养基？发酵工程中培养基的要求是什么？答：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一